Name: Visualizzazione e Live Imaging del Oligodendrocyte organelli in fettine di cervello Organotypic utilizzando Virus Adeno-associati e microscopia confocale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Scopri la visualizzazione dei mitocondri degli oligodendrociti in fettine cerebrali organotipiche utilizzando vettori virali AAV e imaging time-lapse. Questo metodo consente di studiare la dinamica cellulare in un modello che preserva l'architettura del tessuto cerebrale.

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Ringraziamo Linda Hildegard Bergersen e Magnar Bjørås per l'accesso alla cella laboratorio e attrezzature, personale Janelia biologia molecolare ha condiviso la risorsa per la produzione di virus e plasmide e Koen Vervaeke per assistenza con le misure di potenza del laser. Questo lavoro è stato finanziato dall'associazione salute norvegese, Norwegian Research Council e l'apparecchiatura di microscopia è stato finanziato da Norbrain.

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</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Il protocollo per la fabbricazione di colture organotipiche descritti qui è una versione modificata18 del protocollo descritto da De Simoni e Yu (2006)5. Le modifiche più importanti sono state delineate di seguito. Tampone Tris è aggiunto al terreno di coltura, che migliora la sopravvivenza delle fette quando di fuori dell'incubatore durante la trasduzione virale e dalla sostituzione della medium delle cellule. La procedura di sterilizzazione per confetti è anche cambiata. ...

Materia bianca del cervello è composto di cellule nervose assoni avvolti nella mielina, una membrana di plasma estesa specializzata formata da oligodendrociti. Mielina è necessaria per la propagazione del potenziale d'azione veloce e affidabile e sopravvivenza a lungo termine degli assoni myelinated e una perdita di mielina può causare disfunzione neurologica. Nonostante la loro importanza, le proprietà degli oligodendrociti sono meno conosciuti rispetto con i neuroni e astrociti. Di conseguenza, meno strumenti sono stati sviluppati per lo studio di oligodendrociti.
Live imaging di organelli cellulari come i mitocondri, reticolo endoplasmatico (ER) o diverse strutture vescicolari possono essere utile per studiare i cambiamenti dinamici negli organelli nel corso del tempo. Tradizionalmente, formazione immagine degli oligodendrociti vivente è stata eseguita in monocolture1,2. Tuttavia, oligodendrociti in monocoltura non visualizzare compatta mielina e organotipiche o fettine di cervello acuto possono, quindi, essere un'opzione migliore quando si studia la localizzazione e il movimento degli organelli. Localizzazione di piccoli organelli e proteine nella guaina mielinica può essere difficile a causa della breve distanza tra l'assone myelinated e la guaina di mielina circostante. Così, le procedure di luce immunostaining microscopica da solo non avere la risoluzione spaziale di discriminare tra quelli nell'assone myelinated e organelli nella guaina mielinica. Questo può essere risolto attraverso la trasduzione virale con geni per le proteine fluorescenti targeting organello guidate dai promotori specifici del tipo di cella. I vantaggi sono un'espressione di cellula-specifico e rada, che consente una valutazione accurata della localizzazione dell'organello e dinamiche. Animali transgenici è utilizzabile anche per realizzare tale un organello targeting cellula-specifico espressione3. Tuttavia, la produzione e la manutenzione di animali transgenici è costosi e di solito non offrono l'espressione sparsa che possa essere raggiunti dai metodi virale.
Il metodo descritto qui utilizza trasduzione virale degli oligodendrociti con proteine fluorescenti targeting mitocondriale (dsred o verde proteina fluorescente, GFP) guidato dal promotore di proteina basica della mielina (MBP-mito-dsred o MBP-mito-GFP) per visualizzare mitocondri del oligodendrocyte nelle fette del cervello organotipiche. Inoltre, espressione di un'altra proteina fluorescente nel citoplasma (GFP utilizzato insieme a mito-dsred o tdtomato utilizzato con mito-GFP) viene utilizzato per abilitare la visualizzazione della morfologia delle cellule, compresi i comparti citoplasmatici della guaina mielinica. Il protocollo comprende la procedura per effettuare organotipiche fette del cervello (una versione modificata del protocollo descritto da De Simoni e Yu, 20064,5). Descriviamo quindi la procedura di imaging time-lapse per studiare il movimento mitocondriale. Questa procedura utilizza un microscopio confocale verticale con uno scambio continuo di imaging medio, un'installazione che consente la facile applicazione di farmaci o altri cambiamenti medi durante la formazione immagine. La procedura di imaging time-lapse può essere eseguita su qualsiasi microscopio confocale, con alcune attrezzature supplementari per il mantenimento della vita fette come descritto di seguito. Il protocollo contiene anche alcuni suggerimenti per ottimizzare la formazione immagine e ridurre la fototossicità.
Infine, è descritto un modo semplice e veloce per visualizzare mielina non macchia da microscopia Confocal di riflessione (CoRe). Questo può essere utile per identificare la guaina mielinica durante la formazione immagine dal vivo. Negli ultimi anni, diverse tecniche sono state sviluppate alla mielina immagine senza alcuna colorazione necessaria, ma la maggior parte di questi richiedono specifiche attrezzature e competenze6,7,8. La procedura qui descritta utilizza le proprietà riflettenti della guaina mielinica ed è una versione semplificata di singolo-eccitazione lunghezza d'onda di microscopia Confocal di riflessione spettrale (Punteggio, in cui diverse lunghezze d'onda del laser è combinato per visualizzare mielina) 9. coRe può essere fatto su qualsiasi microscopio confocale che dispone di un laser a 488 nm e un filtro di emissione di 470-500 nm passa-banda o un filtro di emissione sintonizzabile.

<table><tbody><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 19G</td><td>BD</td><td>301500</td><td>Aghi utilizzati per l'ingresso e l'uscita del bagno</td></tr><tr><td>Biossido di gas</td><td>AGA</td><td>105701</td><td></td></tr><tr><td>Lampadine per pipette di marca</td><td>Sigma-Aldrich Z615927</td><td></td><td>Lampadine per pipette</td></tr><tr><td>Bruciatore Bunsen (bruciatore a propano liquido)</td><td>VWR</td><td>89038-530</td><td></td></tr><tr><td>Cavo assemblato per controller del riscaldatore</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0106&nbsp;</td><td>Regolatore di temperatura - parte termometro</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fluka</td><td>21100</td><td></td></tr><tr><td>CO2&nbsp;</td><td>AGA</td><td>100309</td><td>CO2 per</td></tr><tr><td>incubatore Vetro di copertura, quadrato Corning</td><td>Thermo&nbsp; Fischer Scientific</td><td>13206778</td><td>Da collegare sotto il bagno per l'imaging dal vivo. Sigillare con colla o vaselina.</td></tr><tr><td>D-(+)-glucosio</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>pinza delicata</td><td>Finescience</td><td>11063-07</td><td>Per la dissezione</td></tr><tr><td>Penna a graffio a diamante</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>54463</td><td></td></tr><tr><td>Pipette monouso in vetro Pasteur 230 mm</td><td>VWR</td><td>612-1702</td><td>Pipette in vetro Lama</td></tr><tr><td>di rasoio in acciaio inossidabile a doppio bordo</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>#7200</td><td>Lama di rasoio per vibratomo</td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS)</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>24010-043</td><td></td></tr><tr><td>Cerchi di carta da filtro</td><td>Schleicher & Schuell</td><td>300.220</td><td>Carta da filtro utilizzata per la filtrazione di PFA</td></tr><tr><td>Fun tack</td><td>Loctite</td><td>1270884</td><td>Utilizzare per collegare / regolare la posizione degli ingressi e delle uscite nel bagno</td></tr><tr><td>Asciugamano C-Fold 2</td><td>Katrin</td><td>344388</td><td></td></tr><tr><td>Harp, piatto per camera RC-41,</td> <td>Warner Instruments</td><td>&nbsp; 64-1418</td><td>Arpa per tenere giù i coriandoli nel bagno. Tagliare i fili prima dell'uso con fette organotipiche. 1,5 mm, 13 mm, SHD-41/15</td></tr><tr><td>HEPES, FW: 260,3</td><td>Sigma</td><td>H-7006</td><td></td></tr><tr><td>Holten LaminAir, modello 1.2</td><td>Heto-Holten</td><td>96004000M</td><td>Cappa a flusso laminare</td></tr><tr><td>Siero di cavallo, inattivato a caldo</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Membrana LCR, PTFE,&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>FHLC0130</td><td>Confetti&nbsp;</td></tr><tr><td>Leica VT1200</td><td>Leica</td><td>14048142065</td><td>Vibratomo</td></tr><tr><td>MEM-Glutamax con HEPES</td><td>Thermo&nbsp; Fischer Scientific</td><td>42360024</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>R.P. Normapur</td><td>25 108.295</td><td></td></tr><tr><td>Micro Spoon Heyman Tipo B</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>62411-B</td><td>Piccola spatola arrotondata con estremità affilata per dissezione</td></tr><tr><td>Unità filtrante Millex-GP</td><td>SLGPM33RA Millipore</td><td></td><td>Unità filtrante per siringa</td></tr><tr><td>Inserto per colture cellulari Millicell, 30 mm</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td>Inserti per colture cellulari</td></tr><tr><td>Modulo di controllo a 3 velocità Minipuls</td><td>GILSON</td><td>F155001</td><td>Pompa peristaltica per imaging dal vivo - Parte del modulo di controllo (collegare alla testa a due cannel)</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fluka</td><td>71628</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta Surface</td><td>Thermo&nbsp; Fischer Scientific 140675</td><td></td><td>Piastra di coltura</td></tr><tr><td>Sospensione di nistatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1638</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>441452-9900-000&nbsp;</td><td>Obiettivo ad immersione in acqua utilizzato per l'imaging dal vivo. (WD=2,5 mm), VIS-IR</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>291-1211</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide, microscopia elettronica granulare</td><td>Sciences</td><td>#19208</td><td></td></tr><tr><td>Camera di perfusione PC-R</td><td>SiSkiYou</td><td>&nbsp; 15280000E</td><td>Bagno per imaging dal vivo</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina, liquido</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri 140 mm&nbsp;</td><td>Heger</td><td>1075</td><td>Capsula di Petri grande&nbsp;</td></tr><tr><td>Piastra Petri 92x16 mm&nbsp;</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>82.1473</td><td>Piastra di Petri media&nbsp;</td></tr><tr><td>Petridish 55x14,2 mm</td><td>VWR</td><td>391-0868</td><td>Piastra di Petri piccola</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td>PBS compresse</td></tr><tr><td>R2 Testina a due canali&nbsp;</td><td>GILSON</td><td>F117800</td><td>Pompa peristaltica per l'imaging dal vivo - Parte della testa a due canali (richiede modulo di controllo)</td></tr><tr><td>Spatole rotonde/piatte, acciaio inossidabile</td><td>VWR</td><td>82027-528</td><td>Spatola grande per la dissezione</td></tr><tr><td>Carta vetrata</td><td>VWR</td><td>MMMA63119</td><td>Opzionale, per levigare pipette di vetro rotte</td></tr><tr><td>Forbici,&nbsp; 17,5 cm</td><td>Finescience</td><td>14130-17</td><td>Forbici grandi per la dissezione</td></tr><tr><td>Forbici, 8,5&nbsp;</td><td>Finescience</td><td>14084-08</td><td>Forbici piccole e affilate per la dissezione</td></tr><tr><td>Lama singola per gemma</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>#71972</td><td>Lama di rasoio a lama</td></tr><tr><td>singola Riscaldatore per soluzione in linea singola SH-27B</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td>Regolatore di temperatura - parte riscaldante</td></tr><tr><td>Unità filtrante Steritop-GP, 500 ml, filtro</td><td>SCGPT05RE</td><td>millipore</td> da 45 mm <td>per sterilizzare soluzioni</td></tr><tr><td>Super colla di precisione</td><td>Loctite</td><td>1577386</td><td></td></tr><tr><td>Lama per bisturi chirurgico n. 22</td><td>Swann Morton Ltd.</td><td>209</td><td>Lama di bisturi arrotondata</td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura TC324B</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0100</td><td>Regolatore di temperatura per imaging dal vivo (richiede riscaldatore soluzione e assemblaggio cavi)</td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trizma HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice con rivestimento d'acqua serie II</td><td>Forma Scientific</td><td>78653-2882</td><td>Incubatrice</td></tr></tbody></table>

visualizzazione e live imaging del oligodendrocyte organelli in fettine di cervello organotypic utilizzando virus adeno-associati e microscopia confocale

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

I neuroni si basano sull'isolamento elettrico e supporto trofico dei oligodendrocytes myelinating. Nonostante l'importanza degli oligodendrociti, gli strumenti avanzati attualmente usati per studiare i neuroni, sono state prese solo parzialmente dai ricercatori del oligodendrocyte. Cella tipo-specifica colorazione di trasduzione virale è un approccio utile per studiare la dinamica dell'organello dal vivo. Questo articolo descrive un protocollo per la visualizzazione di mitocondri del oligodendrocyte nelle fette del cervello organotipiche di trasduzione con virus adeno-associato (AAV) portatori di geni per le proteine fluorescenti mirate mitocondriale sotto il controllo trascrizionale del il promotore di proteina basica della mielina. Esso comprende il protocollo per rendere organotipiche fette di cervello del topo coronale. Una procedura per time-lapse imaging dei mitocondri quindi segue. Questi metodi possono essere trasferiti ad altri organelli e possono essere particolarmente utili per lo studio di organelli nella guaina mielinica. Infine, descriviamo una tecnica prontamente disponibile per la visualizzazione della mielina non macchia in fette di vita da microscopia Confocal di riflessione (CoRe). CoRe non richiede nessun equipaggiamento supplementare e può essere utile per identificare la guaina mielinica durante la formazione immagine dal vivo.

Fettine di cervello organotipiche che sono state coltivate e trasdotte come sopra descritto ha mostrato una distribuzione sparsa di oligodendrociti corticali esprimendo mito_dsred e GFP. Immunostaining con gli anticorpi contro Olig2 e MBP ha confermato che l'espressione era specifico per gli oligodendrociti (Figura 1).
Per l'imaging in vivo, gli oligodendrociti trasdotte sono stati riconosciuti dall...

I oligodendrocytes myelinating promuovono la propagazione del potenziale d'azione rapida e la sopravvivenza neuronale. È descritto qui un protocollo per l'espressione del oligodendrocyte-specific di proteine fluorescenti in organotipiche fette del cervello con formazione immagine successiva di time-lapse. Inoltre, una procedura semplice per la visualizzazione non macchia mielina è presentata.

Visualizzazione e Live Imaging del Oligodendrocyte organelli in fettine di cervello Organotypic utilizzando Virus Adeno-associati e microscopia confocale

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

L'obiettivo generale di questa trasduzione virale e della registrazione in time-lapse è visualizzare il movimento dei mitocondri degli oligodendrociti in fette cerebrali organotipiche. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo degli oligodendrociti, ad esempio in che modo gli oligodendrociti e i loro organelli rispondono ai cambiamenti nell'ambiente locale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce informazioni dettagliate sulla struttura degli oligodendrociti e sulla dinamica degli organelli in un preparato in cui tutte le diverse cellule cerebrali sono presenti e gli oligodendrociti producono mielina compatta. Trasduci gli oligodendrociti nelle colture di fette al settimo giorno in vitro. Preleva innanzitutto 1,3 microlitri di AAV diluito per ogni fetta. Assicurandoti che l'esterno della punta della pipetta sia asciutto, tieni la pipetta sopra la corteccia il più vicino possibile senza toccare la fetta con la punta e spingi lentamente la soluzione fuori dalla pipetta. Quando la soluzione tocca la fetta, sposta la punta della pipetta sulla corteccia per distribuire la soluzione su tutta l'area corticale. Una volta trasdotte tutte le fet

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Qui vi presentiamo l'iniezione intracranica di vettori AAV per la marcatura fluorescente di neuroni e glia nella corteccia visiva.

Iniezione intracranica di adeno-associato vettori virali

Questo protocollo descrive un saggio organotipica fetta ottimizzato per il cervello postnatale e ad alta risoluzione time-lapse imaging di migrazione neuroblasti nel flusso migratorio rostrale.

Un saggio Slice organotipica per High-Resolution Time-Lapse Imaging della migrazione neuronale nel cervello postnatale

Fonte: Kennedy, L. H., et. al. Visualizzazione e imaging dal vivo di organelli di oligodendrociti in fette di cervello organotipiche utilizzando virus adeno-associati e microscopia confocale. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra l'imaging dei mitocondri degli oligodendrociti in fette di cervello di topo organotipiche. La fetta viene posta all'interno di una camera a bagno con circolazione continua del fluido e temperatura controllata. Dopo aver impostato vari parametri del microscopio...

Imaging confocale del movimento mitocondriale all'interno di oligodendrociti in colture organotipiche di fette cerebrali

Fonte: Moye, S. L., et.al.  Visualizzazione della morfologia degli astrociti utilizzando la ionoforesi gialla di Lucifero. J. Vis. Exp. (2019).  Questo video dimostra l'uso della ionoforesi con colorante fluorescente per studiare la morfologia degli astrociti in fette di cervello fisse. Descrive in dettaglio la perforazione del soma degli astrociti con un elettrodo per rilasciare un colorante anionico e idrofilo nel citoplasma sotto una corrente a bassa tensione, consentendo al colorante di...

Visualizzazione della morfologia degli astrociti utilizzando la ionoforesi con colorante fluorescente in una fetta di cervello di topo fissa

Viene descritta una tecnica per studiare le cellule NG2 e gli oligodendrociti utilizzando un sistema di coltura a fette del proencefalo e del cervelletto.  Questo metodo consente di esaminare le dinamiche di proliferazione e differenziazione delle cellule all'interno della linea degli oligodendrociti, dove l'ambiente extracellulare può essere facilmente manipolato mantenendo la citoarchitettura tissutale.

Culture Organotipica Slice per studiare Oligodendrocyte Dynamics e mielinizzazione

Per affrontare i meccanismi di demielinizzazione e apoptosi neuronale nelle lesioni corticali dei disturbi demielinizzanti infiammatori, vengono utilizzati diversi modelli animali. Qui descriviamo un approccio ex vivo utilizzando cellule T CD8+ specifiche per gli oligodendrociti su fette di cervello, con conseguente morte oligodendrogliale e neuronale. Vengono discusse le potenziali applicazioni e i limiti del modello.

Un Ex vivo Modello di un attacco T-Cell Oligodendrocyte-diretto nel acute cervello fette

Presentato qui è un metodo di tubo rullo modificate per la coltura e fette di imaging ad alta risoluzione intermittente del cervello del roditore sopra molte settimane con riposizionamento preciso sulle lamelle di fotoincisioni. Vitalità neuronale e fetta morfologia sono ben tenute. Vengono fornite applicazioni di questo sistema completamente chiusa usando i virus per espressione specifica del tipo di cella.

Metodo del tubo rullo modificate per Imaging intermittente precisamente localizzata e ripetitivi durante la coltura a lungo termine delle fette di cervello in un sistema chiuso

Descriviamo un protocollo per l'espressione specifica del tipo di cellula del sensore basato su FRET codificato geneticamente ATeam1.03YEMK nelle colture di sezioni organotipiche del prosencefalo del topo. Inoltre, mostriamo come utilizzare questo sensore per l'imaging dinamico dei livelli di ATP cellulare in neuroni e astrociti.

Imaging di ATP intracellulare in fette di tessuto organicino del cervello del topo utilizzando il sensore basato su FRET ATeam1.03YEMK

Qui, presentiamo un metodo per studiare la morfogenesi dei neuriti negli espianti retinici postnatali di topo mediante microscopia confocale time-lapse. Descriviamo un approccio per l'etichettatura sparsa e l'acquisizione di tipi di cellule retiniche e dei loro processi fini utilizzando vettori virali adeno-associati ricombinanti che esprimono proteine fluorescenti mirate alla membrana in modo Cre-dipendente.

Imaging time-lapse dell'arborizzazione neuronale utilizzando l'etichettatura del virus adeno-associato sparso di popolazioni di cellule retiniche geneticamente mirate

Qui, descriviamo un protocollo che combina l'iniezione di virus adeno-associato con l'impianto di finestre craniche per l'imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale nei topi svegli.

Imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale in topi svegli

Scopri la visualizzazione dei mitocondri degli oligodendrociti in fettine cerebrali organotipiche utilizzando vettori virali AAV e imaging time-lapse. Questo metodo consente di studiare la dinamica cellulare in un modello che preserva l'architettura del tessuto cerebrale.

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