Name: Attivazione delle cellule di Glia di Müller in una degenerazione retinica indotta da Laser e un modello di rigenerazione in Zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Scopri come indurre danni retinici focali con laser e monitorare i cambiamenti cellulari in vivo nello zebrafish Danio rerio. Questo metodo permette di studiare i processi degenerativi e rigenerativi della retina.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo Martin Zinkernagel, MD, PhD e Miriam Reisenhofer, PhD per il suo contributo scientifico a stabilire il modello e Federica Bisignani per la sua eccellente assistenza tecnica.

tutti gli esperimenti aderito all'istruzione per l'uso degli animali in oftalmica e Vision Research dell'associazione per la ricerca in Oftalmologia (ARVO) e la visione e il rispetto dei relativi regolamenti delle autorità governative.
 1. animali <ol><li>TgBAC mantenere (gfap:gfap-GFP) ceppo di zebrafish 167 (AB) di età compresa tra 6-9 mesi in condizioni standard in acqua con una temperatura di 26,5 ° C e un ciclo luce/buio di 14/10 h 18.</li>
	<li>Seguire le istruzioni di cura degli animali delle istituzioni coinvolte per esperimenti sugli animali dopo l'approvazione da parte delle autorità governative.</li>
</ol> 2. Anestesia sistemica reversibile <ol><li>preparare la soluzione stock di etile 3-aminobenzoate methanesulfonate sale (tricaina) sciogliendo 400 mg di polvere di tricaina in 97,9 mL di serbatoio acqua e 2,1 mL di 1 M di Tris buffered saline (TBS). Regolare il pH 7.0 con 1 M Tris (pH 9) e conservare a 4 ° C nel buio fino a un mese. 
	Nota: Tricaina dovrebbe essere preparato in acqua come le condizioni di vita naturale dell'animale, dovrebbe essere usato preferibilmente acqua serbatoio originale.</li>
	<li>Diluire la soluzione di riserva 01:25 in serbatoio di acqua e utilizzare subito.</li>
	<li>Inserire un 10cm di Petri contenente 50 mL di soluzione di anestesia, fino a quando diventano immobile e non rispondono agli stimoli esterni (circa 2-5 min, a seconda del peso e l'età) di zebrafish.</li>
	<li>Trasferire ogni pesce a mano a un titolare di pin del silicone su misura per il trattamento laser ( Figura 1A). 
	ATTENZIONE! Il pesce può rimanere anestetizzato di fuori del serbatoio per solo fino a 10 min.</li>
	<li>Per invertire l'anestesia dopo il trattamento e/o formazione immagine, posizionare il danio zebrato nel contenitore contenente acqua serbatoio.</li>
	<li>Per supportare il ripristino, creare un flusso di fresco serbatoio acqua attraverso le branchie spostando zebrafish avanti e indietro nell'acqua.</li>
</ol> 3. Lesione focale sulla Retina del laser Nota: A 532 nm diodo laser viene utilizzato per creare danno luce focale sulla retina di zebrafish. Il set-up sperimentale del laser consente la creazione di una lesione retinica focale riproducibile in zebrafish adulto.
<ol><li>Impostare la potenza di uscita del laser: 70 mW; diametro antenna: 50 µm; durata impulso: 100 ms. attenzione! L'utilizzo della luce laser richiede protettivi appropriati ed etichettatura dell'area.</li>
	<li>Applicare 1-2 gocce di 2% idrossipropilmetilcellulosa topicamente nell'occhio prima del trattamento e utilizzare una lente del laser del fondo 2,0 mm per focalizzare il fascio di puntamento laser sulla retina. 
	ATTENZIONE! idrossipropilmetilcellulosa gocce sono viscosi e può causare problemi di respirazione se si va sulle lamelle.</li>
	<li>Posto quattro laser macchie intorno al nervo ottico sulla sinistra dell'occhio e usare l'occhio destro, non trattato come controllo interno.</li>
</ol> 4. In vivo Imaging della morfologia retinica <ol><li>il giorno 0, visualizzare la retina di zebrafish direttamente dopo l'induzione di laser senza riportarli dall'anestesia. A tutti gli altri punti di tempo, impiegare l'anestesia generale (vedere sezione 2: anestesia sistemica reversibile). Posizionare il zebrafish immobilizzato su un supporto di pin del silicone su misura ( Figura 1 B, b. 1).</li>
	<li>Per ottenere immagini ottimali, tagliare una lente a contatto idrogel commercialmente disponibili per adattare l'occhio di zebrafish (Ø = 5,2 mm, r = 2.70 mm, spessore centro = 0,4 mm) per mezzo di un punzone di foro. Riempire la superficie concava della lente con metilcellulosa e metterlo sopra la cornea.</li>
	<li>Dotare il sistema di OCT con una lente di lampada fessura senza contatto 78D.</li>
	<li>a fuoco l'immagine ad infrarosso (IR) in IR + OCT mode ( Figura 2A) per visualizzare il fondo dell'occhio e l'IR foto cliccando il &#34; Acquire &#34; pulsante ( Figura 2B) per localizzare il macchie sulla retina utilizzando il sistema del laser &#39; software s.</li>
	Modalità di <li>Visualize una sezione tridimensionale degli strati retinici in IR + OCT e scattare le foto cliccando il &#34; Acquire &#34; pulsante ( Figura 2B). Osservare la gravità delle lesioni nello strato nucleare esterno (ONL) (vedere sezione 3: Laser lesione focale sulla retina) in queste immagini.</li>
	<li>Per invertire l'anestesia dopo il trattamento e/o formazione immagine posto zebrafish in un recipiente contenente acqua serbatoio.</li>
	<li>Per supportare il ripristino, creare un flusso di fresco serbatoio acqua attraverso le branchie spostando zebrafish avanti e indietro nell'acqua.</li>
	<li>Eseguire simili in vivo imaging della morfologia retinica il giorno 1, 3, 7, 14 e settimana 6.</li>
</ol> 5. Ematossilina &#38; eosina (H &#38; E) colorazione <ol><li>eutanasia zebrafish di immersione in freddo (4 ° C) soluzione di anestesia sul ghiaccio per almeno 10 min ed enucleare gli occhi immediatamente per mezzo di piccola pinzetta.</li>
	<li>Fissare gli occhi tutto in paraformaldeide al 4% (PFA) in tampone fosfato salino (PBS) a 4 ° C per 20 h e quindi disidratare i campioni in una serie di graduali alcool (xilene 100% per 5 min due volte, etanolo 100% per 5 min due volte, etanolo 96% per 3 min due volte ed etanolo 70% 3 mi n una volta). 
	ATTENZIONE! PFA può essere irritante per gli occhi, il naso e la traccia delle vie respiratorie superiore. PFA è un agente cancerogeno umano conosciuto e un sospetto rischio riproduttivo.</li>
	<li>Incorporare i campioni in paraffina, tagliare 5 µm sezioni a livello della testa del nervo ottico e montarli sulle lastre di vetro.</li>
	<li>Macchia le sezioni Sparaffinatura con soluzione di Ematossilina acida di 0,1% per 5 min e immergere i vetrini due volte in acqua distillata dopo l'immersione le diapositive nel mix di acido cloridrico (2 mL 25% HCl in 250 mL di acqua distillata acqua) e mescolare (2 mL 25% di ammoniaca in 250 mL di ammoniaca acqua distillata). Macchia le sezioni con Eosina G soluzione acquosa allo 0,5% per 3 minuti dopo lo sviluppo dell'intensità dell'ematossilina macchiatura di acqua del rubinetto per almeno 10 min.</li>
	<li>Montare i vetrini disidratati in mezzo di montaggio di resina acrilica e osservare i vetrini al microscopio luce.</li>
</ol> 6. Immunohistochemistry per l'attivazione di MC <ol><li>scaldare le sezioni Sparaffinatura nel buffer di recupero di antigene (Tris-EDTA + 0.05% detergente non ionico, pH 9.0) per 3 minuti in un piroscafo appropriato o un forno a microonde per 10-15 min e lavare tre volte con TBS per 5 ogni min.</li>
	<li>Blocco cerchio le sezioni con un silicone penna e aggiungere 100 µ l soluzione (TBS + siero normale di capra 10% + 1% albumina di siero bovino, pH 7.6) a temperatura ambiente per 1 h.</li>
	<li>Macchia con anticorpo policlonale di coniglio anti-proteina fibrillare acida (GFAP) e con l'anticorpo monoclonale del mouse anti-glutamina sintetasi (GS), entrambi in una diluizione di 1: 200 (40 µ l per campione). Incubare il vetrino in una camera umidificata a 4 ° C durante la notte. Lavare tre volte con TBS + 0.1% Tween 20 per 5 minuti ciascuno.</li>
	<li>Visualizzazione di finitura con l'appropriato anticorpi secondari. Questo protocollo utilizzato un anti-coniglio di capra IgG H &#38; anticorpo secondario L verde per GFAP e un anti-topo di capra IgG H &#38; L rosso brillante per GS, entrambi in una diluizione di 1: 500 a temperatura ambiente per 1 h.</li>
	<li>Montare i vetrini con mezzo di montaggio contenente DAPI e osservare i vetrini al microscopio a fluorescenza.</li>
</ol>

<ol><li>Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+age-related+macular+degeneration%3A+a+review+of+progress+to+date%5BTitle%5D)+AND+%22Surv.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date.</a> Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).</li>
<li>Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+Pigmentosa%3A+Genes+and+Disease+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">Retinitis Pigmentosa: Genes and Disease Mechanisms.</a> Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).</li>
<li>Berson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa.+The+Friedenwald+Lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa. The Friedenwald Lecture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1659-1676 (1993).</li>
<li>Strettoi, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4688370/">A Survey of Retinal Remodeling.</a> Front Cell Neurosci. 9, 494(2015).</li>
<li>Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17113430">Retinitis pigmentosa.</a> Lancet. 368, 1795-1809 (2006).</li>
<li>Wang, D. Y., Chan, W. M., Tam, P. O., Baum, L., Lam, D. S., Chong, K. K., Fan, B. J., Pang, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+mutations+in+retinitis+pigmentosa+and+their+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Gene mutations in retinitis pigmentosa and their clinical implications.</a> Clin Chim Acta. 351 (1-2), 5-16 (2005).</li>
<li>Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+to+photoreceptor+cell+death+in+inherited+retinal+degenerations%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Pathways to photoreceptor cell death in inherited retinal degenerations.</a> BioEssays. 23, 605-618 (2001).</li>
<li>Tackenberg, M. A., Tucker, B. A., Swift, J. S., Jiang, C., Redenti, S., Greenberg, K. P., Flannery, J. G., Reichenbach, A., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muller+cell+activation%2C+proliferation+and+migration+following+laser+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Muller cell activation, proliferation and migration following laser injury.</a> Mol. Vis. , 1886-1896 (2009).</li>
<li>Newman, E., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+M%C3%BCller+cell%3A+a+functional+element+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Müller cell: a functional element of the retina.</a> Trends Neurosci. 19 (8), 307-312 (1996).</li>
<li>Kubota, R., Hokoc, J. N., Moshiri, A., McGuire, C., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+neurogenesis+in+the+retinal+ciliary+marginal+zone+of+homeothermic+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A comparative study of neurogenesis in the retinal ciliary marginal zone of homeothermic vertebrates.</a> Brain Res Dev Brain Res. 134, 31-41 (2002).</li>
<li>Zhao, T. T., Tian, C. Y., Yin, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+M%C3%BCller+cells+occurs+during+retinal+degeneration+in+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of Müller cells occurs during retinal degeneration in RCS rats.</a> Adv Exp Med Biol. 664, 575-583 (2010).</li>
<li>DiCicco, R. M., Bell, B. A., Kaul, C., Hollyfield, J. G., Anand-Apte, B., Perkins, B. D., Tao, Y. K., Yuan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+Regeneration+Following+OCT-Guided+Laser+Injury+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal Regeneration Following OCT-Guided Laser Injury in Zebrafish.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (10), 6281-6288 (2014).</li>
<li>Bilotta, J., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model visual system.</a> Int. J. Dev. Neurosci. , 621-629 (2001).</li>
<li>Fausett, B. V., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+alpha1+tubulin-expressing+M%C3%BCller+glia+in+regeneration+of+the+injured+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A role for alpha1 tubulin-expressing Müller glia in regeneration of the injured zebrafish retina.</a> J Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).</li>
<li>Yurco, P., Cameron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+M%C3%BCller+glia+to+retinal+injury+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish.</a> Vision Res. 45, 991-1002 (2005).</li>
<li>Ashutosh, P. J., Roesch, K., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+neurogenic+potential+of+M%C3%BCller+gial+cells+in+the+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Development and neurogenic potential of Müller gial cells in the vertebrate retina.</a> Prog Retin Eye Res. 28 (4), 249-262 (2009).</li>
<li>Xia, X., Ahmad, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlocking+the+Neurogenic+Potential+of+Mammalian+M%C3%BCller+Glia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Unlocking the Neurogenic Potential of Mammalian Müller Glia.</a> Int J Stem Cells. 9 (2), 169-175 (2016).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , IRL Press. 7-38 (2002).</li>
<li>Riepe, R. E., Norenburg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+cell+localisation+of+glutamine+synthetase+in+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Müller cell localisation of glutamine synthetase in rat retina.</a> Nature. 268 (5621), 654-655 (1977).</li>
<li>Derouiche, A., Rauen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coincidence+of+L-glutamate%2FL-aspartate+transporter+%28GLAST%29+and+glutamine+synthetase+%28GS%29+immunoreactions+in+retinal+glia%3A+evidence+for+coupling+of+GLAST+and+GS+in+transmitter+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance.</a> J Neurosci Res. 42 (1), 131-143 (1995).</li>
<li>Bignami, A., Dahl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+radial+glia+of+M%C3%BCller+in+the+rat+retina+and+their+response+to+injury.+An+immunofluorescence+study+with+antibodies+to+the+glial+fibrillary+acidic+%28GFA%29+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The radial glia of Müller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein.</a> Exp Eye Res. 28 (1), 63-69 (1979).</li>
<li>Sherpa, T., Fimbel, S. M., Mallory, D. E., Maaswinkel, H., Spritzer, S. D., Sand, J. A., Li, L., Hyde, D. R., Stenkamp, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglion+cell+regeneration+following+whole-retina+destruction+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish.</a> Dev Neurobiol. 68 (2), 166-181 (2008).</li>
<li>Cameron, D. A., Carney, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mosaic+patterns+in+the+native+and+regenerated+inner+retina+of+zebrafish%3A+implications+for+retinal+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cell mosaic patterns in the native and regenerated inner retina of zebrafish: implications for retinal assembly.</a> J Comp Neurol. 416 (3), 356-367 (2000).</li>
<li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> BMC Dev Biol. 6, 36(2006).</li>
<li>Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral-domain+optical+coherence+tomography+as+a+noninvasive+method+to+assess+damaged+and+regenerating+adult+zebrafish+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).</li>
<li>Koinzer, S., Saeger, M., Hesse, C., Portz, L., Kleemann, S., Schlott, K., Brinkmann, R., Roider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+with+OCT+and+histology+of+photocoagulation+lesions+in+patients+and+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Correlation with OCT and histology of photocoagulation lesions in patients and rabbits.</a> Acta Ophthalmol. 91 (8), e603-e611 (2013).</li>
<li>Wan, J., Zheng, H., Chen, Z. L., Xiao, H. L., Shen, Z. J., Zhou, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+regeneration+of+photoreceptor+from+M%C3%BCller+glia+after+retinal+degeneration+in+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Preferential regeneration of photoreceptor from Müller glia after retinal degeneration in adult rat.</a> Vision Res. (2), 223-234 (2008).</li>
<li>Thomas, J. L., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+light+damage+paradigm+for+use+in+retinal+regeneration+studies+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (80), e51017(2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Rigenerazione/degenerazione retinica in zebrafish è stata studiata da diversi approcci quali citotossina-mediata delle cellule morte22, danno meccanico23e lesione termica24. Abbiamo impiegato un laser a diodo 532 nm per danneggiare la retina di zebrafish. In tal modo, il nostro modello offre diversi vantaggi. Per esempio, abbiamo creato rapidamente un'area ben definita di lesioni localizzate in retina esterna, in particolare nello strato PRs. Inoltre...

Visione è probabilmente il senso più essenziale dell'essere umano e la sua svalutazione ha un alto impatto socio-economico. Nei paesi industrializzati, le malattie degenerative retiniche rappresentano la maggior parte della perdita della vista e cecità fra la popolazione adulta1. Retinite pigmentosa (RP) è la causa ereditaria più comune di cecità nella gente fra le età di 20 e 60, che colpisce circa 1,5 milioni di persone in tutto il mondo2,3. È una famiglia eterogenea di malattie retiniche ereditarie caratterizzata da perdita progressiva dei fotorecettori (PRs) seguita da degenerazione dell'epitelio retinico del pigmento e, successivamente, il gliosis e il rimodellamento di neuroni interno4. Il corso della malattia può essere spiegato dalla perdita incrementale dei due tipi cellulari PR, solitamente a partire con i coni retinici, che sono responsabili della visione acromatico nella luce fioca e coni, che sono essenziali per la visione e l'acuità visiva del colore5. Un singolo difetto di gene è sufficiente per causare la RP. Finora più di 130 mutazioni in oltre 45 geni sono state associate con la malattia6. Questo conduce a diversi fenotipi di malattia ed è una ragione per cui la terapia genica è non generalizzabile e così un approccio terapeutico intricato. Di conseguenza, c'è un urgente bisogno di sviluppare nuove strategie terapeutiche generali per il trattamento di degenerazioni retiniche in accecante malattie.
Degenerazione retinica spesso comporta perdita di PR; Pertanto, la morte delle cellule di PR è un marchio di garanzia di processi degenerativi della retina7. Già è stato dimostrato che la morte delle cellule PR stimola Müller glia cella (MC) attivazione e proliferazione8. MCs, il tipo di cellule gliali principali nella retina dei vertebrati, una volta sono stati considerati per essere nient'altro che una "colla" tra neuroni retinici. Negli ultimi anni, molti studi hanno dimostrato che MCs agire come più di mera strutturali sostengono il9. Tra le diverse funzioni, MCs partecipare anche nella neurogenesi e10di riparazione. Infatti, in risposta a fattori diffusibili dalla degenerazione retina, MCs significativamente aumentare l'espressione di proteina silicea fibrillare glial (GFAP). Di conseguenza, GFAP etichettatura può essere utilizzato come un indicatore per l'attivazione di MC come una risposta secondaria a lesioni retiniche e degenerazione11.
Recentemente, abbiamo sviluppato un adattamento del romanzo di lesioni focali usando un laser per indurre la degenerazione retinica in zebrafish (Danio rerio). Lesione focale è vantaggioso per lo studio di alcuni processi biologici come la migrazione delle cellule nel sito di feriti e la tempistica precisa degli eventi che si svolgono durante la rigenerazione della retina12. Inoltre, il pesce zebra è diventato importante nella ricerca visiva a causa delle somiglianze tra il sistema visivo e quello di altri vertebrati. Lorda caratteristiche morfologiche ed istologiche di retine umane e Teleostei visualizzano alcune differenze. Di conseguenza, retine umane e zebrafish contengono le stesse classi principali delle cellule organizzate nello stesso modello a strati, dove la luce-sensing fotorecettori occupano lo strato più esterno, mentre i neuroni di proiezione retinica, le cellule del ganglio, risiedono nella parte più interna un neurone strato, prossimale alla lente. Gli interneuroni retinici, amacrine, bipolare e cellule orizzontali, localizzano tra strati di cellule del fotoricettore e del ganglio13. Inoltre, la retina di zebrafish è dominata dal cono e quindi più vicino alla retina umana che, ad esempio, la retina del roditore intensamente studiata. Un'affascinante differenza tra teleosteo e mammiferi è la persistente neurogenesi nella retina di pesce e rigenerazione della retina dopo danni. In zebrafish, MCs può dedifferentiate e mediare la rigenerazione in retina feriti14,15. Nel pollo, MCs hanno alcune capacità anche di inserire nuovamente il ciclo cellulare e di dedifferentiate. A seguito di lesione retinica in pesci adulti, MCs adottare determinate caratteristiche di cellule staminali e progenitrici, la migrazione verso il tessuto retinico danneggiato e produrre nuovi neuroni16. Profili di espressione genica di mammiferi MCs ha rivelato somiglianze inaspettate ai progenitori della retina, e prova per potenziale neurogenico intrinseco di MCs nella pollo, roditore e nella retina umana sta sviluppandosi17. Tuttavia, perché la risposta rigenerativa negli uccelli e nei mammiferi è inferiore rispetto con la risposta robusta nel pesce non è ancora capito. Di conseguenza, la comprensione dei meccanismi di riparazione endogena in zebrafish può suggerire strategie per stimolare la rigenerazione della retina in mammiferi ed esseri umani. Impiegando il meccanismo di riparazione endogena di MCs come strumento terapeutico per il trattamento dei pazienti con degenerazione retinica avrebbe un impatto eccezionale per la nostra società.
Qui, forniamo i passaggi necessari per utilizzare il modello di degenerazione/rigenerazione nella ricerca oftalmica. Prima ci siamo concentrati sulla induzione del danno focale nella retina neurosensoriale, quindi sulla formazione immagine degli eventi in via di sviluppo presso il sito di lesione e infine visualizzante coinvolgimento di MCs adiacente. Il protocollo generale è relativamente facile da effettuare e si apre una vasta gamma di possibilità per la valutazione della retina in seguito.

<table><tbody><tr><td>Soluzione di ematossilina acida</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera</td><td>2852</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera</td><td>A07030</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Dako Pen</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DAPI supporto di montaggio</td><td>Vector Labs, Burlingame, CA, USA</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Eosina G soluzione acquosa 0,5%</td><td>Carl Roth, Arlesheim, Svizzera</td><td>X883.2</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiammina tetraacetico (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG H&amp; L Alexa Fluor&reg; 488</td><td>Life Technologies, Zugo, Svizzera</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>IgG H& L Alexa Fluor&reg; 594</td><td>Life Technologies, Zug, Svizzera</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>Siero normale di capra</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>Lenti a contatto in idrogel</td><td>Johnson & Johnson AG, Zug, Svizzera</td><td>n.a.1-Day</td> <td>Acuvue Moist</td></tr><tr><td>Hydroxypropylmethylcellulose 2%</td><td>OmniVision, Neuhausen, Switzerland</td><td>n.a.Methocel</td> <td>2%</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonato</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland</td><td>A5040</td><td>Tricaine, MS-222</td></tr><tr><td>Visulas 532s</td><td>Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germania</td><td>n.a.532</td> <td>nm laser</td></tr><tr><td>Mouse anticorpo monoclonale anti-GS</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>HRA + OCT Imaging System</td><td>Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germania</td><td>n.a.Spectralis</td><td></td></tr> <tr><td>Heidelberg Eye Explorer</td><td>Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germania</td><td>n.a.Versione</td> <td>1.9.10.0</td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale anti-GFAP di coniglio</td><td>Invitrogen, Waltham, MA, USA</td><td>180063</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per perno in silicone</td><td>Huco Vision AG Switzerland</td><td>n.a.</td> <td>Tagliato a mano dal tappetino in silicone del vassoio di sterilizzazione di conseguenza.</td></tr><tr><td>Lampada a fessura BM900</td><td>Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland</td><td>n.a.Adattatore</td><td></td></tr> <tr><td>per lampada a fessura</td><td>Iridex Corp., Mountain View, CA, USA</td><td>n.a.Vetrini</td><td></td></tr> <tr><td>Superfrost Plus Gehard</td><td>Menzel GmbH, Braunschweig, Germania</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain</td><td>KIT, Karlsruhe, Germania</td><td>15204</td><td>http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata Tris (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera</td><td>P5912</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>78D lente per lampada a fessura senza contatto</td><td>Volk Optical, Mentor, OH, USA</td><td>V78C</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Lente laser per fondo oculare</td><td>Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA</td><td>OFA2-0</td><td></td></tr><tr><td>2100 Retriever</td><td>Aptum Biologics Ltd., Southampton, Regno Unito</td><td>R2100-EU</td><td>Piroscafo</td></tr></tbody></table>

attivazione delle cellule di glia di müller in una degenerazione retinica indotta da laser e un modello di rigenerazione in zebrafish

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

Un'affascinante differenza tra teleosteo e mammiferi è il potenziale permanente della retina Teleostei per neurogenesi retinica e la rigenerazione dopo gravi danni. Studiando le vie di rigenerazione in zebrafish potrebbe portare a nuove comprensioni di sviluppare strategie innovative per il trattamento di malattie degenerative retiniche nei mammiferi. Qui, ci siamo concentrati sull'induzione di una lesione focale a retina esterna in zebrafish adulto per mezzo di un laser a diodo 532 nm. Una lesione localizzata permette di indagare i processi biologici che avvengono durante la degenerazione retinica e rigenerazione direttamente presso l'area di danno. Usando la tomografia a coerenza ottica non invasiva (OCT), siamo stati in grado di definire la posizione della rigenerazione successiva area e monitor danneggiata in vivo. Infatti, la formazione immagine OCT produce immagini ad alta risoluzione, a sezione trasversale della retina zebrafish, fornendo informazioni che era precedentemente disponibile solo con le analisi istologiche. Al fine di confermare i dati da ott in tempo reale, sono state eseguite sezioni istologiche e risposta rigenerativa dopo l'induzione della lesione retinica è stata studiata da immunohistochemistry.

OCT in tempo reale: al fine di analizzare il ruolo di MCs in riparazione retinica, abbiamo usato un modello di lesione laser inducendo una zona ben delineata di danno nella retina zebrafish. Il sito del danno era imaged mediante OCT in vivo per la prima volta (giorno 0) entro 60 minuti dopo l'infortunio (Figura 3). Per compensare l'ottica del fish eye, una lente a contatto su misura è stato disposto sulla cornea. Immediatamente dopo ...

Zebrafish è un popolare modello animale per lo studio dei meccanismi di degenerazione/rigenerazione della retina nei vertebrati. Questo protocollo descrive un metodo per indurre lesioni localizzate interrompendo la retina esterna con danno minimo per la retina interna. Successivamente, monitoriamo in vivo la morfologia retinica e la risposta di glia di Müller durante rigenerazione retinica.

Attivazione delle cellule di Glia di Müller in una degenerazione retinica indotta da Laser e un modello di rigenerazione in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

L'obiettivo generale di questo video è mostrare come monitorare in vivo i cambiamenti cellulari a seguito di un danno retinico focale indotto da laser nel Zebrafish. Questo modello può aiutare a rispondere a domande fondamentali sulla rigenerazione retinica, come i cambiamenti morfologici, la cinetica e i tipi cellulari coinvolti. Il principale vantaggio di questa tecnica è che, inducendo una lesione focale, i processi biologici possono essere studiati direttamente nel sito della lesione.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla rigenerazione della retina del pesce zebra, può anche essere applicato per studiare il meccanismo di riparazione in diversi modelli animali. Preparare una soluzione madre di anestetico sciogliendo 400 milligrammi di polvere di tricaina in 97,9 millimetri di acqua del serbatoio e 2,1 millimetri di TBS uno molare. Regolare il pH a 7,0 utilizzando tris uno molare a pH 9.Per preparare la soluzione di lavoro, diluire la soluzione madre di tricaina 1 a 25 in acqua per acquario e trasferire 50 millilitri in una piastra di Petri. Successivamente, immergere il Pesce Zebra nella soluzione anestetica per due-cinque minuti, fino a quando non diventa immobi

mller-glia-cell-activation-laser-induced-retinal-degeneration

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Questo video mostra una procedura per indurre la degenerazione retinica in zebrafish adulti utilizzando lesioni laser. Il laser prende di mira le cellule fotorecettrici della retina, innescando la morte cellulare e un processo degenerativo. Questo danno attiva le cellule della glia di Müller (MG), portando alla loro dedifferenziazione in progenitori di cellule staminali che aiutano nella rigenerazione retinica.

Modellazione della degenerazione e della rigenerazione retinica nel pesce zebra utilizzando una lesione laser focale

Fonte: Lahne, M., et.al. Coltura di espianti retinici di zebrafish transgenico adulto per l'imaging di cellule vive mediante microscopia multifotonica. J. Vis. Exp. (2017)Questo video dimostra l'imaging su cellule vive della migrazione nucleare gliale di Muller in espianti retinici di pesce zebra inclusi in agarosio a seguito di danni ai fotorecettori indotti dalla luce. Il fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-α) rilasciato dai fotorecettori danneggiati attiva le cellule gliali di Muller,...

Imaging di cellule vive della migrazione nucleare gliale di Muller durante la rigenerazione retinica del pesce zebra

Anche se il sistema nervoso periferico (PNS) è in grado di riparare significativo dopo l'infortunio, poco si sa circa i meccanismi cellulari e molecolari che regolano questo fenomeno. Utilizzando vivo, zebrafish transgenico e riproducibile saggio resezione del nervo, siamo in grado di studiare i comportamenti delle cellule gliali dinamici durante la degenerazione dei nervi e la rigenerazione.

Motor Nerve transezione e Time-lapse imaging di gliali comportamenti delle cellule in vivo Zebrafish

Protocolli multipli danni leggeri sono stati descritti da fotorecettori danni e di conseguenza indurre una risposta rigenerazione della retina in zebrafish adulto. Questo protocollo descrive un metodo migliorato che può essere utilizzato in animali pigmentate e che danneggia la stragrande maggioranza di canna e cono fotorecettori attraverso l'intera retina.

A Novel Luce Danni Paradigma per l&#39;uso in retina Rigenerazione Studi in Zebrafish adulti

Qui dimostriamo quantificazione dei de- retina e la rigenerazione e il suo impatto sulla funzione visiva con N -methyl- N -nitrosourea in zebrafish adulto. Perdita di acuità visiva e diminuito il numero dei fotorecettori sono state seguite dalla proliferazione nello strato nucleare interno. Completa rigenerazione morfologica e funzionale si è verificato 30 giorni dopo il trattamento iniziale.

Methylnitrosourea (MNU) indotta retinica degenerazione e rigenerazione in Zebrafish: istologica e Caratteristiche Funzionali

Le manipolazioni mirate per causare stress diretto o morte nelle singole cellule sono state relativamente difficili da realizzare. In questo articolo, viene descritto un approccio di ablazione con risoluzione di singole cellule per stressare e uccidere selettivamente singole cellule in coltura cellulare e animali viventi basato su un laser UV confocale standard.

Attivazione delle cellule Lo stress e la morte con i convenzionali UV laser Microscopia confocale

la rigenerazione della retina zebrafish è stato per lo più studiata utilizzando retine fissi. Tuttavia, i processi dinamici come la migrazione nucleare interkinetic si verificano durante la risposta rigenerativa e richiedono live-cell imaging per studiare i meccanismi alla base. Qui, descriviamo condizioni di coltura e di imaging per monitorare Interkinetic migrazione nucleare (INM) in tempo reale utilizzando la microscopia multiphoton.

Cultura di adulti transgenici Zebrafish retina espianti per live-cell imaging per Multiphoton Microscopia

L'ablazione laser è una tecnologia ampiamente applicabile per lo studio della rigenerazione nei sistemi biologici. Il protocollo presentato descrive l'uso di un microscopio confocale a scansione laser standard per l'ablazione laser e la successiva imaging time-lapse di cellule interneuromast rigeneranti nella linea laterale zebrafish.

Saggio di ablazione e rigenerazione laser a base di microscopio confocale nelle cellule interneuromast zebrafish

Il presente protocollo descrive un metodo per indurre lesioni tessuto-specifiche e altamente riproducibili nelle larve di zebrafish utilizzando un sistema di lesione laser combinato con una piattaforma microfluidica automatizzata per la manipolazione delle larve.

Lesioni indotte da laser semi-automatizzate controllate per lo studio della rigenerazione del midollo spinale nelle larve di zebrafish

L'articolo spiega come rimuovere chirurgicamente gli occhi dalle larve viventi di zebrafish come primo passo verso lo studio di come l'input retinico influenza la crescita e lo sviluppo del tectum ottico. Inoltre, l'articolo fornisce informazioni sull'anestesia larvale, la fissazione e la dissezione cerebrale, seguite da immunoistochimica e imaging confocale.

Rimozione dell'occhio nelle larve di zebrafish viventi per esaminare la crescita dipendente dall'innervazione e lo sviluppo del sistema visivo

Questo protocollo descrive la metodologia per ablare geneticamente l'epitelio pigmentato retinico (RPE) utilizzando un modello transgenico di zebrafish. L'adattamento del protocollo per incorporare la modulazione della via di segnalazione utilizzando composti farmacologici è ampiamente dettagliato. È stata sviluppata una piattaforma MATLAB per quantificare la rigenerazione RPE basata sulla pigmentazione, che viene presentata e discussa.

Ablazione mediata da nitrorefuttasi/metronidazolo e una piattaforma MATLAB (RpEGEN) per lo studio della rigenerazione dell'epitelio pigmentato retinico zebrafish

Scopri come indurre danni retinici focali con laser e monitorare i cambiamenti cellulari in vivo nello zebrafish Danio rerio. Questo metodo permette di studiare i processi degenerativi e rigenerativi della retina.

Attivazione delle cellule di Glia di Müller in una degenerazione retinica indotta da Laser e un modello di rigenerazione in Zebrafish (Video) | JoVE Journal

Attivazione delle cellule di Glia di Müller in una degenerazione retinica indotta da Laser e un modello di rigenerazione in Zebrafish

Esplora altri video