Stato fondamentale lo svuotamento super-resolution Imaging in cellule di mammifero

Questo articolo descrive un protocollo per l'individuazione di uno o più del plasma e/o proteine di membrana intracellulare mediante microscopia ad alta super-risoluzione stato fondamentale lo svuotamento (GSD) in cellule di mammifero. Andremo a discutere i vantaggi e le considerazioni di utilizzare tali approcci per la visualizzazione e la quantificazione delle proteine cellulari.

L'obiettivo generale di questa tecnica di imaging fluorescente è quello di visualizzare e quantificare le proteine cellulari in cellule fissate a risoluzione limitata dalla subdiffrazione utilizzando una forma di microscopia a super-risoluzione chiamata microscopia a deplezione dello stato fondamentale e ritorno di singole molecole. Questo metodo aiuta a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare e della biofisica delle membrane, in quanto elude la risoluzione limitata dalla diffrazione, che aiuta i ricercatori a definire, visualizzare e quantificare in modo più preciso la distribuzione delle proteine cellulari. Il vantaggio principale di questo protocollo è che consente l'acquisizione di immagini con un miglioramento della risoluzione di circa dieci volte rispetto agli approcci convenzionali di imaging con microscopia a fluorescenza, come la microscopia confocale.

A dimostrare la procedura saranno Oscar Vivas, un post-doc nel mio laboratorio, e Karen Hannigan, un post-doc nel laboratorio di Rose Dixon. Per iniziare, preparare i vetrini coprioggetto e le celle come descritto nel protocollo di testo allegato. Quindi fissare i campioni ed eseguire l'immunocitochimica al fine di marcare le proteine della membrana plasmatica e/o della membrana intracellulare di interesse.

Successivamente, preparare la soluzione Glock per l'eliminazione dell'ossigeno aggiungendo prima 12,5 microlitri di una soluzione madre di catalasi, 3,5 milligrammi di glucosio ossidasi e 0,5 microlitri di Tris molare a 49,5 microlitri di PBS in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Chiudere il tubo e agitarlo brevemente per sciogliere i componenti. Quindi centrifugare la soluzione per tre minuti.

Ora, preparare la soluzione tiale che induce la fotocommutazione sciogliendo la soluzione di beta-mercaptoetilammina in PBS a una concentrazione di 100 millimolari e modificare il pH a 8,0. Aliquotare e conservare la soluzione tial nel congelatore per un massimo di una settimana. Immediatamente prima dell'imaging, mescolare i componenti tiali e di evacuazione dell'ossigeno insieme a un tampone salino e conservare la soluzione su ghiaccio.

Utilizzando 100 microlitri del tampone di commutazione fotografica preparato, montare i vetrini coprioggetto contenenti cellule colorate sui vetrini di depressione. Quindi, sigillare i bordi del vetrino coprioggetto con una colla siliconica per evitare una rapida ossidazione del tampone di imaging. Attendere alcuni minuti fino a quando la colla siliconica non si è completamente indurita, prima dell'imaging.

In caso contrario, il vetrino coprioggetto si sposterà. Per iniziare, selezionare un laser appropriato per illuminare il campione, in base al fluoroforo scelto. Per un fluoroforo Alexa 647, usa un laser a 642 nanometri.

Quindi, scegliere il cubo di imaging dicroico e l'obiettivo appropriati. Aprire il software di imaging. Selezionare la modalità di acquisizione 2D, quindi impostare il tempo di esposizione su 11 millisecondi.

Inoltre, impostare il guadagno EM su 300 e selezionare una soglia di rilevamento appropriata. Quindi, attiva il controllo automatico degli eventi e imposta il numero di eventi per immagine su otto. Immettere la dimensione dei pixel come 20 nanometri.

Nella scheda Strumenti GSD, vai alle opzioni di calcolo dell'immagine ad alta risoluzione e assicurati che sia selezionata l'opzione Modalità istogramma. Per visualizzare le proteine sulla membrana plasmatica, selezionare la modalità TIRF e modificare l'angolo di incidenza per determinare la profondità di penetrazione. Quindi, impostare l'intensità del laser al 100% per inviare elettroni allo stato buio.

Quindi, selezionare Rilevamento singola molecola durante l'estrazione e impostare l'acquisizione automatica quando la correlazione dei fotogrammi è 0,20. Per l'acquisizione, impostare l'intensità del laser su 50% e il numero di fotogrammi di acquisizione su 60.000. Quindi inizia a scattare immagini.

Per quantificare la dimensione del cluster proteico, aprire il file immagine di una mappa di localizzazione di una singola molecola con istogramma a 10 nanometri in ImageJ. Nel menu Immagine, vai su Regola e usa l'opzione Auto per ottimizzare la luminosità e il contrasto dell'immagine. Quindi, nel menu Tipo, scegliere 8 bit.

Quindi, apri il menu Analizza, fai clic su Imposta scala e inserisci i valori mostrati qui. Quindi, nel menu Analizza, selezionare Imposta misure e selezionare la casella accanto all'opzione Area. Torna al menu Immagine, seleziona Regola, Soglia, quindi seleziona Sopra/Sotto.

Spostare il valore massimo a 255, il valore minimo a uno e fare clic su Applica. Infine, apri il menu Analizza e seleziona Analizza particelle. Metti un segno di spunta per selezionare Unità pixel, Visualizza risultati e Riepiloga.

Quindi imposta la dimensione su quattro all'infinito, seleziona l'opzione Contorni nudi e fai clic su OK. La cellula qui ripresa è stata trasfettata con la proteina del reticolo endoplasmatico, mCherry-Sec61 beta, e ripresa utilizzando sia la microscopia TIRF a defrazione limitata che la microscopia GSD a super-risoluzione in modalità TIRF. Queste curve rappresentano il diametro dei tubuli del reticolo endoplasmatico. L'immagine a destra mostra un miglioramento della risoluzione laterale e rappresenta una rappresentazione più accurata della struttura dei tubuli ER.

Il miglioramento della risoluzione offerto dall'imaging GSD a super-risoluzione è ulteriormente dimostrato in queste immagini, che mostrano un miocita cardiaco marcato con un anticorpo anti-CAV 1.2. Utilizzando la modalità GSD, il miglioramento della risoluzione laterale è evidente e i cluster separati di canali sono più facili da identificare. Una volta padroneggiato, questo protocollo può essere completato in meno di tre giorni.

L'imaging a super-risoluzione di una singola cellula richiede da 10 a 30 minuti, a seconda del numero di fotogrammi richiesti. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'elettromicroscopia per rispondere a domande di addizione, come il modo in cui la proteina fluorescente di interesse interagisce con il complesso ambiente cellulare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare, acquisire e analizzare i campioni per visualizzare una o più proteine cellulari per la microscopia a super-risoluzione utilizzando la deplezione dello stato fondamentale seguita dal ritorno delle singole molecole.