A secco microfluidic-spinning e caratterizzazione delle fibre rigenerate seta Fibroin

L'obiettivo generale di questo esperimento è osservare l'effetto dell'umidità relativa sulla struttura e sulle proprietà meccaniche a trazione di fibre di fibroina di seta rigenerata, utilizzando un metodo di filatura a secco microfluidico. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo la filatura biomimetica, come ad esempio le forze di taglio e il processo di filatura a secco. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il canale microfluidico è progettato per imitare il dotto ghiandolare di un baco da seta.

Questo metodo può fornire informazioni sul processo di filatura a secco della fibroina di seta. Può inoltre essere utilizzato per il processo di filatura a umido della seta di ragno ricombinante. In generale, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà.

Perché sono necessarie due settimane per preparare la soluzione per filatura e per assicurare che abbia buone capacità di filatura. La dimostrazione visiva di questo metodo è molto importante. Infatti, se si ha poca esperienza, è molto difficile preparare la soluzione per filatura, e il tempo di filatura è essenziale per la riuscita del procedimento.

Iniziare con la degommatura dei bozzoli di Bombyx mori in una soluzione acquosa contenente carbonato di sodio allo 0,5%. Incubare i bozzoli immersi a 100 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, sostituire la soluzione di carbonato di sodio e ripetere l'incubazione una seconda volta.

Una volta terminato, lavare la seta con acqua deionizzata per rimuovere la sericina. Far asciugare le sete degli gusci degommate all'aria, quindi immergerle in bromuro di litio 9,0 molare in un rapporto peso/peso di 1:10. Incubare le sete a 40 gradi Celsius per due ore fino a quando non si saranno completamente disciolte.

Successivamente, diluire la soluzione di fibroina di seta rigenerata di 1,5 volte in bottiglie da 250 millilitri utilizzando acqua deionizzata. Centrifugare la soluzione e quindi filtrarla mediante una pompa a vuoto attraverso un letto di doppia carta da filtro con una maglia da 20 micron per rimuovere eventuali impurità. Versare 250 millilitri della soluzione di fibroina di seta rigenerata filtrata in sacche da dialisi in membrana semipermeabile di cellulosa e sottoporre ciascuna sacca a dialisi in 10 litri di acqua deionizzata ad osmosi inversa a cinque gradi Celsius per tre giorni.

Dopo la dialisi, utilizzare un flusso d'aria forzata per concentrare la soluzione a cinque gradi Celsius fino al 20% del peso originale. Successivamente, aggiungere una soluzione acquosa tre molare di cloruro di calcio alla soluzione concentrata per ottenere una concentrazione finale di 1,0 millimoli per grammo di ioni calcio. Concentrare nuovamente la soluzione di fibroina di seta rigenerata mediante flusso d'aria forzata fino al 44% del suo peso iniziale.

Iniziare facendo bollire una lamella di vetro per 20 minuti in una soluzione mista di acido solforico concentrato e soluzione di perossido di idrogeno al 30% in un rapporto 10:1. Al termine, lavare la lamella di vetro con acqua deionizzata, quindi asciugarla con azoto ad alta purezza. Successivamente, posizionare la lamella di vetro in un dispositivo di rivestimento appositamente costruito, con un'intercapedine di 100 micrometri tra la superficie inferiore della barra di rivestimento e la superficie superiore della lamella di vetro.

Compilare il vuoto con il fotoresist SU-8 e quindi applicare il fotoresist mediante spin coating a 40,3 volte G per 30 secondi, formando un film uniforme di circa 85 micrometri di spessore. Successivamente, posizionare il vetrino con il fotoresist in un forno dotato di programma di controllo della temperatura. Aumentare la temperatura da quella ambiente a 65 gradi Celsius a una velocità di due gradi Celsius al minuto e mantenere la temperatura a 65 gradi Celsius per due minuti.

Successivamente, continuare a riscaldare il vetrino da 65 gradi Celsius a 95 gradi Celsius a un ritmo di due gradi Celsius al minuto, mantenendo la temperatura a 95 gradi Celsius per 15 minuti. A questo punto, spegnere il forno e lasciare raffreddare naturalmente il vetrino fino alla temperatura ambiente all'interno del forno. Successivamente, posizionare il vetrino con la fotoresina sotto una luce UV e allineare una maschera fotolitografica contenente il microcanale appropriato sopra il vetrino.

Esponi il lato del vetrino alla luce UV per 12 secondi. Dopo l'esposizione, riposiziona il vetrino nel forno e riscalda come in precedenza. Dopo la cottura, pulisci il fotoresist sviluppandolo in soluzione sviluppatrice mediante bagno ad ultrasuoni per 30 secondi.

Quindi, utilizzare in modo alternato isopropanolo e sviluppatore per lavare il vetrino fino a quando non si osserva alcun precipitato sul vetrino. Solidificare il fotoresist in un forno dotato di programma di controllo della temperatura. Aumentare la temperatura da quella ambiente a 170 gradi Celsius a una velocità di due gradi Celsius al minuto, mantenere a 170 gradi Celsius per 30 minuti, quindi spegnere il forno e lasciare raffreddare naturalmente fino alla temperatura ambiente all'interno del forno.

Successivamente, posizionare lo stampo in SU-8 polimerizzato in una scatola di alluminio e versare 8,8 grammi di prepolimero PDMS sullo stampo fino a un'altezza di circa cinque millimetri. Polimerizzare il PDMS per 30 minuti a 65 gradi Celsius e per 15 minuti a 80 gradi Celsius. Una volta polimerizzato, utilizzare una punta da trapano con diametro di 1,2 millimetri per praticare un foro attraverso il replice in PDMS all'inizio del canale.

Quindi, posizionare il canale in PDMS con il lato superiore rivolto verso l'alto insieme a un secondo strato piatto di PDMS in un rivestitore al plasma e trattare con plasma di ossigeno. Sigillare immediatamente lo strato di PDMS con il canale a uno strato piatto di PDMS dopo averli rimossi dalla camera del plasma. Il microcanale è ora pronto per l'uso.

Iniettare la gelatina di fibroina di seta rigenerata nel microcanale a due microlitri al minuto utilizzando una pompa per siringa. Regolare l'umidità relativa nell'area di elettrofilatura al 40 o 50% di umidità relativa mediante un umidificatore. Successivamente, accendere un rullo in modo che la superficie si muova a tre centimetri al secondo.

Una volta che l'umidità si è stabilizzata, toccare la goccia di fibroina di seta rigenerata ed estrarre una fibra di seta nell'aria. Successivamente, posizionarla sul rullo attraverso il gap aereo di 10 centimetri. Il rullo estrarrà le rimanenti fibre di seta.

Al termine, conservare le fibre in un essiccatore sigillato per 24 ore. Il giorno successivo, sottoporre le fibre a un trattamento post-operatorio stendendole quattro volte a 0,9 millimetri al secondo in etanolo al 80% utilizzando una macchina appositamente costruita. Mantenere le fibre stese fissate e immergerle in una soluzione di etanolo al 80% per un'ora.

Infine, fissare le fibre post-trattate su un telaio di carta con una lunghezza di misura di 10 millimetri. Qui è mostrata una fibra di seta rigenerata allungata al microscopio elettronico a scansione. Queste fibre avevano un diametro medio di nove micron.

Quando misurate sotto tensione, le fibre formate in condizioni di umidità relativa del 40% hanno presentato una resistenza a trazione leggermente superiore e una deformazione massima maggiore, ma un modulo di Young simile rispetto alle fibre formate in condizioni di umidità relativa del 50%. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe comprendere come eseguire la filatura a secco di una fibra di seta a partire da una soluzione acquosa di seta utilizzando un chip microfluidico ispirato alla biologia.