Name: Un protocollo universale per gRNA su larga scala produzione di libreria da qualsiasi fonte di DNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Scopri il metodo CORALINA per generare librerie di gRNA su larga scala tramite digestione enzimatica del DNA purificato. Questo protocollo semplice e conveniente offre un'alternativa efficace alla sintesi tradizionale di oligonucleotidi.

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Gli autori piacerebbe ringraziare Dr. Stephan Beck e Prof. Dr. Magdalena Goetz per il loro contributo, guida e supporto nello sviluppo del metodo CORALINA, Maximilian Wiessbeck e Valentin Baumann per utili commenti. L'opera è stata sostenuta da DFG (STR 1385/1-1).

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

CORALINA può essere utilizzato per generare librerie gRNA su larga scala tramite digestione controllata nucleasi del DNA bersaglio e clonazione di frammenti incagliati doppi risultanti in massa. Inferenza statistica indica che molti più di 107 gRNA singole sequenze hanno già stati clonati con successo utilizzando il protocollo a mano9. CORALINA può essere personalizzato in vari modi. La scelta del modello del DNA definisce la regione di destinazione e la massima complessità della biblioteca generata. Usando questo protocollo, CORALINA librerie precedentemente sono state generate dall'essere umano e del mouse di DNA genomic9. Risultati rappresentativi presentati qui raffigurano la generazione di una libreria CORALINA da DNA purificato di BAC. Ulteriore personalizzazione può essere raggiunto dalla scelta delle sequenze di vettore e del linker espressione gRNA. In precedenza abbiamo testato tre diverse paia di lunghezze del linker per assembly Gibson con piccole variazioni in efficienza9.
Dovuto la loro origine dal DNA digerito alla rinfusa, protospacer di CORALINA gRNAs non sono solitamente esattamente 20 bp in lunghezza, ma Visualizza una distribuzione di lunghezza con una media che dipende da entrambi i parametri della digestione MNase nonché la dimensione dell'asportazione effettuata dal gel pagina s. l'esempio rappresentativo, mostrato in Figura 2B e C, raffigura frammenti con una lunghezza mediana tra 19 e 27 bp. Nella nostra esperienza, la lunghezza dei frammenti è conservata fedelmente dalla gRNA generato protospacer9. Mentre frammenti più breve di 20 bp dovrebbe essere evitato a causa di più alto tasso di fuori bersaglio di gRNAs risultante, frammenti più lunghi sono probabilmente molto meno di un problema per le applicazioni a valle, poiché è stato dimostrato che gRNAs con protospacers fintanto che 45 bp sono ancora funzionale9.
I due passaggi più critici nel protocollo CORALINA sono la selezione della dimensione dei frammenti MNase-digerito e procedura di clonazione. Generazione di frammenti che sono troppo brevi (ad es. media inferiore a 18 bp) o incorporazione di vettori di espressione vuota gRNA troppi renderà la libreria inutile. Pertanto, è importante ottimizzare la fase di digestione di MNase (Figura 2A), per monitorare l'asportazione (Figura 2B, C), controllare per digestione completa del backbone gRNA vettoriale e non compresi controlli di frammento in tutto il protocollo. Speciale cura deve anche essere adottate per preservare la rappresentazione della libreria gRNA. Un collo di bottiglia comune di generazione della libreria è in generale il trasferimento efficiente di plasmidi in batteri per l'amplificazione. Così, grandi quantità di batteri con eccellente competenza e un gran numero di eventi singoli elettroporazione sono necessari per il raggiungimento di un elevato numero di cloni gRNA.
Nuove strategie per la produzione di gRNA biblioteca sarà necessarie raccogliere tutte le potenzialità di approcci di screening basato su CRISPR per i prossimi decenni. C'è una forte domanda di metodi conveniente, semplice e personalizzabile per generare librerie su larga scala, un pre-requisito per fare lo screening favorevoli a un maggior numero di sistemi modello e differenti approcci di ingegneria basati su CRISPR. CORALINA sta fornendo un primo passo verso questo. Le possibilità di utilizzo sono molteplici, soprattutto per la produzione di librerie complete di genomi, cDNA derivati librerie di meno comuni sistemi modello, biblioteche altamente focalizzate e set-up sperimentale nel quale diverse proteine CRISPR (con differenti PAM requisiti) sono usati in combinazione.
A differenza di altri metodi, CORALINA genera tutte le possibili gRNAs dall'ingresso del DNA. Tuttavia, uno svantaggio del metodo è che gRNAs manca la sequenza desiderata di PAM sono anche inclusi nella libreria, una caratteristica che condivide con un secondo metodo enzimatico per la generazione della libreria gRNA, CRISPR-mangiare (tabella 1). La scelta del metodo ideale per la generazione della libreria gRNA dipende dalle specifiche dello screening programmato sperimentare, soprattutto la natura (genica, regolamentazione, intergenica) e dimensione dell'area di destinazione (singolo locus, più regioni, genoma). Vediamo un rialzo speciale utilizzando CORALINA quando un gran numero di non-codificazione o regioni regolatorie devono essere analizzati, se c'è informazioni di sequenza incompleta o inaffidabile (sistemi di modello esotico, miscugli di specie (ad es. microbiomi) o ottenuti sperimentalmente l'input), se si combinano diverse endonucleasi CRISPR o saturando l'analisi viene eseguita su un locus breve e definito (ad esempio rappresentato da BACs).

L'adattamento del sistema CRISPR/Cas9 batterico come un strumento per il targeting molecolare ha causato la più recente rivoluzione nella biologia molecolare. Mai è stato così facile da manipolare cromatina alle posizioni definite genomici. Applicazioni comuni di CRISPR includono genica mirata mutazioni1, genoma ingegneria2epigenome modifica3, attivazione trascrizionale e4il silenziamento genico. Un particolare vantaggio del sistema CRISPR è che le sue applicazioni non sono limitate a siti candidati ben studiato, come librerie di gRNA rendono meno prevenuti schermi possibile. Questi facilitano la scoperta di loci funzionali del genoma senza alcuna conoscenza sperimentale. Tuttavia, la costruzione della libreria gRNA è attualmente principalmente basata sulla sintesi di oligo-nucleotidi e ci sono opzioni limitate per l'acquisto di gRNA librerie che non sono di essere umano o regioni di origine o destinazione del mouse di fuori aprire lettura cornici. Così, anche se CRISPR schermi hanno già dimostrato incredibilmente potente5,6,7,8, appieno il loro potenziale non è ancora stato sfruttato.
Per superare la limitazione delle due strategie di gRNA classica generazione metodi sono stati recentemente sviluppati. Entrambi sono basati sulla digestione enzimatica controllata del DNA bersaglio, piuttosto che basarsi su sintesi del oligonucleotide personalizzato. Mentre CORALINA9 impiega nucleasi di micrococcal, il metodo alternativo solo attualmente disponibile, mangia-CRISPR10, fa uso degli enzimi di restrizione (HpaII, ScrFI, Bfaio e Mmeho). Cosa importante, entrambe le tecniche possono essere applicate a qualsiasi ingresso del DNA, che serve come fonte di gRNA protospacer sequenze. Mentre il metodo mangia-CRISPR utilizza una strategia per ridurre il numero di clonato gRNAs cui targeting siti non vengono seguite da PAM s. pyogenes richiesto (protospacer motivo adiacenti), che genera solo una piccola frazione di tutte le possibili gRNAs funzionale per una determinata regione. CORALINA, d'altra parte, è in grado di generare tutti i potenziali gRNAs per la sequenza di origine, ma incorpora anche un' più alta frazione di guide non funzionali. generazione della libreria gRNA attraverso l'attività della nucleasi controllata consente la produzione di librerie gRNA completa per tutte le specie, qualsiasi sistema Cas9-proteina o - effector in modo semplice ed economico. Inoltre, CORALINA è adattabile alla personalizzazione, come scelte appropriate di ingresso e il vettore di definiscono il tipo di libreria, la dimensione e il contenuto. Qui, un protocollo dettagliato è presentato che può essere utilizzato per la generazione di librerie complete gRNA provenienti da fonti diverse di DNA (Figura 1), tra cui cromosomi artificiali batterici (BACs) o genomic DNA9. I risultati rappresentativi che accompagna questo protocollo sono stati derivati applicando il protocollo CORALINA al DNA di BAC.

<table><tbody><tr><td>500 mM EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03777-10G</td><td>1.4., Inattivazione del</td></tr><tr><td>tampone per campioni di TBE ad alta densità</td> Mnase Novex <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6678</td><td>2.1.</td></tr><tr><td>Novex&reg; Gel TBE, 20%, 10 pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC6315BOX</td><td>2.1., gel preconfezionato al 20% PAGE</td></tr><tr><td>O'RangeRuler 5 bp DNA Ladder</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1303</td><td>2.1.</td></tr><tr><td>Novex&reg; TBE Running Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6675</td><td>2.1., PAGE gel running buffer</td></tr><tr><td>Bisturi monouso, sterile</td><td>VWR&nbsp;</td><td>233-5363&nbsp;</td><td>2.3., possono essere utilizzati altri reattivi equivalenti</td></tr><tr><td>Colorazione per acido nucleico SYBR Green I (1000x concentrato in DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td> S9430</td><td>2.3. +2.5., disponibile anche presso Thermo Fisher Scientific (S7563)</td></tr><tr><td>Fenolo ultrapuro:Cloroformio:Alcool isoamilico (25:24:1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15593-031</td><td>3.6.1. + 4.3., possono essere utilizzati altri reagenti equivalenti</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Sigma</td><td>10901393001</td><td>3.6.4., possono essere utilizzati altri reagenti equivalenti</td></tr><tr><td>3M Acetato di sodio, pH5.2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; R1181</td><td>3.6.4., possono essere utilizzati altri reagenti equivalenti</td></tr><tr><td>Etanolo&nbsp;</td><td></td><td></td><td>3.6.4. + 9.1.8.,</td></tr><tr><td>kit di smussamento rapido</td> per biologia molecolare<td>New England Biolabs</td><td>E1201</td><td>4.1.</td></tr><tr><td>acetato di ammomio</td><td>Sigma</td><td> A1542</td><td>3.1., possono essere utilizzati altri reagenti equivalenti</td></tr><tr><td>acetato di magnesio</td><td>Sigma</td><td> M5661</td><td>3.1., possono essere utilizzati altri reagenti equivalenti</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8.0)</td><td>VWR</td><td>&nbsp; MOLEM37465520 (o Promega V4231)</td><td>2.2. + 3.1., possono essere utilizzati altri reagenti equivalenti</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP beads</td><td>Beckman coultro</td><td>A63881</td><td>5.3. + 6.5.</td></tr><tr><td>Kit di estrazione su gel</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td>5.7.+ 7.1. +8.4., possono essere utilizzati altri reagenti</td></tr><tr><td>equivalenti concentrato T4 DNA ligasi New</td><td>England Biolabs</td><td>&nbsp; M0202T</td><td>6.1.+ 8.1.2.</td></tr><tr><td>Amplificatore lungo Taq 2X Master Mix&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0287S</td><td>6.3.</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix con tampone HF New</td><td>England Biolabs</td><td>M0531S</td><td>5.1. + 6.6., possono essere utilizzati altri reagenti equivalenti</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104S</td><td>5.4.1.&nbsp;</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td>5.4.2.</td></tr><tr><td>AgeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0552S</td><td>8.2.1.</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>93362</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>2M MgCl</td><td>Sigma</td><td>93362</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>dGTP,dATP, dCTP, dTTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigam</td><td> DTT-RO</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>PEG-8000&nbsp;</td><td>Sigma</td><td> P5413</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma</td><td> N6522</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>Esonucleasi T5</td><td>New England Biolabs</td><td>M0363S</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerasi&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>Taq DNA ligasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0208L</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>rSAP</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371S</td><td>8.3.1.</td></tr><tr><td>Cellule competenti TG1</td><td>Lucigen</td><td>60502-1</td><td>9.1.</td></tr><tr><td>Cuvette per elettroporazione con gap di 1 mm&nbsp;</td><td>VWR</td><td>732-2267&nbsp;</td><td>10.2.Piastra</td></tr> per <tr><td>biotest (polistirene, 245 mm x 245 mm x 25 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DIS-988-010M&nbsp;</td><td>9.4.NaCl</td></tr> <tr><td></td><td>Sigma</td><td>S7653&nbsp;</td><td></td></tr><tr>9.3.Bacto-triptone<td></td> <td>BD</td><td>211705</td><td>9.3.</td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>BD</td><td>212750</td><td>9.3.</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td> A1296</td><td>9.4.</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma</td><td> G5516</td><td>9.17.</td></tr><tr><td>MNAse</td><td>New England Biolabs</td><td>M0247S</td><td>1.1.</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>in tutto</td></tr><tr><td>Micropulser</td><td>Biorad</td><td>165-2100</td><td>10.2.</td></tr><tr><td>Cuvette per elettroporazione</td><td>Biorad</td><td>732-2267&nbsp;</td><td>10.2.250</td></tr> <tr><td>ml provette da centrifuga</td><td>Corning</td><td>430776</td><td>9.1-9.9.</td></tr></tbody></table>

un protocollo universale per grna su larga scala produzione di libreria da qualsiasi fonte di dna

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

La popolarità del sistema CRISPR/Cas9 per genoma sia epigenome ingegneria deriva dalla sua semplicità e adattabilità. Un effettore (le nucleasi Cas9 o una proteina di fusione di nucleasi-morti dCas9) è mirato a un sito specifico nel genoma di un piccolo RNA sintetico noto come guida RNA, o gRNA. La natura bilaterale del sistema CRISPR consente l'utilizzo di approcci di screening poiché librerie plasmide contenente cassette di espressione di migliaia di singoli gRNAs possono essere utilizzati per interrogare molti siti diversi in un singolo esperimento.
Ad oggi, gRNA sequenze per la costruzione di librerie sono state generate quasi esclusivamente di sintesi del oligonucleotide, che limita la complessità realizzabile delle sequenze nella libreria ed è relativamente costosa. Qui, un dettagliato protocollo per CORALINA (generazione della libreria completa gRNA attraverso attività controllata nucleasi), un semplice e conveniente metodo per la generazione di librerie di gRNA altamente complessi basati sulla digestione enzimatica di input del DNA, è descritto. Poiché le librerie CORALINA possono essere generate da qualsiasi fonte di DNA, un sacco di opzioni di personalizzazione esiste, permettendo una grande varietà di schermi basati su CRISPR.

Utilizzando il protocollo a portata di mano, librerie gRNA CORALINA sono state generate da umani e mouse genomic DNA9 e BAC del DNA (Figura 1). Per produrre frammenti di DNA ingresso adatto per clonaggio in vettori di espressione gRNA, condizioni ottimali per digestione controllata nuclease devono essere determinati. Un risultato tipico per l'ottimizzazione della digestione della nucleasi di micrococcal è raffigurato nella Figura 2A. Una quantità insufficiente di nucleasi (0,1, 2, 3, 4, 4.5 o 5 unità) produce nessun evidenti prodotti della gamma taglia desiderata (10-100 bp) e 5.5-7.5 unità prodotto ancora frammenti che sono in media troppo a lungo. Maggiori quantità di enzima (50 unità) portare a eccessiva degradazione dell'input del DNA dopo 10 min. Di conseguenza, un importo intermedio è stato scelto (10 unità). Il digest è stato scalato per produrre abbastanza digerito frammenti per purificazione successiva e la clonazione (Figura 2B). Mentre si raccomanda di selezionare ciecamente frammenti di DNA di dimensioni e fare affidamento solo sulla scaletta del DNA per l'orientamento per ridurre al minimo l'esposizione dei frammenti del DNA a luce UV, gel può essere macchiato in seguito per il controllo di qualità di taglio e di digestione. Figura 2B Mostra un esempio rappresentativo di un gel di pagina da cui DNA frammenti tra 20 e 30 bp sono stati asportati. Gel purificato MNase frammenti sono stati caricati su un 20% di gel di PAGE per controllare la selezione della dimensione successo e purificazione dei frammenti MNase-digerito (Figura 2). Il protocollo a portata di mano è compatibile con l'uso di sequenze personalizzate del linker, che permette di clonare i frammenti MNase-digerito in vettori di espressione gRNA di scelta. Qui, gRNA-PLKO9 è stato usato come spina dorsale. Il linker è amplificato dal vettore di espressione gRNA utilizzando standard di PCR. Figura 2D raffigura un esempio rappresentativo di sequenze amplificate del linker privo di ulteriori, non corretto o nessun ampliconi di modello. Successivamente, del linker ampliconi sono digeriti con enzimi di restrizione per garantire linker sono legati sui frammenti MNase-digerito con l'orientamento corretto. Figura 2D Mostra gel di agarosio di linkers 5' e 3' prima e dopo digestione con HindIII e SacII rispettivamente, che indica la digestione completa del linker per il predetto 637 e 295 bp. La parte destra dell'immagine gel documenta l'asportazione dei frammenti digeriti del linker. Segue gel estrazione di linkers digerito, il passo successivo nel protocollo è la legatura di linkers ai frammenti digeriti MNase fine-riparato. Poiché sequenze del linker vengono generati mediante PCR utilizzando primers unphosphorylated, auto-legatura di linkers non dovrebbe verificarsi. Solo i frammenti di DNA digerito MNase fine-riparate forniscono i gruppi fosfato necessari per la legatura. A seguito di traduzione di nick, il prodotto di legatura è amplificato dalla PCR. Al fine di evitare un'eccessiva polarizzazione di amplificazione PCR che poteva deformare la rappresentazione delle sequenze gRNA nella libreria, l'amplificazione è limitata a meno di 20 cicli in totale. A seguito di PCR, i prodotti di amplificazione sono difficili da visualizzare sui gel dell'agarosi. Controllo separato PCRs con 32 cicli vengono pertanto eseguite per rilevare i prodotti (ma non vengono utilizzati per la preparazione di biblioteca). Risultati da questo controllo PCR sono mostrati in Figura 2E. Questo consente di ottimizzare le reazioni di legatura e di garantire reazioni sono privi di manufatti PCR, che a volte si verificano in "nessun controllo di frammenti" (NFC). Figura 2E dimostra l'amplicone desiderata (5' linker + frammento di DNA + 3' linker, lunghezza: 869 bp) seguendo l'amplificazione delle reazioni di legatura utilizzando equimolari (1:1) rapporti tra frammenti e sequenze del linker.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig1.jpg"> Figura 1 : Suggerito timeline per la preparazione di una libreria di gRNA. CORALINA offre una strategia semplice e conveniente per la generazione di librerie di gRNA completa da una pletora di diverse fonti di DNA da alcun organismo. Il protocollo a portata di mano può essere portato a compimento nel corso di una settimana lavorativa. Generazione del linker possa essere eseguite in parallelo con fine-riparazione del DNA. Preparazione di electrocompetent batteri prende due giorni e comprende una fase di crescita durante la notte e pertanto deve essere avviato prima del montaggio le reazioni sono impostate. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig2.jpg"> Figura 2 : Fasi critiche durante il protocollo. (A) Controlled digestione del DNA di BAC consente la generazione di frammenti di dimensioni diverse. Qui è illustrata l'ottimizzazione della digestione MNase. DNA di BAC purificato è stata trattata con diverse quantità di MNase per 10 min. 10 U di MNase generare frammenti di DNA della lunghezza desiderata (20-30 bp). (B) taglia selezione di frammenti tra 20 e 30 bp usando l'asportazione dal gel di poliacrilammide. DNA di BAC purificato è stata trattata con 10 U di MNase per 10 min. L'immagine è stata registrata a seguito dell'asportazione. (C) controllo di qualità dei frammenti purificati di gel. Dopo purificazione del gel, 1/6th della MNase purificata frammenti è stato caricato su un 20% di gel di PAGE per controllare la selezione della dimensione successo e purificazione. (D) amplificazione delle sequenze del linker per assemblaggio e degli enzimi di limitazione nella digestione del linker affinché la clonazione direzionale. 5' e 3' linker sono stati amplificati e tagliare con HindIII e Silvio, rispettivamente. Controlli del modello di no (NTC) sono stati inclusi per controllo per manufatti PCR e contaminazione da DNA. Sinistra: applicazione di esempio analitico; destra: applicazione di esempio preparativa. Immagine è stata registrata dopo l'asportazione del gel. (E) legatura successo di linkers di frammenti di DNA possa essere analizzata usando la PCR con un aumento del numero di cicli di PCR (32) e controllato da non eseguire controlli del modello con H2O (NTC) o utilizzando le NTC dal passaggio precedente nick traduzione come input (NTC NT)). È importante includere un nessun frammento controllo (NFC), che è un'amplificazione da una legatura e la reazione di traduzione di nick da cui sono stati omessi i frammenti di MNase. Solo i campioni in cui MNase frammenti sono stati combinati con linker DNA producono l'amplicone previsto (869 bp). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Metodi per la generazione di librerie di gRNA su larga scala dovrebbero essere semplice, efficiente e conveniente. Descriviamo un protocollo per la produzione di gRNA librerie basate su digestione enzimatica del DNA bersaglio. Questo metodo, CORALINA (generazione della libreria completa gRNA attraverso attività controllata nucleasi) presenta un'alternativa alla sintesi del oligonucleotide personalizzato costosi.

Un protocollo universale per gRNA su larga scala produzione di libreria da qualsiasi fonte di DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

L'obiettivo generale di questo metodo è costruire librerie complete di RNA guida a partire da DNA purificato proveniente da qualsiasi fonte. Le librerie di gRNA sono collezioni di plasmidi utilizzate in schermate basate su CRISPR. Il metodo CORALINA utilizza la digestione enzimatica del DNA purificato per clonare i frammenti risultanti in un vettore di libreria di RNA guida.Il vantaggio principale di questa tecnica è che produce tutte le possibili RNA guida a partire dalla sequenza in ingresso ed è molto conveniente dal punto di vista economico. Sebbene questo video illustri la protezione di una libreria CORALINA da un cromosoma artificiale batterico, questo metodo può in linea di principio essere applicato a qualsiasi tipo di DNA in ingresso proveniente da qualsiasi organismo. È necessario effettuare un'ottimizzazione della digestione con nuclease micrococcalica per ogni nuovo lotto di nuclease micrococcalica.Impostare quanto segue per ogni reazione: un microlitro di tampone 10x per la micrococca nucleasi, albumina sierica bovina 1x, un microgrammo di DNA bersaglio, un microlitro di micrococca nucleasi e acqua fino a un volume finale di 10 microlitri. Incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti.Inattivare immediatamente l'enzima aggiungendo un microlitro di EGTA 500 millimolare. Aggiungere il buffer campione con colorante per la corsa elettroforetica ai campioni di DNA e caricare un microgrammo di DNA per pozzetto in un gel di poliacrilamide al 20%. Caricare una scala di DNA appropriata per la determinazione delle dimensioni.Eseguire l'elettroforesi in tampone di corsa 1x TBE a 150 volt per circa 1,5 ore o fino a quando il fronte inferiore del colorante raggiunge l'estremit&agrave; inferiore del gel. Colorare il gel utilizzando un colorante ultrasensibile per acidi nucleici e visualizzare sotto luce UV. In questo esempio, la concentrazione ottimale di nuclease micrococcalica per digerire il DNA fino a frammenti di 20-30 paia di basi &egrave; risultata di 10 unit&agrave;.Utilizzare questa concentrazione ottimale di nucleasi micrococcaica per digerire da 10 a 12 microgrammi di DNA bersaglio nello stesso modo illustrato per le reazioni di ottimizzazione. Dopo aver separato i frammenti di DNA mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide (PAGE), utilizzare un bisturi sterile per tagliare il gel accanto alla corsia del marcatore e colorare soltanto la parte del gel contenente la scala molecolare con un nuovo tampone di corsa TBE 1x contenente un colorante ultrasensibile per acidi nucleici. Visualizzare la scala di DNA e utilizzare una lametta per escindere i frammenti di DNA digeriti con la nucleasi micrococcaica con dimensioni comprese tra circa 18 e 30 paia di basi.Trasferire il frammento di gel in una provetta per microcentrifuga. Colorare il resto del gel con un colorante per acidi nucleici come mostrato in precedenza. Esporre il gel alla luce UV e acquisire un'immagine come documento del passaggio di escissione del gel.Iniziare la procedura utilizzando una punta di pipetta sterile per schiacciare il frammento di gel asportato contro la parete del tubo da microcentrifuga. Aggiungere due volumi del gel di tampone di solubilizzazione PAGE e incubare a 37 gradi Celsius su una piattaforma rotante per 16 ore. Il giorno successivo, centrifugare il campione in una microcentrifuga alla velocità massima per un minuto.Trasferire i soprannatanti in un nuovo tubo da microcentrifuga avendo cura di non trasferire frammenti di gel schiacciati. Aggiungere 0,5 volumi di buffer di solubilizzazione per PAGE al pellet di gel, vortexare e ripetere la centrifugazione. Combinare i soprannatanti ed estrarre i frammenti di DNA utilizzando un metodo standard di estrazione fenolo-cloroformio come descritto nel protocollo testuale.In parallelo all'isolamento dei frammenti di DNA, amplificare i linker dal vettore di espressione dell'RNA guida mediante PCR standard. Per garantire il clonaggio direzionale, i linker vengono quindi digeriti con gli enzimi di restrizione appropriati come descritto nel protocollo testuale. Eseguire la digestione con enzimi di restrizione dei linker su un gel di agarosio all'uno percento.Escidere le bande corrette e purificare il DNA dai frammenti di gel escisi utilizzando un kit di estrazione da gel. Un kit per la riparazione dei capi (blunting kit) viene utilizzato per la reazione di riparazione dei capi. Aggiungere quanto segue in una provetta microcentrifuga.10 microlitri di DNA purificato, 1,5 microlitri di buffer per l'appiattimento 10x, 1,5 microlitri di una miscela di dNTP da un millimolare, 1,4 microlitri di acqua e 0,6 microlitri di enzima per l'appiattimento. Incubare a 22 gradi Celsius per 30 minuti, quindi attivare termicamente l'enzima mediante incubazione a 70 gradi Celsius per 10 minuti. Aggiungere 85 microlitri di acqua ed eseguire una pulizia della reazione come descritto nel protocollo testuale.Impostare una reazione di ligazione di 14 microlitri utilizzando quantità molari equimolari di frammenti digeriti e riparati con nuclease micrococcalica e sequenze di linker come descritto nel protocollo testuale. Dopo la traduzione delle fessure, il prodotto di ligazione viene amplificato mediante PCR. Per separare i frammenti di nuclease micrococcalica con il linker cinque primi e tre primi correttamente attaccato da frammenti con due linker cinque primi o due linker tre primi, combinare tutte le reazioni PCR di 15 cicli, aggiungere il colorante di carico per DNA ed eseguire su un gel di agarosio allo 0,8%.Escindere la banda principale a 869 paia di basi e purificare il DNA utilizzando un kit di estrazione da gel. Quantificare la quantità di DNA mediante spettrofotometro. Successivamente, clonare i frammenti amplificati per PCR nel vettore di espressione dell'RNA guida mediante assemblaggio Gibson come descritto nel protocollo testuale.Per iniziare questa procedura, aliquotare il costrutto purificato del vettore con inserto in provette PCR sterili e preraffreddate e mantenerle sul ghiaccio. Raffreddare sul ghiaccio cuvette per elettroporazione con interstizio di un millimetro. Aggiungere direttamente 25 microlitri di cellule TG1 appena preparate a un'aliquota di DNA e trasferire immediatamente la miscela in una cuvetta per elettroporazione.Battere leggermente o toccare la cuvetta per assicurarsi che la sospensione di cellule e DNA sia distribuita uniformemente lungo tutta la lunghezza della camera della cuvetta, senza bolle d'aria intrappolate. Posizionare la cuvetta nella camera dello strumento ed avviare il programma di elettroporazione appropriato. Aggiungere immediatamente 475 microlitri di terreno 2TY a temperatura ambiente alla cuvetta.Trasferire i batteri elettroporati in un tubo da 50 millilitri. Ripetere le singole elettroporazioni, raccogliendo tutte le cellule trasformate con una stessa libreria in un unico tubo da 50 millilitri e documentare il volume totale. Per stimare il numero totale di colonie dell'intera libreria, piastrare una piccola quantità definita di batteri trasformati con la libreria su una piastra di agar da 10 centimetri con la selezione antibiotica appropriata.Per ridurre il volume del residuo di batteri, centrifugare a circa 4.000 g per 10 minuti o fino a quando si è formata una pastella visibile e il sopranatante appare limpido. Rimuovere tutto il sopranatante tranne pochi millilitri e risospendere le cellule. Piastrare i batteri su piastre per saggio biologico rivestite con agar 2TY contenente la selezione antibiotica appropriata.Stendere un volume appropriato della reazione di elettroporazione con controllo pUC19 su una piastra aggiuntiva in agar da 10 centimetri contenente l'antibiotico selezionato. Incubare le piastre in agar a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Il giorno successivo, contare il numero di colonie sulle piastre di controllo per stimare le unità formanti colonie per microgrammo di DNA nei batteri e per valutare la complessità della libreria.Infine, raschiare i batteri dalla piastra per l'estrazione del DNA plasmidico. Dopo la purificazione su gel, 1/6 dei frammenti di nucleasi micrococcaica purificati è stato caricato su un gel di PAGE al 20% per confermare il corretto dimensionamento e la purificazione. Gli ampliconi dei linker sono stati digeriti con enzimi di restrizione per verificare che i linker siano stati legati ai frammenti digeriti dalla nucleasi micrococcaica nell'orientamento corretto.Il lato sinistro di questa immagine rappresentativa del gel mostra i linker 5' e 3' prima e dopo la digestione con HindIII e SacII rispettivamente, indicando una digestione completa dei linker nei frammenti previsti di 637 paia di basi e 295 paia di basi. Il lato destro dell'immagine del gel documenta l'escissione dei frammenti di linker digeriti. La ligazione riuscita dei linker ai frammenti di DNA è stata analizzata mediante PCR con un numero aumentato di cicli di PCR.I controlli inclusi erano un controllo senza stampo, che utilizzava il controllo senza stampo del precedente passaggio di traduzione dei tagli come input, e un controllo senza frammenti di nucleasi micrococca. Solo i campioni in cui i frammenti di nucleasi micrococca erano stati combinati con il DNA linker hanno prodotto l'amplicone atteso di 869 paia di basi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque giorni se effettuata correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante mantenere la complessità della libreria ed eseguire altre reazioni di controllo. Dopo aver visto questo video, ora si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare una libreria di RNA guida per schermate basate su CRISPR suddividendo il DNA in frammenti piccoli e clonando questi all'interno del vettore scheletro della libreria.

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