Un protocollo universale per gRNA su larga scala produzione di libreria da qualsiasi fonte di DNA

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di costruire librerie complete di RNA guida da DNA purificato da qualsiasi fonte. Le librerie di gRNA sono raccolte di plasmidi utilizzate negli screening basati su CRISPR. Il metodo CORALINA utilizza la digestione enzimatica del DNA purificato per clonare i frammenti risultanti in una spina dorsale di una libreria di RNA guida.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che produce tutti i possibili RNA guida dalla sequenza di input ed è molto conveniente. Sebbene questo video dimostri la protezione di una libreria CORALINA da un cromosoma artificiale batterico, questo metodo può in linea di principio essere applicato a qualsiasi tipo di DNA in ingresso da qualsiasi organismo. Un'ottimizzazione della digestione della nucleasi micrococcica deve essere eseguita per ogni nuovo lotto di nucleasi micrococcica.

Imposta quanto segue per ogni reazione. Un microlitro di 10x tampone nucleasi micrococcica, 1x albumina sierica bovina, un microgrammo di DNA bersaglio, un microlitro di nucleasi micrococcica e acqua fino a 10 microlitri. Incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti.

Inattivare immediatamente l'enzima aggiungendo un microlitro di EGTA da 500 millimolari. Aggiungere un tampone campione con colorante caricante in gel ai campioni di DNA e caricare un microgrammo di DNA per pozzetto in un gel di poliacrilammide al 20%. Caricare una scala del DNA appropriata per il dimensionamento.

Far funzionare il gel in 1 tampone di corsa TBE a 150 volt per circa 1,5 ore o fino a quando il fronte inferiore del colorante raggiunge l'estremità inferiore del gel. Colorare il gel utilizzando un colorante di acido nucleico ultrasensibile e visualizzare sotto la luce UV. In questo esempio, la concentrazione ottimale di nucleasi micrococcica per digerire il DNA fino a 20-30 paia di basi era di 10 unità.

Utilizzare questa concentrazione ottimale di nucleasi micrococcica per digerire da 10 a 12 microgrammi di DNA bersaglio nello stesso modo dimostrato per le reazioni di ottimizzazione. Dopo aver separato i frammenti di DNA mediante PAGE, utilizzare un bisturi sterile per tagliare il gel vicino alla corsia di marcatura e colorare solo la parte del gel contenente la scala con un tampone di corsa fresco 1x TBE contenente una colorazione di acido nucleico ultrasensibile. Visualizza la scala del DNA e usa una lama di rasoio per asportare frammenti di DNA digeriti con nucleasi micrococcica nell'intervallo di dimensioni comprese tra circa 18 e 30 coppie di basi.

Trasferire la fetta di gel in una provetta da microcentrifuga. Colora il resto del gel con la macchia di acido nucleico come mostrato in precedenza. Esporre il gel alla luce UV e acquisire un'immagine come registrazione della fase di escissione del gel.

Iniziare questa procedura utilizzando una punta di pipetta sterile per schiacciare la fetta di gel asportata contro la parete della provetta per microcentrifuga. Aggiungere due volumi di gel di tampone di solubilizzazione PAGE e incubare a 37 gradi Celsius su una piattaforma rotante per 16 ore. Il giorno successivo, centrifugare il campione in una microcentrifuga alla massima velocità per un minuto.

Trasferire i surnatanti in una nuova provetta da microcentrifuga facendo attenzione a non trasferire pezzi di gel frantumati. Aggiungere 0,5 volumi di tampone di solubilizzazione PAGE al pellet di gel, vorticare e ripetere la centrifugazione. Combina i surnatanti ed estrai i frammenti di DNA utilizzando un metodo di estrazione standard fenolo-cloroformio come descritto nel protocollo di testo.

Parallelamente all'isolamento dei frammenti di DNA, amplificare i linker dal vettore di espressione dell'RNA guida utilizzando la PCR standard. Per garantire la clonazione direzionale, i linker vengono quindi digeriti con gli enzimi di restrizione appropriati come descritto nel protocollo di testo. Eseguire l'enzima di restrizione digestato dei linker su un gel di agarosio all'uno per cento.

Asportare le bande corrette e purificare il DNA dai pezzi di gel asportati utilizzando un kit di estrazione del gel. Per la reazione di riparazione finale viene utilizzato un kit di smussamento del DNA. Aggiungere quanto segue in un tubo di microfuga.

10 microlitri di DNA purificato, 1,5 microlitri di tampone smussante 10x, 1,5 microlitri di una miscela dNTP millimolare, 1,4 microlitri di acqua e 0,6 microlitri di enzima smussante. Incubare a 22 gradi Celsius per 30 minuti, quindi riscaldare e attivare l'enzima mediante incubazione a 70 gradi Celsius per 10 minuti. Aggiungere 85 microlitri di acqua ed eseguire una pulizia della reazione come descritto nel protocollo di testo.

Impostare una reazione di legatura da 14 microlitri utilizzando quantità molari uguali di frammenti di nucleasi micrococcica digeriti e riparati e sequenze di linker come descritto nel protocollo di testo. Dopo la traduzione del nick, il prodotto della legatura viene amplificato mediante PCR. Per separare i frammenti di nucleasi micrococcica con i cinque e i tre linker primi correttamente attaccati dai frammenti con due cinque primi o due tre primi linker, combinare tutte le reazioni PCR a 15 cicli, aggiungere il colorante di caricamento del DNA ed eseguire su un gel di agarosio allo 0,8%.

Asportare la banda prominente a 869 paia di basi e purificare il DNA utilizzando un kit di estrazione con gel. Quantificare la quantità di DNA utilizzando uno spettrofotometro. Successivamente, clonare i frammenti amplificati dalla PCR nel vettore di espressione dell'RNA guida mediante l'assemblaggio di Gibson come dettagliato nel protocollo di testo.

Per iniziare questa procedura, aliquotare l'inserto del vettore purificato costruirlo in provette PCR sterili e pre-raffreddate e mantenerlo in ghiaccio. Raffreddare le cuvette per elettroporazione con un millimetro di distanza sul ghiaccio. Aggiungere 25 microlitri di cellule TG1 appena preparate direttamente a un'aliquota di DNA e trasferire immediatamente la miscela in una cuvetta per elettroporazione.

Muovi o picchietta la cuvetta per assicurarti che le cellule e la miscela di DNA siano distribuite lungo la lunghezza della camera della cuvetta senza aria intrappolata o bolle. Posizionare la cuvetta nella camera del vetrino e avviare il programma di elettroporazione appropriato. Aggiungere immediatamente 475 microlitri di 2TY a temperatura ambiente alla cuvetta.

Trasferire i batteri elettroporati in una provetta da 50 millilitri. Ripetere le singole elettroporzioni, raccogliere tutte le cellule trasformate con una libreria in una provetta da 50 millilitri e documentare il volume totale. Per stimare il numero totale di colonie per l'intera libreria, è stato possibile placcare una piccola quantità definita di batteri trasformati con la libreria su una piastra di agar da 10 centimetri con l'appropriata selezione di antibiotici.

Per ridurre il volume del resto dei batteri, centrifugare a circa 4.000 g per 10 minuti o fino a quando non si è formata una tavolozza visibile e il surnatante appare chiaro. Rimuovere tutti i millilitri di surnatante e risospendere le cellule. Placcare i batteri su piastre di biodosaggio rivestite di agar 2TY contenenti la selezione di antibiotici appropriata.

Distribuire un volume appropriato della reazione di elettroporazione di controllo pUC19 su un'ulteriore piastra di agar da 10 centimetri con un'appropriata selezione di antibiotici. Incubare le piastre di agar a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, contare il numero di colonie sulle piastre controllate per stimare l'unità di formazione delle colonie per microgrammo di DNA per i batteri, nonché la complessità della libreria.

Infine, raschiare i batteri dalla piastra per l'estrazione del DNA plasmidico. Dopo la purificazione con gel, 1/6 dei frammenti di nucleasi micrococcica purificati sono stati caricati su un gel da 20% PAGE per confermare l'avvenuta selezione delle dimensioni e la purificazione. Gli ampliconi dei linker sono stati digeriti con enzimi di restrizione per garantire che i linker siano legati ai frammenti digeriti della nucleasi micrococcica con l'orientamento corretto.

Il lato sinistro di questa immagine rappresentativa del gel mostra cinque linker primi e tre primari prima e dopo la digestione rispettivamente con HindIII e SacII, indicando la completa digestione dei linker alle 637 coppie di basi predittive e alle 295 coppie di basi. Il lato destro dell'immagine del gel documenta l'escissione dei frammenti del linker digeriti. La legatura riuscita dei linker ai frammenti di DNA è stata analizzata utilizzando la PCR con un numero maggiore di cicli di PCR.

I controlli inclusi erano un controllo no template che utilizzava il controllo no template della precedente fase di traduzione del nick come input e un controllo no micrococcal nuclease fragment. Solo i campioni in cui i frammenti di nucleasi micrococcica sono stati combinati con il DNA linker hanno prodotto l'amplicone atteso di 869 coppie di basi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque giorni se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere la complessità della libreria ed eseguire altre reazioni di controllo. Dopo aver visto questo video, ora dovresti avere una buona comprensione di come generare una libreria di RNA guida per schermi basati su CRISPR tagliando il DNA in piccoli pezzi e clonandoli nella spina dorsale del vettore della libreria.