Valutazione difetti di ostruzione delle vie urinarie Junction iniettando colorante blu di metilene

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare le ostruzioni delle giunzioni del tratto urinario tramite iniezione di colorante di metilene nei reni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo dei reni e del tratto urinario inferiore, come la connessione della vescica uretale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un metodo semplice per visualizzare la struttura del tratto urinario nel peggiore dei casi, consentendo l'analisi dello sviluppo del tratto urinario.

Per iniziare l'esperimento, misurare 0,1 grammi di polvere di blu di metilene. Sciogliere il blu di metilene in 10 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato 1x o PBS e agitare la miscela. Quindi filtrare la soluzione di blu di metilene da 10 milligrammi per millilitro con un filtro a siringa per eliminare l'intasamento durante l'iniezione.

Quindi assemblare un set sterile per le vene del cuoio capelluto con una siringa monouso da tre millilitri e riempire la siringa con tre millilitri di soluzione filtrata di blu di metilene. Pulire le forbici da dissezione e le pinze con etanolo al 70%. Per raccogliere embrioni perinatali a E18.5 o E19.5, prima sopprimere topi gravidi utilizzando l'inalazione di anidride carbonica.

Quindi eseguire la lussazione cervicale secondo le linee guida NIH. Successivamente, spruzzare etanolo al 70% sulla superficie addominale ventrale dell'animale. Quindi, utilizzando le forbici da dissezione sterili e le pinze, aprire la cavità addominale ventralmente.

Solleva l'intero utero e separalo dal corpo sulla punta delle corna uterine. Quindi sciacquare l'intero utero con 1x PBS in una capsula di Petri. Tagliare l'utero segmentalmente con le forbici da dissezione e rimuovere la decidua placentare con una pinza da dissezione per esporre gli embrioni e le sacche vitellino.

Rimuovere prima il sacco vitellino e poi rimuovere la membrana amniotica con una pinza da dissezione per liberare gli embrioni perinatali. Decapitare l'embrione con le forbici da dissezione. Fissare l'embrione con la superficie ventrale rivolta verso l'alto su un microscopio da dissezione dotato di una fotocamera digitale per l'imaging.

Raccogli la sua coda per la genotipizzazione. Usando una pinza, strappare con cura la pelle per aprire la cavità addominale dell'embrione. Quindi rimuovere con cura gli organi e i tessuti in eccesso come fegato, stomaco e intestino con una pinza tagliandoli o estraendoli per esporre i reni, gli ureteri e la vescica che si trovano dorsalmente.

Assorbire il sangue in eccesso dall'embrione sezionato con garze sterili, quindi continuare con l'iniezione di colorante. Rimuovere le bolle nell'ago e nel tubo espellendo la soluzione di blu di metilene dalla punta dell'ago mediante pressione idrostatica. Sollevare il siringo contenente la soluzione colorante oltre il livello della punta dell'ago per avviare il flusso.

E poi abbassare la siringa per fermare il flusso. Successivamente, inserire l'ago nella pelvi renale vicino all'uretere prossimale, facendo attenzione a non disturbarlo una volta posizionato. Eseguire l'iniezione di colorante in un rene per determinare l'ostruzione del tratto urinario.

Dopo l'inserimento di un ago nella pelvi renale, il successo di questo test deve essere inserito un ago nella pelvi renale verso l'uretere, senza passare attraverso il rene né verso il vaso sanguigno. Sollevare la siringa di circa 20 centimetri per fornire una pressione idrostatica e far fluire da 15 a 16 microlitri della soluzione colorante. Quindi monitorare il colore blu del colorante iniziando prima nella pelvi renale, poi nella lunghezza dell'uretere e infine nel lume della vescica.

Posizionare la siringa verso il basso per fermare il flusso di colorante e rimuovere l'ago dal rene. Registrare l'idronefrosi del rene, l'idrouretere e la posizione finale della soluzione colorante in un quaderno di laboratorio. Infine, eseguire l'iniezione del rene controlaterale e lasciare che il colorante fluisca per 20 secondi in totale.

Scattare immagini del rene, dell'uretere e della vescica tracciate con una soluzione colorante utilizzando la fotocamera e il programma di imaging collegato a uno stereomicroscopio. Dopo l'iniezione in un rene, il colorante blu di metilene fluisce dalla pelvi renale attraverso l'uretere e nella vescica, determinando un colore blu visibile nell'uretere e nel lume della vescica. Un blu più forte appare nel lume della vescica a causa di un flusso più lungo circa 20 secondi dopo l'iniezione di entrambi i reni con colorante che indica l'assenza di ostruzione della giunzione del tratto urinario nel secondo sistema urinario.

Quando si inietta un idrouretere dilatato in modo anomalo, la posizione finale della soluzione colorante non è chiara. E l'ostruzione della giunzione ureterovescicale o UVJO non può essere verificata nonostante l'assenza del colorante nel lume della vescica perché l'idrouretere anomalo è stato danneggiato nel mezzo. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di calcolare la sacca colorante degli embrioni perinatali per ottenere un sistema urinario intatto.

E rimuovere le bolle per non bloccare il flusso di colorante.