Applicazione di Micro-irradiazione del Laser per l'esame di Single e Double Strand Break Repair in cellule di mammifero

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indurre un danno al DNA in una regione subnucleare di una cellula utilizzando un laser per microscopia a fluorescenza confocale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla riparazione del DNA, come ad esempio il modo in cui le proteine vengono reclutate e trattenute nei siti di danno al DNA. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la visualizzazione in tempo reale della proteina di interesse in modo da poter costruire il profilo di reclutamento e ritenzione.

Iniziare questa procedura posizionando un vetrino contenente le cellule di interesse in un incubatore superiore dello stadio mantenuto a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Registra i campi immagine utilizzando un tavolino per microscopio automatizzato codificato. Seleziona una caratteristica riconoscibile del recipiente di coltura, come la barriera tra i pozzi.

Raccogli un'immagine e registra la posizione X-Y. Ciò consentirà l'allineamento e la registrazione delle posizioni X-Y dei campi selezionati dopo la preparazione del campione. Una volta completata la registrazione dell'immagine, selezionare un campo per la micro-irradiazione e mettere a fuoco il campione.

Per le cellule che esprimono proteine marcate in fluorescenza, selezionare il piano focale con la massima sezione d'urto nucleare nel canale fluorescente di interesse. Concentrarsi sulla sezione d'urto massima del nucleo è fondamentale perché assicura che il punto focale sia centrato sul nucleo per monitorare il reclutamento della proteina di interesse nel sito del danno indotto. Seleziona una caratteristica chiara all'interno del nucleo, come un nucleolo, e sposta il piano focale su e giù mentre osservi questo cambiamento di aspetto.

Il vero piano focale si troverà all'interno della transizione dalla luce al buio. Per mettere a fuoco il campione, selezionate il piano focale in cui la funzione selezionata presenta il contrasto più netto. Il passo successivo è registrare la posizione del campo di interesse.

Crea una regione di interesse quadrata di tre pixel per tre, o ROI, all'interno del software del microscopio. Posizionare questa ROI sul nucleo di una cellula da danneggiare e impostare questa ROI in modo che sia la ROI danneggiata. Raccogli un'immagine pre-danno, inclusa la posizione del ROI del danno.

Acquisire un'immagine contenente campo luminoso nel canale della florescenza per la proteina di interesse. Le celle sono ora pronte per la micro-irradiazione laser. Per questa dimostrazione, il laser a 405 nanometri verrà utilizzato al 100% della potenza.

La dose laser a 405 nanometri viene controllata modulando la velocità di scansione ed eseguendo una scansione del ROI del danno selezionato. In questo esperimento, utilizzare otto e 0,5 fotogrammi al secondo per la micro-irradiazione a 405 nanometri. La selezione della potenza laser appropriata per danneggiare le cellule è fondamentale per separare i diversi percorsi di riparazione del DNA.

Esegui l'acquisizione di immagini in time-lapse del campo luminoso e dei canali di florescenza dopo il danno. Regolare la durata e la frequenza del time-lapse per ottimizzare la raccolta dei dati, catturando idealmente l'accumulo della proteina fluorescente al ROI del danno e la sua dissociazione nel corso del tempo dell'esperimento. Al termine del corso temporale, selezionare un nuovo campo di cellule per il danno e continuare la micro-irradiazione e l'imaging time-lapse fino a raggiungere il numero desiderato di cellule danneggiate.

Si consiglia da 10 a 25 celle per ogni condizione selezionata. Per aumentare il numero complessivo di cellule per l'analisi in immunofluorescenza, danneggiare i campi aggiuntivi all'interno del recipiente di coltura per generare un andamento temporale multicampo della risposta post-danno. Registrare la posizione X-Y di ciascun campo e l'ora in cui si è verificato il danno.

Le celle possono essere riparate immediatamente dopo il danno o lasciate riparare per incrementi di tempo selezionati prima del fissaggio. Per iniziare questa analisi, aprire le immagini acquisite in un'applicazione di analisi delle immagini come NIS-Elements. Per ogni cellula da misurare, generare prima un ROI di riferimento che rappresenti il nucleo.

Utilizzare un algoritmo di soglia sul segnale di florescenza che contiene i pixel che compongono il nucleo, quindi convertire quest'area in una ROI. Successivamente, crea un ROI di pixel sei per sei e posizionalo sopra il ROI del danno. Questo ROI maggiore è ora il ROI del danno per l'analisi.

Per ogni cella da misurare, registrare l'intensità media della florescenza per il ROI di riferimento e di danno. Per ogni fotogramma dell'andamento temporale, regolare la ROI di riferimento per garantire che l'area nucleare sia coperta accuratamente dalla ROI e regolare la ROI del danno per garantire che il punto danneggiato sia coperto. Registra l'intensità media di fluorescenza del segnale fluorescente all'interno di ciascuna ROI per ogni fotogramma dell'andamento temporale.

Per ogni cella, normalizzare l'intensità media della fluorescenza ROI del danno a quella della ROI di riferimento corrispondente in ogni fotogramma del time-lapse. Qui, l'intensità media della fluorescenza nucleare viene utilizzata come ROI di riferimento e la normalizzazione viene eseguita sottraendo l'intensità media della fluorescenza del ROI di riferimento dall'intensità della fluorescenza media del ROI del danno. Ripetere la normalizzazione per tutte le cellule danneggiate e per almeno due cellule di controllo non danneggiate.

Infine, il grafico ha normalizzato i valori di intensità nel tempo per mostrare i cambiamenti nelle dinamiche di reclutamento in funzione del trattamento sperimentale. Le cellule che esprimono stabilmente XRCC1-GFP sono state irradiate e sottoposte a imaging prima e dopo l'induzione del danno. È stato osservato il reclutamento di XRCC1-GFP per il ROI del danno e sono state misurate le dinamiche del reclutamento.

La formazione di rotture a doppio filamento è stata esaminata utilizzando due marcatori. Per entrambi i marcatori, la stimolazione a basse dosi di due secondi a 355 nanometri non suscita alcuna risposta a cinque minuti e 20 minuti e una risposta debole e variabile a 10 minuti dopo l'irradiazione. La micro-irradiazione ad alte dosi di 10 secondi a 355 nanometri induce un aumento del segnale fluorescente all'interno del ROI del danno a cinque, 10 e 20 minuti dopo l'irradiazione che si riduce a 40 minuti.

Questi risultati indicano che i marcatori di rottura del doppio filamento del DNA rispondono alla micro-irradiazione a 355 nanometri in modo dose-dipendente. Al contrario, la stimolazione laser a 405 nanometri ha provocato un accumulo significativo di entrambi i marcatori all'interno del ROI del danno, indipendentemente dalla dose applicata. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa quattro ore per 10 celle se viene eseguita correttamente.

Durante l'esecuzione di questa tecnica, è importante adattare la lunghezza d'onda del laser e la potenza applicata al processo di riparazione da monitorare. Seguendo questa procedura, l'immunofluorescenza può essere eseguita per rispondere a domande sul reclutamento di proteine aggiuntive o sui cambiamenti nello stato di fosforilazione o altre modifiche post-traduzionali. Questa tecnica consente ai ricercatori di esplorare il reclutamento dinamico delle proteine di riparazione del DNA e di determinare meglio il modo in cui i domini proteici e le mutazioni influenzano il riconoscimento e la risposta al danno al DNA.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare un microscopio confocale a scansione laser per indurre danni al DNA e monitorare il reclutamento delle proteine di riparazione del DNA. Non dimenticare che lavorare con laser e sostanze chimiche come la formaldeide può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come i dispositivi di protezione individuale.