Name: Stato fondamentale lo svuotamento super-resolution Imaging in cellule di mammifero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-05T08:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Scopri la microscopia GSD per visualizzare e quantificare proteine di membrana in cellule di mammifero con risoluzione superiore a quella diffrazionale. Questo metodo migliora di dieci volte la risoluzione rispetto alla microscopia convenzionale.

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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione AHA a r.e.d. (15SDG25560035). Gli autori si desidera ringraziare Dr. Fernando Santana per l'uso del suo microscopio 3D Leica SR GSD e Dr. Johannes Hell per gentilmente fornire l'anticorpo FP1.

<ol><li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+structured-illumination+microscopy%3A+wide-field+fluorescence+imaging+with+theoretically+unlimited+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hell, S. W., Kroug, M. <a target="_blank" href="http://www3.mpibpc.mpg.de/groups/hell/publications/pdf/Appl._Phys._B._60_495_497.pdf">Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit.</a> JAppl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).</li>
<li>Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+barrier+in+fluorescence+microscopy+by+optical+shelving%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving.</a> Phys Rev Lett. 98 (21), 218103(2007).</li>
<li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptional+profiling+of+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes.</a> J Vis Exp. (58), e3302(2011).</li>
<li>Davare, M. A., Horne, M. C., Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A+is+associated+with+class+C+L-type+calcium+channels+%28Cav1.2%29+and+antagonizes+channel+phosphorylation+by+cAMP-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A is associated with class C L-type calcium channels (Cav1.2) and antagonizes channel phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase.</a> J Biol Chem. 275 (50), 39710-39717 (2000).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
<li>Chozinski, T. J., Gagnon, L. A., Vaughan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twinkle%2C+twinkle+little+star%3A+photoswitchable+fluorophores+for+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Twinkle, twinkle little star: photoswitchable fluorophores for super-resolution imaging.</a> FEBS Lett. 588 (19), 3603-3612 (2014).</li>
<li>Dempsey, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja904588g">Photoswitching mechanism of cyanine dyes.</a> J Am Chem Soc. 131 (51), 18192-18193 (2009).</li>
<li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Imaging+Conditions+for+Demanding+Multi-Color+Super+Resolution+Localization+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), e0158884(2016).</li>
<li>Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ThunderSTORM%3A+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li>
<li>Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy-based+relative+localization+analysis+%28STORM-RLA%29+for+quantitative+nanoscale+assessment+of+spatial+protein+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).</li>
<li>Ries, J., Kaplan, C., Platonova, E., Eghlidi, H., Ewers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+versatile+method+for+GFP-based+super-resolution+microscopy+via+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple, versatile method for GFP-based super-resolution microscopy via nanobodies.</a> Nat Methods. 9 (6), 582-584 (2012).</li>
<li>Dixon, R. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4360655/">Graded Ca2+/calmodulin-dependent coupling of voltage-gated CaV1.2 channels.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).</li>
<li>Nan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+superresolution+imaging+allows+quantitative+analysis+of+RAF+multimer+formation+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18519-18524 (2013).</li>
<li>Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One%2C+two+or+three%3F+Probing+the+stoichiometry+of+membrane+proteins+by+single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy.</a> Sci Rep. 5, 14072(2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno concorrenti interessi di divulgare.

La recente esplosione di tecnologie che permettono la formazione immagine oltre il limite di diffrazione hanno offerto nuove finestre nella complessità della cellula di mammiferi segnalazione nello spazio e nel tempo. Queste tecnologie includono tempesta, STED, PALM, GSD, SIM e le loro varianti (ad es., dSTORM, FPALM). L'ingegnosità degli scienziati dietro queste tecniche ha permesso di eludere i limiti imposti dalle leggi della fisica che regolano la diffrazione della luce. Nonostante questo risultato enorme, o...

Le reazioni cellulari di segnalazione traducono cambiando ambienti interni ed esterni per avviare una risposta cellulare. Esse regolano tutti gli aspetti della fisiologia umana, che serve da base per l'ormone e rilascio di neurotrasmettitori, il battito cardiaco, visione, fertilizzazione e funzione conoscitiva. Rottura di queste cascate di segnalazione può avere gravi conseguenze sotto forma di condizioni patologiche tra cui cancro, morbo di Parkinson e di Alzheimer. Per decenni, gli investigatori biologici e medici sono utilizzati con successo le proteine fluorescenti, sonde e biosensori accoppiati con microscopia di fluorescenza come i principali strumenti per comprendere l'organizzazione spaziale e temporale preciso di questi cellulari segnali.
I punti di forza di tecniche ottiche quali epifluorescenza, confocale, o microscopia a fluorescenza (TIRF) riflessione interna totale sono loro sensibilità, velocità e compatibilità con live cell imaging, mentre la maggiore limitazione è loro diffrazione limitata risoluzione, strutture di significato o complessi di proteine inferiori a 200-250 nm non possono essere risolto. Con lo sviluppo teorico e pratico di deterministico super-risoluzione (per esempio, microscopia di svuotamento stimolato dell'emissione (STED1), strutturato microscopia di illuminazione (SIM2) o stocastici super-risoluzione (ad es. , deplezione di fotoattivazione localizzazione microscopia (PALM3), o stato fondamentale (GSD4,5)), risoluzione assiale e laterale in microscopia a fluorescenza è stata estesa oltre la barriera di diffrazione, all'ordine di decine di nanometri. Così, gli investigatori hanno ora la possibilità senza precedenti per visualizzare e comprendere come organizzazione e dinamica di proteine si traduce in funzione al livello vicino-molecolare.
Microscopia di svuotamento di stato fondamentale seguita da ritorno di singola molecola (GSDIM), o semplicemente GSD come è noto, aggira il limite di diffrazione riducendo il numero di emettere simultaneamente fluorofori4,5. Luce laser ad alta energia è usata per eccitare l'esempio fluorophore-etichettati, bombardando gli elettroni con fotoni e aumentando la probabilità saranno sottoposte a un 'spin-flip' e inserire il tripletto o 'buio-stato' stato eccitato4. Questo impoverisce efficacemente lo stato di terra, da qui il nome «suolo lo svuotamento dello stato». In stato di tripletto, fluorofori non emettono fotoni e il campione appare dimmer. Tuttavia, questi fluorofori casualmente ritorno allo stato di terra e possono passare attraverso diversi fotoni che emettono le transizioni di stato eccitato a terra prima di ritornare allo stato di tripletto. Con meno fluorofori che emettono in un dato momento, fotone scoppi emessa da singoli fluorophores diventare spazialmente e temporalmente distinte dai vicini fluorofori. La raffica di fotoni possa essere in forma con una funzione gaussiana, il centroide calcolato che corrisponde alla posizione del fluoroforo con una precisione di localizzazione che dipenda l'apertura numerica (NA) della lente, la lunghezza d'onda della luce utilizzata per eccitazione e fondamentalmente, il numero di fotoni emessi al fluoroforo. Una limitazione di GSD è che, poiché solo un sottoinsieme dei fluorofori emette attivamente in qualsiasi momento, migliaia di immagini dovrà essere raccolti nel corso di alcuni minuti per costruire una mappa di localizzazione completa. Il tempo di acquisizione lungo combinato con il requisito di laser ad alta potenza, significa che la GSD è più adatto a piuttosto che campioni dal vivo.
Questo articolo descrive la preparazione di campioni fissati per formazione immagine di microscopia di Super-risoluzione della membrana e del reticolo endoplasmatico (ER)-proteine residenti (per un elenco dei materiali di consumo necessari e reagenti Vedi Tabella materiali). Esempi di come questo protocollo può essere facilmente adattato per quantificare la dimensione e il grado di clustering di L-tipo scanalature tensione-gated Ca2 + (Cav1.2) nel sarcolemma dei miociti cardiaci, o usato per prevedere la distribuzione cellulare dell'ER, sono dimostrati. Comprendere la distribuzione e l'organizzazione di questi componenti cellulari è criticamente importante per capire l'iniziazione, traduzione e, infine, la funzione di molte Ca2 +-cascate di segnalazione dipendente. Ad esempio, Cav1.2 canali sono fondamentalmente importante per accoppiamento, mentre il ricevitore-mediata Ca2 + rilascio dall'ER è forse la più onnipresente cascata di segnalazione in cellule di mammifero eccitazione-contrazione.

<table><tbody><tr><td>KOH</td><td>Thermo Scientific</td><td>P250-500</td><td>Per pulire il vetro di copertura</td></tr><tr><td>#1.5 vetro di copertura 18 x 18 mm</td><td>Marienfeld Superior</td><td>0107032)</td><td>Per crescere/elaborare/visualizzare le cellule</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>BP3994</td><td>Diluire a 1x con acqua deionizzata</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td>Aiuta con l'adesione delle cellule per coprire</td></tr> la <tr><td>laminina</td> <td>di vetroSigma</td><td>114956-81-9</td><td>Ausili con adesione cellulare al vetro di copertura</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Thermo Scientific</td><td>11150-059</td><td>Terreni di coltura di miociti ventricolari</td></tr><tr><td>DMEM 11995</td><td>Gibco</td><td>11995</td><td>Terreni di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>10437028</td><td>Integratore di terreni</td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>Media integratore</td></tr><tr><td>0,05% tripsina-EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-CL</td><td>Soluzione per colture cellulari</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Reagente di trasfezione transitoria</td></tr><tr><td>Ca2+-free PBS</td><td>Gibco</td><td>1419-144</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>100 % Metanolo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A414-4</td><td>Fissazione cellulare</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Elettrone Microscopia Scienze</td><td>15710</td><td>Fissazione cellulare</td></tr><tr><td>Glutaraldeide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLBR6504V</td><td>Fissazione cellulare</td></tr><tr><td>SEAblock</td><td>Thermo Scientific</td><td>37527</td><td>BSA o altre alternative di soluzione bloccante esistono</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Detergente per permeabilizzare le cellule</td></tr><tr><td>Coniglio anti-CaV1.2 (FP1)</td><td>Regalo</td><td>N/A</td><td>Esistono anticorpi anti-CaV1.2 commerciali come Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003)</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-RFP</td><td>Rockland Inc.</td><td>200-301-379</td><td>Anticorpo primario</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 donket anti-coniglio IgG (H+L)</td><td>Invitrogen (Thermo Scientific)</td><td>A31573</td><td>Anticorpo secondario</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 capra anti-topo IgG (H+L)</td><td>Invitrogen (Thermo Scientific)</td><td>A11031</td><td>Anticorpo secondario</td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>Previene la crescita microbica per la conservazione a lungo termine dei campioni</td></tr><tr><td>Catalasi</td><td>Sigma</td><td>C40</td><td>Ingrediente tampone fotocommutante</td></tr><tr><td>Glucosio ossidasi</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>Ingrediente tampone fotocommutante</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td>Ingrediente tampone fotocommutante</td></tr><tr><td>beta-Mercaptoetilammina cloridrato</td><td>Fisher</td><td>BP2664100</td><td>Ingrediente tampone fotocommutante</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>63689</td><td>Ingrediente tampone fotocommutante</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td>Componente tampone fotocommutante</td></tr><tr><td>Destrosio</td><td>Fisher</td><td>D14-212</td><td>Componente tampone fotocommutante</td></tr><tr><td>Vetrini a depressione</td><td>Neolab</td><td>1 &ndash; 6293</td><td>Per montare campioni</td></tr><tr><td>Twinsil</td><td>Picodent</td><td>13001000</td><td>Per sigillare il vetro coprioggetto</td></tr><tr><td>sec61&beta;- mCherry plasmid</td><td>Addgene</td><td>49155</td><td></td></tr><tr><td>Leica SR GSD Microscopio 3D</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di blocco</td><td></td><td></td> di lavaggio <td>20 % in PBS</td></tr><tr><td>Soluzione di incubazione</td><td></td><td></td> di anticorpi primari <td>0,5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS</td></tr><tr><td>Soluzione</td><td></td><td></td> <td>di incubazione di anticorpi secondari1:1000 in PBS</td></tr></tbody></table>

stato fondamentale lo svuotamento super-resolution imaging in cellule di mammifero

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Gli avanzamenti nella biologia delle cellule e microscopia fluorescente sono intimamente correlati, con l'avanzata capacità di visualizzare eventi cellulari causando spesso drammatici salti nella nostra comprensione di come le cellule funzione. Lo sviluppo e la disponibilità della microscopia di Super-risoluzione ha notevolmente ampliato i limiti di risoluzione ottica da ~ 250-20 nm. I biologi non sono più limitati a descrivere le interazioni molecolari in termini di colocalizzazione all'interno di una zona di diffrazione limitata, piuttosto è ora possibile visualizzare le interazioni dinamiche delle singole molecole. Qui, descriviamo un protocollo per la visualizzazione e la quantificazione delle proteine cellulari da microscopia di svuotamento di stato fondamentale per l'imaging cellulare fisso. Forniamo esempi da due proteine di membrana diversi, un elemento del Traslocone il reticolo endoplasmatico, sec61β e un membrana plasmatica localizzato tensione-gated L-tipo Ca2 + canale (CaV1.2). Vengono descritti il microscopio specifici parametri, metodi di fissazione, foto-commutazione formulazione di buffer e insidie e sfide di elaborazione delle immagini.

Come documentato nell'introduzione, ci sono molti microscopia di Super-risoluzione diverse modalità di formazione immagine. Questo protocollo, si concentra su formazione immagine di Super-risoluzione GSD. Immagini rappresentative e mappe di localizzazione sono mostrate in Figura 2 e Figura 3.
La figura 2 Mostra delle cellule COS-7 transfett...

Questo articolo descrive un protocollo per l'individuazione di uno o più del plasma e/o proteine di membrana intracellulare mediante microscopia ad alta super-risoluzione stato fondamentale lo svuotamento (GSD) in cellule di mammifero. Andremo a discutere i vantaggi e le considerazioni di utilizzare tali approcci per la visualizzazione e la quantificazione delle proteine cellulari.

Stato fondamentale lo svuotamento super-resolution Imaging in cellule di mammifero

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

L'obiettivo generale di questa tecnica di imaging fluorescente è quello di visualizzare e quantificare le proteine cellulari in cellule fissate con una risoluzione subdiffrazione utilizzando una forma di microscopia a super-risoluzione chiamata microscopia di esaurimento dello stato fondamentale e ritorno di singole molecole. Questo metodo aiuta a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia cellulare e della biofisica delle membrane, poiché supera il limite di risoluzione dovuto alla diffrazione, consentendo ai ricercatori di definire, visualizzare e quantificare con maggiore precisione la distribuzione delle proteine cellulari. Il principale vantaggio di questo protocollo è che permette l'acquisizione di immagini con un miglioramento della risoluzione di circa dieci volte rispetto agli approcci convenzionali di microscopia fluorescente, come la microscopia confocale.La procedura sarà dimostrata da Oscar Vivas, un ricercatore post-dottorato nel mio laboratorio, e da Karen Hannigan, un ricercatore post-dottorato nel laboratorio di Rose Dixon. Per iniziare, preparare le lamelle e le cellule come descritto nel protocollo testuale allegato. Quindi fissare i campioni ed eseguire l'immunocitochimica al fine di etichettare la membrana plasmatica e/o le proteine di membrana intracellulari di interesse.Successivamente, preparare la soluzione tampone priva di ossigeno aggiungendo prima 12,5 microlitri di una soluzione madre di catalasi, 3,5 milligrammi di glucosio ossidasi e 0,5 microlitri di Tris uno molare a 49,5 microlitri di PBS in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Chiudere il tubo e vorticare brevemente per sciogliere i componenti. Quindi centrifugare la soluzione per tre minuti.Ora, preparare la soluzione induttore di commutazione fotochimica aggiungendo beta-mercaptoetilammina in PBS fino a una concentrazione di 100 millimolare e modificando il pH a 8,0. Aliquotare e conservare la soluzione tiale nel congelatore per un massimo di una settimana. Immediatamente prima dell'acquisizione delle immagini, mescolare insieme la soluzione tiale e i componenti scavenger di ossigeno con un tampone salino e conservare la soluzione sul ghiaccio.Utilizzando 100 microlitri del buffer di commutazione foto già preparato, montare i cover slip contenenti le cellule colorate su vetrini portaoggetto con cavità. Successivamente, sigillare i bordi del cover slip con una colla di silicone per prevenire l'ossidazione rapida del buffer di acquisizione. Attendere alcuni minuti finché la colla di silicone non si sarà completamente polimerizzata, prima di procedere all'acquisizione delle immagini.Altrimenti, il coprioggetto si sposterà. Per iniziare, selezionare un laser appropriato per illuminare il campione, in base al fluorocromo scelto. Per un fluorocromo Alexa 647, utilizzare un laser da 642 nanometri.Successivamente, scegliere il cubo ottico dicromatico e l'obiettivo appropriati. Aprire il software di acquisizione. Selezionare la modalità di acquisizione 2D, quindi impostare il tempo di esposizione a 11 millisecondi.Inoltre, impostare il guadagno EM a 300 e selezionare una soglia di rilevamento appropriata. Successivamente, attivare il controllo automatico degli eventi e impostare il numero di eventi per immagine a otto. Inserire la dimensione del pixel pari a 20 nanometri.Nella scheda GSD Tools, andare alle opzioni di calcolo dell'immagine ad alta risoluzione e assicurarsi che sia selezionata la modalità Istogramma. Per acquisire immagini di proteine alla membrana plasmatica, selezionare la modalità TIRF e modificare l'angolo di incidenza per determinare la profondità di penetrazione. Successivamente, impostare l'intensità del laser al 100% per inviare gli elettroni nello stato scuro.Successivamente, selezionare Rilevamento di Singola Molecola durante la pompa e impostare l'acquisizione automatica quando la correlazione tra i fotogrammi è 0,20. Per l'acquisizione, impostare l'intensità del laser al 50% e il numero di fotogrammi di acquisizione a 60.000. Quindi iniziare a scattare le immagini.Per quantificare le dimensioni degli aggregati proteici, aprire il file immagine di una mappa di localizzazione di singole molecole con istogramma di 10 nanometri in ImageJ. Nel menu Immagine, andare su Regola e utilizzare l'opzione Auto per ottimizzare luminosità e contrasto dell'immagine. Successivamente, nel menu Tipo, selezionare 8 bit.Successivamente, aprire il menu Analizza, fare clic su Imposta scala e inserire i valori mostrati qui. Quindi, nel menu Analizza, selezionare Imposta misurazioni e spuntare la casella accanto all'opzione Area. Tornare nel menu Immagine, selezionare Aggiusta, Soglia e quindi selezionare Sopra/Sotto.Spostare il valore massimo a 255, il valore minimo a uno e fare clic su Applica. Infine, aprire il menu Analizza e selezionare Analizza particelle. Selezionare le opzioni Unità in pixel, Mostra risultati e Riassunto.Quindi impostare la dimensione da quattro all'infinito, selezionare l'opzione Contorni semplici e fare clic su OK. La cellula qui immaginata è stata trasfettata con la proteina del reticolo endoplasmatico, mCherry-Sec61 beta, ed è stata immaginata utilizzando sia la microscopia TIRF a risoluzione non superiore al limite di diffrazione sia la microscopia GSD a super-risoluzione in modalità TIRF. Queste curve rappresentano il diametro dei tubuli del reticolo endoplasmatico. L'immagine a destra mostra un miglioramento nella risoluzione laterale e rappresenta una rappresentazione più accurata della struttura dei tubuli del reticolo endoplasmatico.Il miglioramento della risoluzione offerto dall'immagine super-risoluzione GSD è ulteriormente dimostrato in queste immagini, che mostrano un cardiomiocita marcato con un anticorpo anti-CAV 1.2. Utilizzando la modalità GSD, il miglioramento della risoluzione laterale è evidente e i singoli gruppi di canali sono più facili da identificare. Una volta padroneggiato, questo protocollo può essere completato in meno di tre giorni.L'acquisizione di immagini a super-risoluzione di una singola cellula richiede da 10 a 30 minuti, a seconda del numero di fotogrammi necessari. Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come la microscopia elettronica, al fine di rispondere ad ulteriori domande, ad esempio su come la proteina fluorescente di interesse interagisce con l'ambiente cellulare complesso. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare, acquisire e analizzare campioni per visualizzare una o più proteine cellulari mediante microscopia a super-risoluzione, utilizzando il metodo di esaurimento dello stato fondamentale seguito dal ritorno di singole molecole.

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Descriviamo un super-risoluzione metodo di imaging per sondare l'organizzazione strutturale del batterica FtsZ-ring, un apparecchio essenziale per la divisione cellulare. Questo metodo si basa su analisi quantitative di fotoattivati ​​localizzazione microscopia (PALM) immagini e può essere applicata ad altre proteine ​​batteriche citoscheletro.

Super-risoluzione Imaging della Divisione Macchine batterica

Le informazioni spazio-temporali sulle proteine dinamiche all'interno delle cellule vive sono fondamentali per comprendere la biologia. Un tipo di microscopia a super-risoluzione chiamata microscopia ad illuminazione strutturata in 3D veloce (f3D-SIM) rivela informazioni uniche sull'anello Z citocinetico nei batteri: sia il suo aspetto simile a una perlina che la rapida dinamica di FtsZ all'interno dell'anello.

Super-Resolution Imaging del Cytokinetic Z Anello in batteri vivi Uso di Fast 3D Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Descriviamo qui una combinazione della tecnica del doppio strato lipidico supportato da vetro per formare sinapsi immunologiche con la tecnica di imaging a super-risoluzione della microscopia STED (Stimulated Emission Depletion). L'obiettivo di questo protocollo è fornire agli utenti le istruzioni necessarie per eseguire con successo queste due tecniche.

Super-Resolution Imaging di cellule Natural Killer immunologica Sinapsi su un vetro supportato Planar doppio strato lipidico

PI (4,5) P2 regola diverse funzioni cellulari, ma la sua organizzazione su scala nanometrica nella membrana plasmatica delle cellule è poco conosciuta. Etichettando PI (4,5) P2 con una sonda fluorescente a due colori fusa al dominio Pleckstrin omologia, si descrive un nuovo approccio per studiare il PI (4,5) P2 distribuzione spaziale nella membrana plasmatica su scala nanometrica .

Singolo-molecola di Super-Resolution Imaging di fosfatidilinositolo 4,5-bifosfato nella membrana plasmatica con il romanzo fluorescenti Sonde

I coniugati BODIPY convenzionali possono essere utilizzati per la microscopia per la localizzazione a singola molecola a cellule vive (SMLM) attraverso lo sfruttamento dei loro dimeri di stato del suolo con formazione transitoria e spostata verso il rosso. Vi presentiamo un protocollo SMLM ottimizzato per tracciare e risolvere i lipidi neutri subcellulari e gli acidi grassi nelle cellule viventi di mammiferi e lieviti alla scala nanoscopica della lunghezza.

Convenzionale BODIPY Coniugato per la microscopia a super-risoluzione a celle vive e il tracciamento a singola molecola

Presentato qui è un protocollo per l'imaging a cellule vive a super-risoluzione nel tessuto intatto. Abbiamo standardizzato le condizioni per l'imaging di una popolazione di cellule staminali adulte altamente sensibile nel suo ambiente di tessuti nativi. Questa tecnica prevede il bilanciamento della risoluzione temporale e spaziale per consentire l'osservazione diretta dei fenomeni biologici nei tessuti vivi.

Imaging di cellule vive super-risoluzione di strutture subcellulari

La membrana basale è essenziale per la morfogenesi dei tessuti e degli organi durante lo sviluppo. Per comprendere meglio i meccanismi che portano al corretto posizionamento di questa struttura, il protocollo presentato descrive i metodi per visualizzare e caratterizzare il traffico intracellulare e la secrezione di proteine della membrana basale nelle cellule epiteliali utilizzando la microscopia confocale e super-risoluzione.

Imaging confocale e a super-risoluzione del traffico intracellulare polarizzato e della secrezione di proteine della membrana basale durante l'oogenesi della drosophila

La microscopia a super-risoluzione può fornire una visione dettagliata dell'organizzazione dei componenti all'interno del complesso sinaptonemale nella meiosi. Qui, dimostriamo un protocollo per risolvere le singole proteine del complesso sinaptonemale Caenorhabditis elegans .

Microscopia a super-risoluzione del complesso sinaptonemale all'interno della linea germinale di Caenorhabditis elegans

Questo articolo fornisce un protocollo semplice e chiaro per marcare gli effettori secreti da Salmonella utilizzando l'espansione del codice genetico (GCE) in modo specifico per il sito e visualizzare la localizzazione subcellulare delle proteine secrete nelle cellule HeLa utilizzando la microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM)...

Imaging a super-risoluzione di proteine secrete da batteri utilizzando l'espansione del codice genetico

Questo protocollo delinea la procedura per eseguire la microscopia di localizzazione a singola molecola profonda e intera cellula (SMLM) utilizzando un microscopio confocale a disco rotante con riassegnazione ottica dei fotoni, consentendo così l'imaging DNA-PAINT senza la necessità di ottica personalizzata o illuminazione complessa.

Imaging a superrisoluzione di cellule intere tramite DNA-PAINT su un disco confocale rotante con riassegnazione ottica dei fotoni

Questo protocollo dettaglia le applicazioni avanzate di imaging e la gestione delle risorse condivise di un sistema di microscopio confocale a scansione laser integrato con un rivelatore a matrice multiplexata per imaging cellulare e subcellulare ad alta risoluzione. Il flusso di lavoro consente imaging multimodale da confocale a super-risoluzione (~120 nm) all'interno di un'unica piattaforma, rendendo la visualizzazione su scala nanometrica più accessibile.

Imaging a superrisoluzione e gestione condivisa: un protocollo per la microscopia confocale con rilevamento multiplex

Scopri la microscopia GSD per visualizzare e quantificare proteine di membrana in cellule di mammifero con risoluzione superiore a quella diffrazionale. Questo metodo migliora di dieci volte la risoluzione rispetto alla microscopia convenzionale.

Stato fondamentale lo svuotamento super-resolution Imaging in cellule di mammifero

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