Applicazione di Micro-irradiazione del Laser per l'esame di Single e Double Strand Break Repair in cellule di mammifero

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre danni al DNA in una regione subnucleare di una cellula utilizzando un laser al microscopio confocale a fluorescenza. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla riparazione del DNA, come ad esempio come le proteine vengono reclutate e mantenute nei siti di danno al DNA. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la visualizzazione in tempo reale della proteina di interesse, permettendo così di costruire il profilo di reclutamento e mantenimento.

Iniziare questa procedura posizionando una camera portaoggetti contenente le cellule di interesse in un incubatore da microscopio mantenuto a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Registrare i campi dell'immagine utilizzando una piattaforma motorizzata per microscopio con codifica. Selezionare una caratteristica riconoscibile del contenitore di coltura, come la barriera tra pozzetti.

Acquisire un'immagine e registrare la posizione X-Y. Questo permetterà l'allineamento e la registrazione delle posizioni X-Y dei campi selezionati dopo la preparazione del campione. Una volta completata la registrazione dell'immagine, selezionare un campo per la micro-irradiazione e mettere a fuoco il campione.

Per le cellule che esprimono proteine marcate con fluorescenza, selezionare il piano focale con la massima sezione trasversale nucleare nel canale fluorescente di interesse. Concentrarsi sulla sezione trasversale massima del nucleo è fondamentale perché garantisce che il punto focale sia centrato sul nucleo per monitorare il reclutamento della proteina di interesse nel sito di danno indotto. Selezionare una struttura ben definita all'interno del nucleo, come il nucleolo, e spostare il piano focale verso l'alto e verso il basso osservandone il cambiamento nell'aspetto.

Il vero piano focale si troverà all'interno della transizione tra chiaro e scuro. Per mettere a fuoco il campione, selezionare il piano focale in cui la caratteristica selezionata presenta il contrasto più nitido. Il passo successivo consiste nel registrare la posizione del campo di interesse.

Crea una regione di interesse (ROI) quadrata di tre per tre pixel all'interno del software del microscopio. Posiziona questa ROI sul nucleo di una cellula da danneggiare e imposta questa ROI come ROI di danno. Acquisisci un'immagine pre-danno che includa la posizione dell'ROI di danno.

Acquisire un'immagine contenente il campo chiaro nel canale di fluorescenza per la proteina di interesse. Le cellule sono ora pronte per l'irraggiamento microscopico con laser. Per questa dimostrazione, verrà utilizzato il laser a 405 nanometri al 100% della potenza.

La dose del laser a 405 nanometri è controllata modulando la velocità di scansione ed eseguendo una scansione dell'area ROI di danno selezionata. In questo esperimento, utilizzare otto e 0,5 fotogrammi al secondo per la micro-irradiazione a 405 nanometri. La selezione della potenza laser appropriata per danneggiare le cellule è fondamentale per distinguere tra diversi percorsi di riparazione del DNA.

Eseguire l'acquisizione di immagini in time-lapse nei canali a campo chiaro e di fluorescenza dopo il danno. Regolare la durata e la frequenza del time-lapse per ottimizzare la raccolta dei dati, catturando idealmente l'accumulo della proteina fluorescente nella regione di interesse (ROI) del danno e la sua dissociazione nel corso dell'esperimento. Al termine del time course, selezionare un nuovo campo di cellule da danneggiare e proseguire con la micro-irradiazione e l'acquisizione in time-lapse fino a raggiungere il numero desiderato di cellule danneggiate.

Si consiglia di avere da 10 a 25 cellule per ogni condizione selezionata. Per aumentare il numero totale di cellule disponibili per l'analisi di immunofluorescenza, danneggiare ulteriori campi all'interno del contenitore di coltura per generare un corso temporale multiplo della risposta post-danno. Registrare la posizione X-Y di ciascun campo e l'orario in cui è avvenuto il danno.

Le cellule possono essere fissate immediatamente dopo il danno oppure lasciate riparare per intervalli di tempo selezionati prima della fissazione. Per iniziare questa analisi, aprire le immagini acquisite in un'applicazione di analisi delle immagini come NIS-Elements. Per ogni cellula da misurare, generare innanzitutto una ROI di riferimento che rappresenti il nucleo.

Utilizzare un algoritmo di soglia sul segnale di fluorescenza che contiene i pixel che compongono il nucleo, quindi convertire questa area in una ROI. Successivamente, creare una ROI di sei per sei pixel e posizionarla sopra la ROI del danno. Questa ROI più grande diventa ora la ROI del danno per l'analisi.

Per ogni cellula da misurare, registrare l'intensità media di fluorescenza per le ROI di riferimento e di danno. Per ogni fotogramma del corso temporale, regolare la ROI di riferimento per assicurare che l'area nucleare sia accuratamente coperta dalla ROI e regolare la ROI di danno per garantire che la zona danneggiata sia coperta. Registrare l'intensità media di fluorescenza del segnale fluorescente all'interno di ciascuna ROI per ogni fotogramma del corso temporale.

Per ogni cellula, normalizzare l'intensità media della fluorescenza della ROI del danno rispetto a quella della corrispondente ROI di riferimento in ogni fotogramma dell'acquisizione temporale. In questo caso, l'intensità media della fluorescenza nucleare viene utilizzata come ROI di riferimento e la normalizzazione viene eseguita sottraendo l'intensità media della fluorescenza della ROI di riferimento dall'intensità media della fluorescenza della ROI del danno. Ripetere la normalizzazione per tutte le cellule danneggiate, nonché per almeno due cellule di controllo indenni.

Infine, rappresentare graficamente i valori di intensità normalizzati nel tempo per mostrare le variazioni nella dinamica di reclutamento in funzione del trattamento sperimentale. Le cellule esprimenti stabilmente XRCC1-GFP sono state irradiate e analizzate mediante imaging prima e dopo l'induzione del danno. È stato osservato il reclutamento di XRCC1-GFP nella regione di interesse (ROI) del danno e ne è stata misurata la dinamica.

La formazione di rotture a doppio filamento è stata esaminata utilizzando due marcatori. Per entrambi i marcatori, la seconda stimolazione a bassa dose a 355 nanometri non provoca risposta a cinque minuti e a venti minuti e una risposta debole e variabile a dieci minuti dal trattamento con radiazioni. La micro-irradiazione ad alta dose per 10 secondi a 355 nanometri induce un segnale fluorescente aumentato all'interno dell'area di danno (ROI) a cinque, dieci e venti minuti dopo l'irradiazione, che risulta ridotto a quaranta minuti.

Questi risultati indicano che i marcatori di rottura del doppio filamento del DNA rispondono in modo dipendente dalla dose all'irraggiamento microscopico a 355 nanometri. Al contrario, la stimolazione con laser a 405 nanometri ha determinato un significativo accumulo di entrambi i marcatori all'interno dell'area di interesse (ROI) del danno, indipendentemente dalla dose applicata. Una volta acquisita padronanza della tecnica, essa può essere eseguita in circa quattro ore per 10 cellule, se effettuata correttamente.

Durante l'esecuzione di questa tecnica, è fondamentale adattare la lunghezza d'onda del laser e la potenza applicata al processo di riparazione in corso di monitoraggio. Al termine di questa procedura, è possibile eseguire un'immunofluorescenza per indagare il reclutamento di ulteriori proteine o variazioni nello stato di fosforilazione o altre modifiche post-traduzionali. Questa tecnica consente ai ricercatori di studiare il reclutamento dinamico delle proteine coinvolte nella riparazione del DNA e di determinare meglio come domini proteici e mutazioni influenzino il riconoscimento e la risposta ai danni al DNA.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare un microscopio confocale a scansione laser per indurre danni al DNA e monitorare il reclutamento delle proteine di riparazione del DNA. Non dimenticare che lavorare con laser e sostanze chimiche come il formaldeide può essere estremamente pericoloso e che precauzioni, come l'uso di dispositivi di protezione individuale, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.