Attivazione delle cellule di Glia di Müller in una degenerazione retinica indotta da Laser e un modello di rigenerazione in Zebrafish

L'obiettivo generale di questo video è mostrare come monitorare in vivo i cambiamenti cellulari a seguito di un danno retinico focale indotto da laser nel Zebrafish. Questo modello può aiutare a rispondere a domande fondamentali sulla rigenerazione retinica, come i cambiamenti morfologici, la cinetica e i tipi cellulari coinvolti. Il principale vantaggio di questa tecnica è che, inducendo una lesione focale, i processi biologici possono essere studiati direttamente nel sito della lesione.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla rigenerazione della retina del pesce zebra, può anche essere applicato per studiare il meccanismo di riparazione in diversi modelli animali. Preparare una soluzione madre di anestetico sciogliendo 400 milligrammi di polvere di tricaina in 97,9 millimetri di acqua del serbatoio e 2,1 millimetri di TBS uno molare. Regolare il pH a 7,0 utilizzando tris uno molare a pH 9.

Per preparare la soluzione di lavoro, diluire la soluzione madre di tricaina 1 a 25 in acqua per acquario e trasferire 50 millilitri in una piastra di Petri. Successivamente, immergere il Pesce Zebra nella soluzione anestetica per due-cinque minuti, fino a quando non diventa immobile e non risponde a stimoli esterni. Trasferire ogni pesce manualmente su un supporto in silicone appositamente realizzato per il trattamento laser.

Un’anestesia appropriata è fondamentale per il benessere dell’animale e per il successo della procedura. Pertanto, la soluzione di tricaina appena preparata è essenziale e il tempo di permanenza fuori dall’acqua non deve superare di molto i 10 minuti. Impostare la potenza in uscita del laser a 532 nanometri su 70 milliwatt, la durata dell’impulso su 100 millisecondi e il diametro aereo su 50 micron.

Quindi, applicare una o due gocce di idrossipropil metilcellulosa al 2% sull'occhio. Quando si applica la metilcellulosa sull'occhio, assicurarsi che la soluzione viscosa non entri nelle branchie. Successivamente, utilizzare una lente fundoscopica per laser da 2 millimetri per focalizzare il raggio laser di puntamento sulla retina.

Posizionare quattro punti laser attorno al nervo ottico nell'occhio sinistro e utilizzare l'occhio destro, non trattato, come controllo interno. Immediatamente dopo l'induzione laser, posizionare il pesce zebra ancora anestetizzato su un supporto personalizzato in silicone con perni nell'area di imaging. Per ottenere immagini ottimali, tagliare una lente a contatto in idrogel disponibile in commercio in modo che si adatti all'occhio del pesce zebra utilizzando un perforatore.

Riempire la superficie concava della lente con metilcellulosa, quindi posizionarla sulla cornea. Dotare il sistema di tomografia a coerenza ottica di una lente a fessura non a contatto da 78D. Mettere a fuoco l'immagine infrarossa in modalità IR più OCT per visualizzare il fondo oculare.

Quindi, acquisire le immagini in infrarosso facendo clic sul pulsante di acquisizione per localizzare i punti laser sulla retina. Successivamente, visualizzare una sezione tridimensionale dei livelli retinici in modalità infrarosso più OCT ed eseguire le immagini facendo clic sul pulsante di acquisizione. Osservare la gravità del danno nel livello nucleare esterno in queste immagini.

Per invertire l'anestesia dopo il trattamento e l'acquisizione di immagini, posizionare il pesce zebra in un contenitore contenente acqua del serbatoio. Per favorire il recupero, creare un flusso di acqua del serbatoio fresca sulle branchie muovendo avanti e indietro il pesce zebra nell'acqua. Immediatamente dopo il trattamento laser, un segnale iper-riflettente diffuso è stato localizzato nella retina esterna.

Si estendeva dall'epitelio pigmentato retinico fino al livello plessiforme esterno. Il segnale iper-riflettente diffuso è assente nella retina dell'occhio di controllo non lesionato. Un segnale iper-riflettente diffuso simile è stato rilevato al primo giorno dopo la lesione.

Dopo il terzo giorno, questo segnale diffuso divenne più organizzato e denso. Fu osservato in modo costante nello strato nucleare esterno, estendendosi nello strato dei fotoricettori. Dopo la prima settimana, si registrò una riduzione significativa della dimensione media della lesione e fu rilevato soltanto un piccolo segnale iper-riflettente.

A partire dal giorno 14 fino al punto temporale successivo indagato, i punti laser non erano più visibili nelle immagini IR e OCT, e la morfologia della retina è paragonabile al lato di controllo, come mostrato qui. La colorazione con ematossilina-eosina è stata utilizzata per indagare l'estensione e la cinetica della degenerazione e rigenerazione retinica. Questa immagine mostra la sezione di controllo.

Questa immagine mostra la colorazione con ematossilina ed eosina a tre giorni dal trauma, quando la perdita massima di fotoricettori risulta evidente. È stata eseguita un'immunofluorescenza per visualizzare i marcatori delle cellule gliali, la glutammato sintetasi, in rosso, e la proteina acida fibrillare gliale, in verde. Questa immagine mostra una retina di controllo in cui la fluorescenza verde è molto scarsa, indicativa di GFAP.

Il segnale GFAP è risultato up-regolato al terzo giorno dopo la lesione, mentre il segnale rosso della glutamine sintetasi è rimasto invariato. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altre metodiche come la microscopia a due fotoni e analisi cellulari e molecolari al fine di studiare il coinvolgimento delle cellule molecolari nei meccanismi endogeni di riparazione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come indurre un danno focale alla retina del pesce zebra e di come monitorare in vivo i successivi processi degenerativi e rigenerativi.