Preparazione del campione per l'analisi di Endopeptidomic in liquido cerebrospinale umano
4 dicembre 2017
Viene presentato un metodo per analisi spettrometria totale di peptidi endogeni in umana del liquido cerebrospinale (CSF). Impiegando la filtrazione di cut-off di peso molecolare, cromatografica pre-frazionamento, analisi spettrometria totale e una successiva combinazione di strategie di identificazione del peptide, è stato possibile ampliare il noto peptidome di CSF quasi dieci volte rispetto per gli studi precedenti.
L'obiettivo di questo protocollo è quello di preparare e analizzare campioni di liquido cerebrospinale umano per l'analisi LC-MS dei peptidi endogeni. Una fase di pre-frazionamento dei peptidi prima della LC-MS aumenta il numero di peptidi identificati e consente il rilevamento di peptidi CSF ad abbondanza relativamente bassa. I peptidi endogeni nel liquido cerebrospinale sono molecole di calcio che non sono state ampiamente esplorate e possono potenzialmente includere nuovi importanti biomarcatori di malattie neurodegenerative. Questo metodo consente un'ampia caratterizzazione del peptidoma del liquido cerebrospinale mediante spettrometria di massa. I principali vantaggi di questo metodo sono che consente l'iniezione di peptidi CSF a bassa abbondanza ed è compatibile con le tecniche di marcatura isobarica multiplex, rendendolo applicabile per studi clinici. Finora abbiamo applicato questo metodo principalmente all'analisi del liquido cerebrospinale. Ma abbiamo dati preliminari che indicano che, con piccole modifiche, può essere utilizzato anche per l'analisi di campioni di plasma e tessuti. Iniziare scongelando 1,5 millilitri di aliquote di liquido cerebrospinale a temperatura ambiente su miscelatore a rulli. Una volta scongelato, trasferire il contenuto in tubi di polipropilene da 10 millilitri. E aggiungi 80 microlitri di una TAB molare come agente tampone. Quindi aggiungere 0,65 millilitri di guanidinio cloridrato a otto molari per sciogliere gli aggregati proteici e agitare delicatamente a temperatura ambiente per 10 minuti. Successivamente, a 60 microlitri di TCEP acquoso da 200 millimolari, e incubare a 55
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo per l'analisi spettrometrica di massa di peptidi endogeni nel liquido cerebrospinale umano (CSF). Attraverso l'utilizzo di una filtrazione basata sul peso molecolare di cutoff, una pre-frazionamento cromatografico e un'analisi spettrometrica di massa, la ricerca amplia in modo significativo il peptidoma CSF noto, migliorando l'identificazione di peptidi a bassa abbondanza che potrebbero fungere da biomarcatori per disturbi neurodegenerativi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Spettrometria di Massa
- Scoperta di Biomarcatori
Sfondo
- I peptidi endogeni nel liquido cerebrospinale potrebbero avere un'importanza significativa nell'identificazione dei disturbi neurodegenerativi.
- I peptidi del liquido cerebrospinale a bassa abbondanza non sono stati studiati approfonditamente.
- I metodi esistenti hanno fornito dati limitati sul peptidoma del liquido cerebrospinale.
Scopo dello studio
- Migliorare l'identificazione e la caratterizzazione di peptidi endogeni nel liquor cefalorachidiano umano.
- Fornire una visione più completa del peptidoma del liquor cefalorachidiano.
- Esplorare il potenziale di nuovi biomarcatori nelle condizioni neurodegenerative.
Metodi Utilizzati
- Spettrometria di massa con pre-frazionamento dei campioni di liquido cerebrospinale.
- Comprende lo scongelamento e la lavorazione di aliquote di 1,5 millilitri di liquido cerebrospinale con reagenti specifici.
- Compatibile con tecniche di marcatura isobarica multiplex.
- Può essere adattata per l'analisi di campioni di plasma e tessuto con modifiche minori.
Risultati principali
- Il metodo consente il rilevamento di un numero significativamente maggiore di peptidi rispetto agli studi precedenti.
- I risultati principali indicano la presenza di peptidi a bassa abbondanza precedentemente inesplorati.
- Fornisce informazioni che potrebbero portare alla scoperta di nuovi biomarcatori.
Conclusioni
- Questo studio dimostra un approccio efficiente per caratterizzare il peptidoma del liquido cerebrospinale.
- La versatilità del metodo apre nuove strade per studi clinici sulle malattie neurodegenerative.
- Implicazioni potenziali per la comprensione dei meccanismi neuronali e l'identificazione di marcatori della malattia.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo migliora il rilevamento di peptidi endogeni a bassa abbondanza nel liquido cerebrospinale umano, un biofluido chiave per l'individuazione di biomarcatori delle malattie neurodegenerative. Riducendo la complessità proteica mediante frazionamento basato sul cutoff di peso molecolare (MWCO) e migliorando la copertura peptidica tramite pre-frazionamento con cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa a pH elevato (RP-HPLC), aumenta la sensibilità analitica negli sforzi di validazione degli obiettivi. L'approccio supporta la riduzione del rischio meccanicistico consentendo un profilo più approfondito del peptidoma, che può guidare la valutazione iniziale della fiducia nell'obiettivo e la selezione di biomarcatori predittivi nei programmi di scoperta di farmaci per il sistema nervoso centrale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi di popolazioni endogene di peptidi che riflettono i processi fisiopatologici del sistema nervoso centrale, supportando la verifica di ipotesi sui bersagli.
- Valore operativo: Riduce l'interferenza derivante dall'ampio intervallo dinamico delle proteine abbondanti nel liquor cefalorachidiano, migliorando il rilevamento di peptidi segnale a basso livello rilevanti per la modulazione delle vie metaboliche.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera profili riproducibili di frazionamento peptidico che consentono letture LC-MS/MS costanti per la standardizzazione dei saggi.
- Valore operativo: Compatibile con la marcatura isobarica multiplex, permettendo l'analisi comparativa del peptidoma tra coorti di malati e controlli nei flussi di lavoro per lo screening di biomarcatori.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita la scoperta di biomarcatori identificando peptidi derivati dal liquido cerebrospinale che potrebbero correlare con i meccanismi delle malattie neurodegenerative.
- Valore operativo: Adattabile a campioni di plasma e tessuti con modifiche minime, supportando la validazione incrociata nei percorsi traslazionali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, supportando l'esplorazione ipotetica del peptidoma prima delle fasi di identificazione del capostazione e di validazione preclinica.
- Biologia della Scoperta: Supporta il profiling senza pregiudizi di peptidi endogeni per chiarire i percorsi associati alle malattie e ridurre i rischi nella selezione degli obiettivi.
- Screening: Permette il rilevamento di peptidi ad alta affidabilità grazie alla riduzione della complessità del campione e a un miglioramento della separazione cromatografica.
- Analisi: Genera dati quantitativi sui peptidi risolti per frazionamento, compatibili con la multiplexing basata su marcatori per studi comparativi.
- Ricerca Translazionale: Fornisce le basi per l'allineamento di biomarcatori collegando le variazioni del peptidoma nel liquido cerebrospinale ai processi neurodegenerativi.
- Riutilizzo Aziendale: Il flusso di lavoro principale—filtrazione con taglio molecolare (MWCO), frazionamento a pH elevato e LC-MS—può essere standardizzato tra laboratori per analisi del peptidoma riproducibili.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta il rendimento dell'identificazione dei peptidi e consente il rilevamento di specie a bassa abbondanza che potrebbero fungere da indicatori meccanicistici o dello stato di malattia.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità attraverso una pre-frazionamento standardizzato e riduce la variabilità tecnica nell'analisi di biofluidi complessi.
- Valore strategico: Potenzia la sicurezza decisionale nella validazione degli obiettivi ampliando lo spazio biologico osservabile nel liquor cefalorachidiano.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei biomarcatori con rischio aggiustato grazie a una copertura più ampia del peptidoma e a un miglioramento nel rilevamento del segnale.
Considerazioni sull'implementazione
- È richiesta competenza nella manipolazione del liquor cerebrospinale, nell'inibizione delle proteasi e nella peptidomica basata sulla spettrometria di massa.
- Lo strumento deve includere sistemi LC-MS/MS in grado di effettuare frazionamento ad alta pH e rilevamento sensibile dei peptidi.
- La standardizzazione tra i diversi siti richiede una selezione coerente dei filtri con soglia molecolare (MWCO), la concatenazione del frazionamento e parametri di identificazione basati su software.
- L'adattamento al plasma o ai tessuti richiede l'ottimizzazione delle condizioni di lisi, deplezione e frazionamento per tenere conto della diversa complessità della matrice.
- I limiti pratici includono la possibile perdita di peptidi durante la filtrazione e la necessità di un rigoroso controllo delle contaminazioni a causa dell'analisi di bersagli a bassa abbondanza.
Domande frequenti sul biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Pre-treatment of Bulk Volume CSF without Quantification
2:24
Pre-treatment of Small Volume CSF Samples with Isobaric Labeling
4:00
MWCO Filtration, Desalting, and Sample Clean-up by Solid Phase Extraction
6:00
Offline High-pH Reverse Phase HPLC Sample Fractionation
7:09
LC-MS Analysis
7:47
Results: Peptide Identification After LC-MS Analysis
9:13
Conclusion
