Preparazione di idrogeli iniettabili a base di chitosano e la sua applicazione nella coltura cellulare 3D

L'obiettivo generale di questo protocollo è preparare un idrogel di chitosano iniettabile per colture cellulari tridimensionali da utilizzare infine nei trattamenti terapeutici. Questo metodo può rispondere a domande nel campo dell'idrogel autorigenerante, ad esempio come realizzare un idrogel autorigenerante immergendolo completamente e come utilizzarlo per la coltura cellulare 3D. Il mio vantaggio di questa tecnica è che l'idrogel autorigenerante compatibile può essere preparato in un modo molto semplice e l'uso di una coltura cellulare 3D.

Questo idrogel è anche iniettabile, quindi può essere utilizzato come vettore per la terapia cellulare. Ora il signor Yongsan Li ti mostrerà come fare l'idrogel e come fare la coltura cellulare 3D usando questo idrogel. Yongsan Li è il nostro studente laureato del nostro laboratorio.

Per fare gli idrogel, sintetizzare prima DF PEG. In una cappa aspirante pesare quattro grammi di PEG di peso molecolare 4.000 in un pallone a fondo tondo e aggiungere 100 millilitri di toluene. Quindi, per sciogliere i polimeri, riscaldare la soluzione.

Dopo che tutti i polimeri si sono dissolti, utilizzare un evaporatore per rimuovere tutti i solventi. Quindi, ripetere il processo di miscelazione del toluene e di evaporazione altre due volte per preparare i polimeri PEG secchi. Successivamente, utilizzando un agitatore magnetico e 100 millilitri di DHF, sciogliere i polimeri.

Quindi, sciogliere 0,9 grammi di 4-carbossibenzaldeide nella soluzione. Successivamente, sciogliere 0,07 grammi di dimetilamminopirimmide nella soluzione. Ora aggiungi 1,25 grammi di DCC in un tubo di essiccazione riempito con cloruro di calcio anidro.

Ora lasciare che la reazione agiti a temperatura ambiente per circa 12 ore. Il giorno successivo, utilizzare 500 millilitri di etere etilico freddo per far precipitare i solidi bianchi e utilizzare la filtrazione sottovuoto per raccogliere i solidi. Scartare il soluto e asciugare i solidi con una buona ventilazione.

Successivamente, sciogliere i solidi bianchi in 100 millilitri di THF. Eventuali solidi bianchi insolubili devono essere filtrati prima di procedere. Ora precipitare i solidi disciolti usando etere etilico freddo fresco.

Quindi utilizzare la filtrazione sottovuoto per raccogliere i solidi e lasciarli asciugare di nuovo. Ripeti questo processo due o tre volte, quindi metti i solidi bianchi in un forno di essiccazione sottovuoto per asciugarli completamente. La polvere bianca risultante è il prodotto finale: DF PEG terminato con benzaldeide.

Per incapsulare le cellule nell'idrogel per la coltivazione, sciogliere prima 0,44 grammi di DF PEG in due millilitri di terreno di coltura cellulare in una provetta da quattro millilitri. Agitare la miscela in una soluzione al 20% in peso. Quindi, sterilizzare la soluzione.

Caricalo in una siringa da 10 millilitri e pressalo attraverso un filtro a ritenzione batterica da 0,22 micron. Ora mescola 0,165 grammi di glicole-chitosano con quattro millilitri di terreno di coltura cellulare, usando un vortice per ottenere una soluzione di chitosano al 4% in peso. Quindi, sterilizzare la soluzione utilizzando un altro filtro a ritenzione batterica da 0,22 micron.

Successivamente, raccogli le cellule, come le cellule L929 usando la tripsina. Lavare le cellule raccolte e risospenderle in un terreno a 3,75 milioni di cellule per millilitro. Nella fase successiva le cellule vengono impiantate in una matrice 3D.

Seguire questi passaggi con precisione è fondamentale per produrre successo. Ora mescola 0,4 millilitri di sospensione cellulare con 0,4 millilitri di soluzione di chitosano usando un vortice. Pipettare questa miscela al centro di una capsula di Petri di due centimetri di diametro e versare 0,2 millilitri della soluzione DF PEG nella capsula.

Quindi, utilizzare un pipettaggio delicato per indurre la formazione dell'idrogel. Valutare la formazione dell'idrogel inclinando il piatto e osservando la viscosità della soluzione. Per testare l'iniettabilità delle cellule incapsulate, effettuare la stessa preparazione in una siringa da 10 millilitri.

Quindi, dopo che l'idrogel si è formato, espellere lentamente l'idrogel attraverso un ago calibro 48 nella capsula di Petri. Quindi, aggiungere un millilitro di terreno di coltura alla miscela di idrogel e cellule nella piastra e trasferire la piastra in un incubatore per la coltura. A giorni alterni, cambia i terreni, sovrapponendo la coltura cellulare di idrogel 3D.

Per preparare le cellule incapsulate negli idrogel per l'imaging, sciacquare prima gli idrogel con un millilitro di PBS due volte. Quindi, colorare gli idrogel con una soluzione di fluoresceina-diacetato e una soluzione di ioduro di propidio. Sovrapporre 0,5 millilitri di entrambe le soluzioni sull'idrogel e incubare l'idrogel per 15 minuti a temperatura ambiente.

Dopo la breve incubazione con le soluzioni coloranti, aspirare tutti i solventi. Ora osservate gli idrogel usando la microscopia confocale, con eccitazione a 488 nanometri per visualizzare le cellule viventi ed eccitazione a 543 nanometri per visualizzare le cellule morte. Raccogli pile di immagini con fette da due micron per convalidare la distribuzione delle cellule nell'idrogel.

Celle L929. Una tipica linea cellulare di topo in fibra di vetro con una rigidità tissutale in vivo di circa 5.600 Pascal è stata incapsulata in un idrogel. La loro vitalità è stata estremamente elevata durante tutto il processo di coltura e hanno raggiunto una notevole densità cellulare.

Dopo sette giorni di coltura nell'idrogel, il numero di cellule è aumentato del 200%Gli idrogel che sono stati espulsi sulla loro piastra di coltura cellulare attraverso un ago calibro 48 potrebbero auto-guarire per riformare un idrogel integrato dopo circa un'ora. Dopo sette giorni di coltura, anche queste cellule proliferavano drasticamente. Si sono potute trovare prove di eventi di fissione cellulare in cui alcune cellule apparivano divise in due.

Il test vivo-morto ha mostrato una vitalità molto elevata, dimostrando il successo della proliferazione cellulare nell'idrogel 3D dopo l'iniezione. Questo tasso di proliferazione cellulare era circa 3/4 di quello delle cellule non iniettate dopo sette giorni di coltura. Quindi, sebbene la forza di sheering durante l'iniezione abbia un effetto negativo misurabile, le cellule iniettate erano ancora piuttosto proliferative.

Dopo aver visto questo video dovresti sapere come preparare un idrogel autorigenerante e come utilizzare questo idrogel per la coltura cellulare 3D e come consegnare la cellula con questo idrogel. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro un'ora se eseguita correttamente. Seguendo la procedura migliore, è possibile eseguire altri metodi, come l'iniezione in vivo per la terapia cellulare o la somministrazione di farmaci.