Stabilimento di larvale Zebrafish come modello animale per indagare Trypanosoma cruzi motilità In Vivo

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di stabilire il pesce zebra come modello in vivo per studiare la motilità di Trypanosoma cruzi. Il Trypanosoma cruzi è il parassita che causa la malattia di Chagas. Si tratta di una malattia tropicale trascurata che si trasmette principalmente tramite vettore in America Latina e in alcune regioni degli Stati Uniti.

Il parassita viene trasmesso all'uomo dalle feci vettrici, che contengono la parte infettiva, per poi replicarsi nelle cellule ospiti. Il movimento dei flagelli consente al parassita di viaggiare nel corpo. Ma è anche essenziale per l'attaccamento nell'invasione cellulare.

I modelli di infezione in vivo con Trypanosoma cruzi sono principalmente nei roditori. Il lavoro insegna l'opacità complica seguire il parassita all'interno dell'animale. La motilità del parassita finora è stata studiata solo in vitro, pertanto, un modello in vivo permetterebbe di comprendere l'aspetto chiave del movimento del parassita in condizioni di flusso.

Alla ricerca di un modello alternativo, abbiamo trovato le larve di pesce zebra. Le larve di zebrafish sono un potente modello per studiare le interazioni tra l'ospite e i patogeni in vivo. Sono piccoli, economici e molto facili da allevare rispetto ai topi.

Molto importante per il nostro studio è che il loro sistema immunitario è molto simile a quello umano. Il loro sistema immunitario adattativo non inizia a svilupparsi fino a quattro giorni dopo la fecondazione e matura fino a quattro settimane dopo, quindi questo ci dà una finestra molto ampia per lavorare senza l'interferenza immunitaria. Tuttavia, il più grande vantaggio del pesce zebra per il nostro studio è la sua trasparenza ottica.

Questo lo rende un modello ideale per lo screening microscopico e l'imaging. Questo, in combinazione con tutte le tecniche per manipolare geneticamente i pesci, e tutte le linee transgeniche e mutanti disponibili, dà davvero molte possibilità da studiare. In questo video mostreremo come una larva mutante della linea Casper, che è completamente trasparente perché priva di pigmentazione, può essere utilizzata per visualizzare i parassiti T.cruzi in vivo.

Per visualizzare l'interno di questi pesci zebra, utilizziamo la microscopia a fluorescenza a foglio luminoso. La microscopia a florescenza a foglio luminoso è una famiglia di tecniche in cui si illumina solo il piano focale dell'obiettivo di rilevamento. La conseguenza di ciò è che non c'è luce in primo piano o sullo sfondo, e questo rende le immagini belle e nitide, anche in profondità all'interno dei tuoi embrioni.

Poiché viene illuminata solo la parte del campione che ti interessa, hai molti meno danni fotografici del tuo campione e questo ti consente di girare video per lunghi periodi di tempo. Qui, visualizziamo i parassiti T.cruzi vivi all'interno delle larve di zebrafish. La natura del foglio luminoso ci permette di realizzare video ad alta velocità con una buona risoluzione spaziale e temporale, rispetto ai microscopi confocali.

Per quanto ne sappiamo, i tripanosomi vivi non sono mai stati visualizzati all'interno di un organismo vivo. Tre giorni prima delle iniezioni, organizzare accoppiamenti con coppie sane di pesci maschio e femmina, o con un maschio e due femmine in vasche di riproduzione per aumentare la produzione totale di uova. Seguendo il protocollo di testo, raccogli le uova deposte usando un piccolo colino.

Lavare le uova capovolgendo il colino e versando l'acqua delle uova attraverso il colino in una capsula di Petri. Per mantenere gli embrioni sani, pulisci la loro acqua rimuovendo eventuali detriti o uova non fecondate con una pipetta di plastica di trasferimento. Successivamente, metti gli embrioni in un'incubatrice a 28 gradi Celsius e ripeti la procedura di pulizia ogni tre ore per scartare le uova inviabili e mantenere la covata sana.

A 48 ore o due giorni dopo la fecondazione, controlla che la maggior parte degli embrioni si sia schiusa. Tuttavia, se necessario, dechorionate gli embrioni sotto lo stereoscopio afferrando le estremità opposte del corion con due pinze affilate e tirando delicatamente da un'estremità per aprirlo. Utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere il corion dall'acqua.

Per l'iniezione, preparare prima aghi da un millimetro utilizzando capillari di vetro a parete sottile e un dispositivo polare per micropipette. Conservare gli aghi sigillati in una capsula di Petri su una striscia di argilla da modellare. Per realizzare lo stampo per microiniezione, preparare una soluzione di agarosio all'1,5% in acqua distillata e versarla in una capsula di Petri.

Quindi posizionare uno stampo prefabbricato per microiniezione larvale sull'agarosio e lasciarlo solidificare completamente a temperatura ambiente su una superficie piana. Sollevare lo stampo a microiniezione e aggiungere acqua per la conservazione a quattro gradi Celsius. In questo modo si evita che l'agarosio si secchi.

Preparare la soluzione anestetizzante aggiungendo acqua d'uovo al volume appropriato di stock di Tricaina per ottenere una concentrazione finale di 150 milligrammi per litro. Conservare la soluzione a quattro gradi Celsius. Infine, preparare una scorta di agarosio a basso punto di fusione per l'imaging sciogliendo la polvere di agarosio a basso punto di fusione in acqua d'uovo fino a una concentrazione finale dell'1%Riscaldare la miscela fino a quando la soluzione di agarosio appare omogenea e conservare le aliquote a quattro gradi in provette di reazione da 1,5 millilitri.

I parassiti sono ottenuti da un isolato di Trypanosoma cruzi 01/DA e sono coltivati in una linea cellulare di astrocitoma umano, integrata con terreni completi utilizzando fiasche T25. Dopo tre o quattro giorni di coltura, i parassiti fuoriescono dalle cellule e i tripomastigoti possono essere raccolti dal surnatante. Centrifugare questo surnatante per cinque minuti e risospendere delicatamente il pellet in 1X PBS con siero fetale di vitello.

Quindi centrifugare per cinque minuti, scartare il surnatante e risospendere in un millilitro di PBS. Assumere 10 microlitri per contare i parassiti che nuotano liberamente in una camera Neubauer. Prendi il resto dei parassiti risospesi e aggiungi un microlitro di CFSE e incuba per 10 minuti a temperatura ambiente.

Quindi, aggiungi PBS per completare 10 millilitri. Centrifugare per cinque minuti, scartare il surnatante e risospendere il pellet contenente i parassiti marcati in 100 microlitri di PBS. Dopo questa procedura di etichettatura, è importante verificare che i parassiti siano vivi e correttamente etichettati mediante visualizzazione diretta dei parassiti su un microscopio a florescenza invertita.

Nella modalità a luce trasmessa, verificare che i parassiti si muovano. Nella modalità di fioritura, utilizzare il filtro feet-see per valutare l'etichettatura dei parassiti. Per prima cosa caricare l'ago di vetro sigillato con 10 microlitri della soluzione contenente i parassiti utilizzando un puntale per pipetta microloader.

Quindi, inserire l'ago di vetro nel supporto dell'ago del micromanipolatore. Sotto lo stereoscopio, tagliare circa cinque millimetri dalla punta dell'ago usando una pinza sottile. Successivamente, anestetizzare la larva 48 ore dopo la fecondazione in una soluzione di tricaina fino a quando non rispondono al tatto.

Posizionare la larva nella piastra di agarosio in posizione laterale sotto lo stereoscopio. Regolare il micromanipolatore in modo che la punta dell'ago si trovi al centro del tuorlo della larva. Impostare i parametri del microiniettore.

Iniettare il pesce nella valle della circolazione sanguigna del tuorlo. Controlla che il cuore batta e trasferisci immediatamente la larva in acqua fresca d'uovo per il recupero. Trasferisci l'embrione iniettato in una capsula di Petri vuota e rimuovi con cura l'acqua circostante con una pipetta di plastica e carta assorbente.

Aggiungere immediatamente circa 100 microlitri di agarosio preriscaldato all'1% a basso punto di fusione per coprire l'embrione. Assicurati che l'agarosio non superi i 40 gradi Celsius. Inserire un filo dritto all'interno di un capillare di vetro e utilizzarlo come stantuffo per sollevare l'embrione in posizione verticale.

Questo dovrebbe essere fatto rapidamente prima che l'agarosio si solidifichi. Mentre assorbi l'agarosio, assicurati di lasciare un po' di agarosio sopra l'embrione e attendi che si solidifichi. Se necessario, spingere fuori l'agarosio in eccesso sotto l'embrione e tagliarlo.

Riempire la camera del campione con una soluzione di tricaina e impostare la temperatura della camera del campione a 28 gradi Celsius. Successivamente, inserire il capillare contenente l'embrione nel portacampione del microscopio e posizionarlo nello stadio di micromanipolatore. Spingere fuori l'estremità contenente l'embrione finché non pende liberamente.

Nella modalità a luce trasmessa, posizionare il campione davanti alla pupilla dell'obiettivo di rilevamento utilizzando un sistema di micromanipolatore XYZ e uno stadio di rotazione per ruotarlo attorno all'asse verticale. È utile mettere a fuoco prima un bordo del capillare, quindi spostarsi per trovare l'embrione e le strutture di interesse, come il cuore o il sistema vascolare. Ora utilizzando un laser a 488 nanometri o con lunghezza d'onda simile, passa alla modalità fluorescente e regola l'intensità dell'illuminazione e il tempo di esposizione per ridurre lo sbiancamento delle foto e ottimizzare la risoluzione temporale.

Per questo, è necessario scegliere un obiettivo con una buona apertura numerica. Avvia l'acquisizione video della regione di interesse. Nel nostro caso, i parassiti vengono osservati attaccati alle valvole e si muovono liberamente nell'area del cuore.

Si consiglia di girare un video di un singolo piano nel tempo o di utilizzare il micromanipolatore o il sistema piezoelettrico e galvo per mettere a fuoco piani diversi e seguire il movimento del parassita. Al termine dell'acquisizione, rimuovere con cura l'embrione dall'agarosio utilizzando una pinza fine e uno strumento ad anello per capelli. Trasferire il pesce nell'acqua fresca dell'uovo e controllare il recupero per 15 minuti.

Quindi smaltire secondo i protocolli standard del proprio istituto. Per tutte le procedure qui presentate, sono stati utilizzati embrioni 48 ore dopo la fecondazione. Diversi siti anatomici potrebbero essere utilizzati per inoculare il parassita, tuttavia, la valle della circolazione sanguigna del sacco vitellino o dotto di Cuvier è la regione più veloce e più facile da iniettare e accedere al sistema cardiovascolare.

Entro 8-10 minuti dall'iniezione di Trypanosoma cruzi nel dotto di Cuvier, i parassiti si osservano nel sistema cardiovascolare in via di sviluppo. Alcuni parassiti rimangono attaccati alle pareti del sacco vitellino embrionale o a strutture cardiache come la valvola atrioventricolare. I parassiti sono visti oscillare con contrazioni cardiache, il che dimostra il loro efficace meccanismo di aderenza.

Inoltre, i parassiti sono visti andare alla deriva con il flusso sanguigno nella stessa direzione degli eritrociti nello spazio pericardico e nei vasi sanguigni. Il metodo che abbiamo sviluppato consente l'osservazione in vivo dei parassiti T.cruzi all'interno di larve trasparenti di zebrafish. Questo può essere molto utile per visualizzare e analizzare le dinamiche di un agente patogeno, come la motilità attraverso il sangue e le strutture cardiache in un organismo vertebrato vivo.

È importante mantenere breve il tempo tra l'iniezione e la visualizzazione per visualizzare il parassita che nuota libero. È inoltre fondamentale ottimizzare i parametri di acquisizione durante l'utilizzo del microscopio a foglio ottico per ridurre i danni alle foto e ottenere comunque immagini di buona qualità. La microiniezione di T.cruzi nelle larve di pesce zebra è una tecnica efficace per inoculare il parassita nel flusso sanguigno.

In questo metodo, hai visto l'etichettatura CFC del parassita come una procedura pratica che consente una chiara visualizzazione del parassita all'interno del pesce. L'iniezione nel dotto di Cuvier è un modo delicato per garantire che i parassiti passino attraverso la circolazione. T.cruzi tende ad aderire alle valvole del cuore e ai grandi vasi del pesce.

Ma secondo i nostri esperimenti, non c'è infezione cellulare. Sono necessari ulteriori studi per chiarire il suo tro-pez-ee.