Live-imaging della migrazione delle cellule epiteliali della mammella dopo lo svuotamento transitorio di TIP60

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare gli effetti della deplezione di specifici geni di interesse sulla migrazione cellulare. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave nelle metastasi del cancro, come la migrazione delle cellule tumorali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di monitorare la migrazione cellulare dinamica in tempo reale.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta, quando stavamo osservando i cambiamenti della morfologia cellulare sul paziente di TIP60, un soppressore tumorale. Inizia seminando un milione di cellule epiteliali mammarie in tre millilitri di terreno di coltura per piatto da 10 centimetri. Aggiungere 20 minuti di miscela SRINA incubata a temperatura ambiente goccia a goccia alla coltura cellulare sperimentale.

Agitare manualmente entrambe le piastre per assicurarsi che le cellule siano distribuite uniformemente prima di metterle in un incubatore a 37 gradi Celsius. Dopo sei ore, sostituire i surnatanti con otto millilitri di terreno di coltura fresco per piastra e rimettere le colture nell'incubatore. La mattina successiva, sostituire i surnatanti con tre millilitri di terreno di coltura fresco per piastra e aggiungere un secondo cerotto di miscela SIRNA alla coltura cellulare sperimentale, come appena dimostrato, agitando la piastra per assicurarsi che i reagenti siano completamente miscelati prima di rimettere le cellule nell'incubatore.

Quindi sostituire i surnatanti con otto millilitri di terreno di coltura fresco dopo sei ore e incubare le colture durante la notte. Il terzo giorno, lavare le cellule una volta con due millilitri di BPS per piastra e staccare le cellule in entrambe le piastre con un millilitro di EDTA tripson per piastra per 20 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, interrompere la reazione con quattro millilitri di terreno di coltura completo per piastra.

Risospendere le cellule mediante pipettaggio e trasferire le sospensioni cellulari in provette individuali da 15 millilitri. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere i pellet in cinque millilitri di terreno privo di siero per provetta. Dopo il conteggio, diluire entrambe le colture cellulari a una concentrazione di 600.000 cellule per millilitro e aggiungere 500 microlitri di cellule da ciascuna coltura a un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti per garantire una confluenza del 100%.

Quando tutte le cellule sono state seminate, agitare delicatamente la piastra avanti e indietro e da un lato all'altro per garantire una distribuzione uniforme e posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari per 24 ore. Per verificare l'efficienza di knock down del gene di interesse, raccogliere le cellule rimanenti nelle provette di raccolta con un'altra centrifugazione e isolare l'RNA dai pellet, utilizzando un reagente commerciale secondo le istruzioni del produttore per la valutazione quantitativa della PCR in tempo reale. La mattina successiva, almeno un'ora prima di iniziare l'imaging delle cellule vive, accendere il microscopio e il controllo della temperatura.

Impostare la temperatura a 37 gradi Celsius e l'alimentazione di anidride carbonica al 5%Quando la camera ha raggiunto i 37 gradi Celsius, utilizzare la microscopia a contrasto di fase per confermare che le celle siano confluenti e completamente attaccate al fondo dei pozzetti. Quindi utilizzare un puntale per pipetta da 200 microlitri per graffiare delicatamente una linea retta su tutta la lunghezza del centro di ciascun pozzetto e lavare delicatamente tutti i pozzetti cinque volte con terreno privo di siero per rimuovere le cellule staccate. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere un millilitro di terreno privo di siero in ogni pozzetto.

Posizionare la piastra sul tavolino del microscopio sotto l'obiettivo di potenza 10 e dirigere la luce emessa verso gli oculari anziché verso la fotocamera. Regola manualmente la messa a fuoco per individuare ogni ferita e le cellule circostanti. Quindi restituire la luce emessa alla telecamera e utilizzare un sistema di osservazione delle cellule vive per contrassegnare la posizione delle ferite e impostare le condizioni temporali.

Acquisire l'immagine delle cellule per il periodo di esperimento appropriato, quindi aprire il primo video avi nel software di imaging appropriato e aprire il plug-in m track j. Fare clic sulla scheda Aggiungi per aggiungere una traccia per le singole celle e scegliere una cella sulla punta del fronte invasivo e una cella che può migrare da sola. Segui il movimento delle cellule scelte nel video utilizzando mtrackJ per tracciare il loro traffico.

Quindi fare clic sulla scheda di misurazione per misurare la distanza del movimento della cella e salvare i video con le tracce in formato avi. Dopo la deplezione di TIP60, le cellule epiteliali mammarie sono più mesenchimali rispetto alle cellule in coltura di controllo. Infatti, l'espressione di TIP60, così come l'espressione della molecola di adesione delle cellule epiteliali, diminuisce significativamente dopo il trattamento con siTIP60.

D'altra parte, l'espressione di specifici geni driver di transizione da epiteliale a mesenchimale è aumentata in seguito alla deplezione di TIP60. L'imaging dal vivo delle colture cellulari dopo la somministrazione della ferita dimostra una migrazione cellulare più rapida delle cellule trattate con siTIP60, rispetto alle colture siControl, con un aumento significativo della percentuale di cellule migranti osservate in risposta alla deplezione di TIP60. Inoltre, le cellule siControl si muovono come un foglio, mentre si osserva un maggiore movimento di singole cellule all'interno delle colture siTIP60.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare una tecnica di imaging di cellule vive per monitorare i cambiamenti dinamici della migrazione cellulare.