Name: A secco microfluidic-spinning e caratterizzazione delle fibre rigenerate seta Fibroin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Impara la filatura microfluidica a secco della fibroina di seta rigenerata per studiare gli effetti dell'umidità relativa sulla struttura e sulle proprietà meccaniche delle fibre.

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Questo lavoro è sponsorizzato dalla National Natural Science Foundation of China (21674018), il National Research di chiave e programma di sviluppo della Cina (2016YFA0201702 /2016YFA0201700) e il "programma di Shuguang" supportato da Shanghai Education Development Fondazione e Shanghai Municipal Education Commission (15SG30), DHU distinto giovane professore programma (A201302), i fondi di ricerca fondamentale per le Università centrale e il progetto 111 (n. 111 / 2 / 04).

Attenzione: si prega di consultare tutte le schede di sicurezza rilevanti prima dell'uso. Molte delle sostanze chimiche utilizzate nella preparazione del modanatura sono acutamente tossici. Si prega di utilizzare dispositivi di protezione individuale (occhiali di sicurezza, guanti, camice da laboratorio, pieno lunghezza pantaloni e scarpe chiuse).
 1. filatura di microfluidica di RSF soluzione acquosa <ol><li>Preparazione di RSF acquosa filatura dope 4 , 15 , 16 <ol><li>Sgommatura di baco da seta bozzolo <ol><li>Degum Bombyx mori avvolge due volte in soluzioni acquose del 3 CO 2 Na (0,5% in peso in acqua) a 100 ° C per 30 minuti ciascuno e poi lavare la seta con acqua deionizzata per rimuovere il sericina.</li>
		</ol></li> <li>Dissolvenza del bozzolo del baco da seta degummed <ol><li>asciugare le sete degummed bozzolo in aria; poi si dissolvono le sete degummed bozzolo in soluzione acquosa di LiBr 9,0 M con un rapporto di 01:10 (p/v) a 40 ° C per 2 h. Ad esempio, aggiungere 10 mL LiBr / 1 grammo di seta ( Figura 1a).</li>
		</ol></li> <li>Centrifugazione e filtrazione <ol><li>diluire la soluzione RSF 1,5 volte di acqua deionizzata. Centrifuga e filtro per rimuovere le impurità. Centrifugare la soluzione RSF in flaconi da 250 mL a 4 ° C per 10 min 1,234.8 x g. filtrare la soluzione RSF utilizzando un filtro di 20 µm e una pompa a vuoto. Letto matrimoniale in carta da filtro è preferibile considerare l'effetto di sperimentazione.</li>
		</ol></li> <li>Dialyzing <ol><li>Dializzare la soluzione RSF in acqua deionizzata a 5 ° C per 3 giorni, utilizzando una membrana semipermeabile di cellulosa (MWCO: 14.000 ± 2.000). Il volume totale della soluzione RSF è circa 1 L, caricata in 4 sacchetti di dialisi. Mettere questi sacchetti di dialisi nel secchio, che è riempito con osmosi inversa (RO) di 10 L di acqua deionizzata. 
			Nota: Il valore pH dell'acqua deionizzata dovrebbe essere superiore a 6, per evitare la gelificazione durante il processo di concentrazione. Il pH dell'acqua deionizzata non richiedono regolazione per questo protocollo.</li>
		</ol></li> <li>Concentrazione <ol><li>condensare la soluzione acquosa di RSF 20 wt % di flusso d'aria forzato in soluzione acquosa di 5 ° C. aggiungere 3 M CaCl 2 nella soluzione a concentrazione di Ca 2 + finale; 1,0 mmol/g RSF poi concentrare mediante aria forzata flusso di 38-47 wt %.</li>
			<li>Pesare una goccia della soluzione RSF su un vetrino e poi asciugare per 2 ore in un forno a 105 ° C. 
			Nota: Il peso per cento dei rimanenti solido rispetto al peso della goccia prima di essiccamento è la concentrazione totale di proteine e CaCl 2. La concentrazione di RSF è derivata dopo deduzione della massa di CaCl 2. Almeno quattro ripetute misurazioni sono state effettuate. Nostri studi precedenti hanno mostrato che la concentrazione di Ca 2 + notevolmente influenzato le proprietà reologiche e rotatività delle soluzioni acquose RSF. Nel frattempo, l'aggiunta di Ca 2 + richiesto la limitata formazione di β-foglio e l'aggregazione di RSF 17. In uno stimolante di filatura nativo, CaCl 2 è considerato un ruolo importante durante l'immagazzinaggio di droga per evitare la gelificazione prima della filatura di filatura. 18</li></ol></li></ol></li> <li>preparazione di chip microfluidico 8 , 19 <ol><li>preparando photomask <ol><li>Design micro-canale in un Programma CAD. Stampare il file CAD per produrre una trasparenza ad alta definizione 19.</li>
		</ol></li> <li>Preparando la muffa <ol><li>pulire il vetrino <ol><li>In una cappa chimica, bollire il vetrino nella soluzione mista di acido solforico concentrato e 30 vol % perossido di idrogeno soluzione (10:1) per 20 minuti su una piastra calda. 
				Attenzione: i vapori di acido solforico e perossido di idrogeno sono estremamente tossici.</li>
			</ol></li> <li>Il vetrino di lavaggio <ol><li>lavare il vetrino utilizzando acqua deionizzata e asciugare con azoto ad alta purezza.</li>
			</ol></li> <li>Film di vernice <ol><li>cappotto il photoresist SU-8 su vetrino da un dispositivo di rivestimento su misura con un gap di 100 µm tra la superficie inferiore della barra di rivestimento e la superficie superiore del vetro.</li>
			</ol></li> <li>Rivestimento per rotazione <ol><li>diffondere il photoresist su vetrino per formare una pellicola uniforme utilizzando una macchina a rotazione a 40,3 x g per 30 s. Lo spessore del film uniforme è circa 85 µm.</li>
			</ol></li> <li>Solidificazione <ol><li>solidificare il photoresist in un forno con una programma di controllo di temperatura. Elevare la temperatura da temperatura ambiente a 65 ° C a 2 ° C/min e reggono a 65 ° C per 2 min continua al calore da 65 ° C a 95° C e premuto a 95 ° C per 15 min. Turn off al forno e fresco naturalmente per camera temperatura nel forno.</li>
			</ol></li> <li>Ultravioletto luce esposizione <ol><li>esporre il lato del vetro scivolare con il photoresist a luce ultravioletta per 12 s utilizzando la trasparenza come un photomask di fotolitografia 19. 
				Nota: Il numero d'onda della luce ultravioletta è 365 nm e l'energia di esposizione è 273.6 mJ/cm 2. 
				Attenzione: Prendere misure di sicurezza adeguate mentre si lavora con luce UV e il forno.</li>
			</ol></li> <li>Solidificare il photoresist come descritto nel passaggio 1.2.2.5.</li>
			<li>In via di sviluppo <ol><li>pulire il photoresist con ultrasuoni nella soluzione di sviluppatore per 30 s. lavare il vetrino da isopropanolo e sviluppatore, alternando tra i due, finché non ci sarà nessuna precipitazione sul vetrino.</li>
			</ol></li> <li>Solidificare il photoresist in un forno con una programma di controllo di temperatura. Elevare la temperatura da temperatura ambiente a 170 ° C a 2 ° C/min e premuto a 170 ° C per 30 min. Turn off al forno e fresco naturalmente a temperatura ambiente in forno.</li>
		</ol></li> <li>Litografia soft <ol><li>versare 8.8 pre-polimero di g liquido polidimetilsilossano (PDMS) sopra la muffa e la cura a 65 ° C per 30 minuti, e 15 min a 80 pre-polimero di ° C. liquido PDMS è costituito da PDMS e agente indurente (in genere a 10:1 (w/w)).</li>
		</ol></li> <li>Boxe <ol><li>fare un buco attraverso la replica PDMS all'inizio del canale di drill. Il diametro della punta è di 1,2 mm.</li>
		</ol></li> <li>Tenuta <ol><li>sigillare la replica PDMS con il canale da uno strato PDMS piatto senza motivo di un trattamento al plasma di ossigeno sulle superfici dei due strati PDMS. 
			Nota: Il processo di preparazione complessiva del chip richiede circa 72 h.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Fabbricazione di RSF fibra <ol><li>iniezione di filatura dope <ol><li>iniettare il RSF filatura dope in microchannel a 2 µ l/min di una pompa a siringa.</li>
		</ol></li> <li>Regolamento ambiente <ol><li>regolare l'umidità relativa di 40 ± 5% RH o 50 ± 5% RH utilizzando un umidificatore. A 40 RH di ± 5%, come filato fibra solidificato più velocemente di 50 ± 5% RH.</li>
		</ol></li> <li>Fibra di produzione di RSF <ol><li>toccare la goccia RSF un Pinpoint allo sbocco del canale microfluidica, disegnare fibra di RSF nell'aria e quindi la bobina esso su un rullo attraverso un'intercapedine d'aria di 10 cm ad una velocità di 3 cm/s ( Figura 1b ).</li>
		</ol></li> <li>Memorizzare le fibre RSF in un essiccatore sigillato per 24 h.</li>
		<li>Post-trattamento della fibra <ol><li>disegnare le fibre come filato 4 volte a 0,9 mm s -1 in 80 vol % etanolol di soluzione di una macchina su misura e quindi mantenere la fibra disegnata fisso e immergere le fibre nella soluzione per 1 h. A causa di questo trattamento, la lunghezza della fibra è stata cambiata da originariamente 15 mm a 60 mm.</li>
		</ol></li> <li>Preparazione del campione per la caratterizzazione <ol><li>fissare le fibre post-trattate su un telaio di carta con una lunghezza di 10mm calibro. Almeno 20 fibre sono necessità di misurazione, compreso nella prova di trazione, SEM, FTIR e WAXS. I diametri della gamma fibre post-disegnato da 5 a 10 µm. Figura 1 Mostra lo schema della fibra produzione e caratterizzazione di WAXD. Le proprietà meccaniche delle fibre RSF sono state esaminate secondo un sistema di prova materiale (25 ± 2) ° C e (45 ± 5) % di umidità relativa. L'estensione votare e calibro lunghezza rispettivamente 2 mm/min e 1cm,.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 2. Radiazione di sincrotrone caratterizzazione di cristallina struttura di RSF fibra <ol><li>radiazione di sincrotrone caratterizzazione 4 , 13 , 17 <ol><li>regolazione della beamline <ol><li>regolare la lunghezza d'onda dei raggi x e dimensione dello spot di 0,07746 nm e 3 x 2 µm 2, rispettivamente. 
			Nota: Il protocollo viene eseguito utilizzando la beamline di BL15U1 presso la Shanghai Synchrotron Radiation Facility.</li>
		</ol></li> <li>Posizione dello spot raggi x <ol><li>trovare la posizione dello spot dei raggi x. 
			Nota: La posizione dello spot dei raggi x è regolata dal tecnico di laboratorio presso l'impianto di radiazione di sincrotrone.</li>
		</ol></li> <li>Test del campione standard: biossido di cerio (CeO 2) <ol><li>un CeO 2 polvere standard del campione di prova. Il CeO 2 polvere è stata caratterizzata per calcolare il centro del cerchio e la distanza tra il campione e il rilevatore.</li>
		</ol></li> <li>Preparazione del campione <ol><li>difficoltà i filamenti RSF in parallelo con l'altro su carta cornice con un calibro di 10 mm di lunghezza. Incollare la cornice di carta sul palco test. 
			Nota: Mantenere la fibra orizzontale.</li>
		</ol></li> <li>SR-WAXD test <ol><li>aprire l'otturatore <ol><li>chiudere lo sportello della stazione beamline dopo aver verificato che non ci siano persone in camera. Aprire l'otturatore della sorgente del fascio di raggi x.</li>
			</ol></li> <li>Messa a fuoco <ol><li>spostare la fibra leggermente fino a quando si è a fuoco. Regolare la posizione della fibra lungo x, y, z senso da remoto tramite un software ( Figura 1C).</li>
			</ol></li> <li>Esposizione di esempio <ol><li>spostare la fibra su e giù in remoto tramite un software, fino a quando non è sul posto dei raggi x. Premere il pulsante start sul software per esporre la fibra per la beamline di raggi x per 20 s ( Figura 1C).</li>
			</ol></li> <li>Sfondo diffrazione <ol><li>la diffrazione dello sfondo aria con il tempo di esposizione di 20 s. mossa la fibra lontano dal luogo di raggi x da remoto tramite un software di prova. Premere il &#34; inizio &#34; pulsante sul software per esporre la beamline di raggi x di &#34; medio di aria &#34; per 20 s.</li>
			</ol></li></ol></li></ol></li> <li>Elaborazione dati SR-WAXD 13 <ol><li>calibrazione Software <ol><li>elaborare i dati WAXD con FIT2D (V12.077). Calibrare il centro del cerchio e la distanza del campione-a-rivelatore utilizzando i dati di diffrazione della polvere CeO 2.</li>
		</ol></li> <li>2-D di diffrazione <ol><li>sottrarre lo sfondo di aria dal pattern di diffrazione della fibra utilizzando FIT2D (V12.077).</li>
		</ol></li> <li>Dimensione cristallinità e cristallite <ol><li>integrare l'intensità di diffrazione in funzione di 2 θ di angolo di scattering. Eseguire deconvoluzione dell'integrazione di intensità di picco automatizzata separazione software (versione 4.12) 12. Il grado di cristallinità, x c, è stato stimato dalla relazione: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56271/56271eq1.jpg" /> , dove ho c è la somma delle intensità integrata le vette cristalline e I un è l'intensità integrata dei amorfo halo 4 , 11. L'integrazione dei modelli di WAXD ha mostrato la larghezza del picco del [200], [020], [002] riflessioni. La FWHM di questi picchi sono stati utilizzati per determinare le dimensioni dei cristalliti lungo la a, b e c assi utilizzando Scherrer &#39; s formula 4.</li>
		</ol></li> <li>Determinazione degli orientamenti dei cristalliti <ol><li>calcolare gli orientamenti del cristallite e amorfo secondo azimuthal integrazioni di (020) e (210) picchi 11. L'orientamento cristallina può essere calcolato quantitativamente secondo Herman &#39; orientamento s. Qui, entrambi (020) e (210) cime erano dotati di due funzioni gaussiane. Il più stretto è per orientamento cristallina e l'altro più ampio è per il materiale amorfo orientato 13. Qui, gli orientamenti di cristalliti di fibre RSF sono stati confrontati utilizzando l'intera larghezza a metà altezza (FWHM) dei picchi di integrazioni azimutale (002).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Durante la dialisi della soluzione RSF, il valore del pH è fondamentale per il processo di concentrazione seguente. Se il valore del pH dell'acqua deionizzata è minore di 6, è possibile che la soluzione RSF sarà più facile per gel durante il processo di concentrazione. Per evitare la gelificazione, CaCl2 viene aggiunto alla soluzione di RSF. La concentrazione di CaCl2 è 1 mmol / peso di RSF.
Il nostro lavoro precedente dimostrato la possibilità di microfluidica filatura a...

Ragno e bachi da seta possono produrre eccezionale fibra di seta dalla soluzione proteica acquosa a temperatura ambiente e pressione. Tosatura ed estensionale flusso può indurre la formazione di cristalli liquidi texture nella ghiandola di seta1. Negli ultimi anni, c'è stato un grande interesse che imita il processo di filatura del ragno per produrre fibre artificiali ad alta resistenza. Tuttavia, grandi quantità di proteine della seta di ragno non può essere prodotto in modo efficiente ed economicamente da allevamento ragni a causa di cannibalismo. Notevoli quantità di seta del baco da seta possono essere ottenuti facilmente dall'agricoltura. In caso contrario, il baco da seta e ragno hanno una composizione simile di processo e dell'amminoacido di filatura. Di conseguenza, seta fibroin baco da seta è selezionato come un sostituto per filare la seta artificiale animale da molti ricercatori.
Ragno e baco da seta è possibile estrudere soluzione proteica attraverso loro condotto di filatura in fibra in aria. Le forze elevate sollecitazioni generate lungo il condotto di filatura più probabile allungare le molecole di seta fibroin per un più esteso di conformazione2. Seta artificiale fibre sono state filate utilizzando convenzionale filatura umido e a secco-filatura processi3,4, che non tengono in conto le forze fluide generate nel dotto di filatura.
In primo luogo, microfluidica approcci sono stati utilizzati per indagare l'assemblaggio di proteine della seta5,6. Quindi, fabbricazione di microfluidica di RSF è stata studiata tramite modellazione la cesoiatura ed estensionale forze7,8. Modulo di Young e diametro delle fibre RSF può essere sintonizzati di microfluidica filatura bagnata, ma la resistenza alla trazione di drawn fibra era inferiore a 100 MPa7. Infine, fibre ad alta resistenza RSF con successo sono stati preparati utilizzando il metodo di filatura a secco di microfluidica, ma il diametro della fibra è solo 2 µm8. Recentemente, filatura bagnata microfluidica è stata utilizzata con successo nella produzione di fibra di seta di ragno ricombinante ad alta resistenza. Il disegno di post-filatura in aria migliorato i difetti di superficie e interni di fibra artificiale9.
In questo studio, sono stato introdotto il microfluidici migliorato processo per fibra di RSF di filatura. Esso mira a imitare il processo di filatura della seta del baco da seta, tra cui la droga di filatura, tosatura delle forze e il processo di filatura a secco. Questo metodo di filatura non solo può produrre fibra di seta artificiale ad alta resistenza, ma anche possibile regolare il diametro della fibra. In primo luogo, il RSF dope di filatura è stato tosato e allungata in un canale di biomimic con un decadimento esponenziale di secondo ordine. In secondo luogo, le influenze di umidità relativa (RH) sulla morfologia delle fibre e le proprietà sono state studiate nel processo di filatura a secco microfluidici10. Rispetto per la filiera di filatura convenzionale, il nostro sistema di microfluidica è altamente biomimetici e può essere utilizzato per produrre fibre ad alta resistenza da soluzioni a temperatura ambiente da asciutto o bagnato metodo di filatura.
Dovuto l'alta risoluzione, ad alta luminosità, ad alta energia di microfocus la radiazione di sincrotrone a raggi x, può essere utilizzato per caratterizzare la microstruttura di una singola fibra con un diametro di parecchi micrometri4,11 , 12 , 13 , 14. qui, SR-WAXD tecnica è stata usata per calcolare la cristallinità, dimensione del cristallite e cristallina orientamento delle fibre RSF.

<table><tbody><tr><td>B. mori Coltivatori di bozzoli</td><td>a Tongxiang, provincia di Zhejiang, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbonato di sodio, anidro, 99,8%</td> <td>Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd., Cina</td><td></td><td>Bromuro di litio analiticamente puro</td></tr><tr><td>, 99,1%</td><td>Shanghai China Lithium Industrial Co., Ltd., Cina</td><td></td><td>Cloruro di calcio analiticamente puro</td></tr><tr><td>, anidro, 96,0%</td><td>Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd., Cina</td><td></td><td>Etanolo analiticamente puro</td></tr><tr><td>, anidro, 99,7%</td> <td>Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Cina</td><td>10009218</td> Fotoresist SU-8 <td>analiticamente puro</td></tr><tr><td></td><td>MicroChem Corp., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sviluppo di soluzioni</td><td>MicroChem Corp., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd., Cina</td><td></td><td>Analiticamente puro</td></tr> acido <tr><td>solforico concentrato</td><td>Pinghu Chemical Reagent Factory, Cina</td><td></td><td>Analiticamente puro</td></tr><tr><td>30 vol% perossido di idrogeno</td><td>Shanghai Jinlu Chemical reagent Co., Ltd., Cina</td><td></td><td>Analiticamente puro</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Shanghai Zhengxing chemical reagent factory, Cina</td><td></td><td>Analiticamente puro</td></tr><tr><td>Trattamento al plasma di ossigeno</td><td>DT-01, Suzhou Omega Machinery Electronic Technology Co., Ltd., Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td><td>&nbsp; KD Scientific, USA</td><td></td><td>Umidificatore KDS 200P</td></tr><tr><td>SEN perforatore</td> elettrico <td></td><td></td>Hangzhou Bo Yang Machinery Co., Ltd., Cina <td></td> trapano da banco Z406c</tr><tr><td>Sistema di prova dei materiali</td><td>Instron, USA</td><td></td><td>Modello: 5565</td></tr><tr><td>PeakFit</td><td>Systat Software, Inc., USA</td><td></td><td>Versione 4.12</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a secco microfluidic-spinning e caratterizzazione delle fibre rigenerate seta fibroin

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

Il protocollo viene illustrato un metodo per che imita il processo di filatura del baco da seta. Nel processo di filatura nativo, il dotto di filatura contraenti consente le proteine della seta essere compatto e ordinato dalle forze di taglio e di allungamento. Qui, un canale di microfluidica biomimetici è stato progettato per imitare la geometria specifica del dotto di filatura del baco da seta. Filatura rigenerato seta fibroin (RSF) drogato con alta concentrazione, si è sporto attraverso il microchannel a fibre a secco-spin a temperatura e pressione ambiente. Nel processo di post-trattamento, le fibre come filata erano disegnate e memorizzate in soluzione acquosa di etanolo. Radiazione di sincrotrone grandangolare diffrazione di raggi x (SR-WAXD) tecnologia utilizzata per studiare la microstruttura delle singole fibre RSF, che erano fissati ad un supporto del campione con l'asse di fibra RSF normale microbeam dei raggi x. La cristallinità, dimensione del cristallite e cristallina orientamento della fibra sono stati calcolati dai dati WAXD. Gli archi di diffrazione vicino all'equatore del modello bidimensionale WAXD indicano che la fibra post-trattata di RSF ha un grado elevato di orientamento.

Fibre ad alta resistenza RSF sono state prodotte con successo utilizzando il metodo di filatura di microfluidica. Le curve stress-strain e immagini al SEM delle fibre RSF allungate C44R40 sono mostrati nella Figura 2. Almeno 10 fibre sono stati misurati nella prova di trazione. Curve stress-strain sono stati scelti in base al valore medio di rottura stress e tensione delle fibre. I dati WAXD delle fibre sono mostrati nella Figura 3</stron...

Un protocollo per la filatura di microfluidica e caratterizzazione di microstruttura di monofilamento rigenerata seta fibroin è presentato.

A secco microfluidic-spinning e caratterizzazione delle fibre rigenerate seta Fibroin

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è osservare l'effetto dell'umidità relativa sulla struttura e sulle proprietà meccaniche a trazione di fibre di fibroina di seta rigenerata, utilizzando un metodo di filatura a secco microfluidico. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo la filatura biomimetica, come ad esempio le forze di taglio e il processo di filatura a secco. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il canale microfluidico è progettato per imitare il dotto ghiandolare di un baco da seta.Questo metodo può fornire informazioni sul processo di filatura a secco della fibroina di seta. Può inoltre essere utilizzato per il processo di filatura a umido della seta di ragno ricombinante. In generale, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà.Perché sono necessarie due settimane per preparare la soluzione per filatura e per assicurare che abbia buone capacità di filatura. La dimostrazione visiva di questo metodo è molto importante. Infatti, se si ha poca esperienza, è molto difficile preparare la soluzione per filatura, e il tempo di filatura è essenziale per la riuscita del procedimento.Iniziare con la degommatura dei bozzoli di Bombyx mori in una soluzione acquosa contenente carbonato di sodio allo 0,5%. Incubare i bozzoli immersi a 100 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, sostituire la soluzione di carbonato di sodio e ripetere l'incubazione una seconda volta.Una volta terminato, lavare la seta con acqua deionizzata per rimuovere la sericina. Far asciugare le sete degli gusci degommate all'aria, quindi immergerle in bromuro di litio 9,0 molare in un rapporto peso/peso di 1:10. Incubare le sete a 40 gradi Celsius per due ore fino a quando non si saranno completamente disciolte.Successivamente, diluire la soluzione di fibroina di seta rigenerata di 1,5 volte in bottiglie da 250 millilitri utilizzando acqua deionizzata. Centrifugare la soluzione e quindi filtrarla mediante una pompa a vuoto attraverso un letto di doppia carta da filtro con una maglia da 20 micron per rimuovere eventuali impurità. Versare 250 millilitri della soluzione di fibroina di seta rigenerata filtrata in sacche da dialisi in membrana semipermeabile di cellulosa e sottoporre ciascuna sacca a dialisi in 10 litri di acqua deionizzata ad osmosi inversa a cinque gradi Celsius per tre giorni.Dopo la dialisi, utilizzare un flusso d'aria forzata per concentrare la soluzione a cinque gradi Celsius fino al 20% del peso originale. Successivamente, aggiungere una soluzione acquosa tre molare di cloruro di calcio alla soluzione concentrata per ottenere una concentrazione finale di 1,0 millimoli per grammo di ioni calcio. Concentrare nuovamente la soluzione di fibroina di seta rigenerata mediante flusso d'aria forzata fino al 44% del suo peso iniziale.Iniziare facendo bollire una lamella di vetro per 20 minuti in una soluzione mista di acido solforico concentrato e soluzione di perossido di idrogeno al 30% in un rapporto 10:1. Al termine, lavare la lamella di vetro con acqua deionizzata, quindi asciugarla con azoto ad alta purezza. Successivamente, posizionare la lamella di vetro in un dispositivo di rivestimento appositamente costruito, con un'intercapedine di 100 micrometri tra la superficie inferiore della barra di rivestimento e la superficie superiore della lamella di vetro.Compilare il vuoto con il fotoresist SU-8 e quindi applicare il fotoresist mediante spin coating a 40,3 volte G per 30 secondi, formando un film uniforme di circa 85 micrometri di spessore. Successivamente, posizionare il vetrino con il fotoresist in un forno dotato di programma di controllo della temperatura. Aumentare la temperatura da quella ambiente a 65 gradi Celsius a una velocità di due gradi Celsius al minuto e mantenere la temperatura a 65 gradi Celsius per due minuti.Successivamente, continuare a riscaldare il vetrino da 65 gradi Celsius a 95 gradi Celsius a un ritmo di due gradi Celsius al minuto, mantenendo la temperatura a 95 gradi Celsius per 15 minuti. A questo punto, spegnere il forno e lasciare raffreddare naturalmente il vetrino fino alla temperatura ambiente all'interno del forno. Successivamente, posizionare il vetrino con la fotoresina sotto una luce UV e allineare una maschera fotolitografica contenente il microcanale appropriato sopra il vetrino.Esponi il lato del vetrino alla luce UV per 12 secondi. Dopo l'esposizione, riposiziona il vetrino nel forno e riscalda come in precedenza. Dopo la cottura, pulisci il fotoresist sviluppandolo in soluzione sviluppatrice mediante bagno ad ultrasuoni per 30 secondi.Quindi, utilizzare in modo alternato isopropanolo e sviluppatore per lavare il vetrino fino a quando non si osserva alcun precipitato sul vetrino. Solidificare il fotoresist in un forno dotato di programma di controllo della temperatura. Aumentare la temperatura da quella ambiente a 170 gradi Celsius a una velocità di due gradi Celsius al minuto, mantenere a 170 gradi Celsius per 30 minuti, quindi spegnere il forno e lasciare raffreddare naturalmente fino alla temperatura ambiente all'interno del forno.Successivamente, posizionare lo stampo in SU-8 polimerizzato in una scatola di alluminio e versare 8,8 grammi di prepolimero PDMS sullo stampo fino a un'altezza di circa cinque millimetri. Polimerizzare il PDMS per 30 minuti a 65 gradi Celsius e per 15 minuti a 80 gradi Celsius. Una volta polimerizzato, utilizzare una punta da trapano con diametro di 1,2 millimetri per praticare un foro attraverso il replice in PDMS all'inizio del canale.Quindi, posizionare il canale in PDMS con il lato superiore rivolto verso l'alto insieme a un secondo strato piatto di PDMS in un rivestitore al plasma e trattare con plasma di ossigeno. Sigillare immediatamente lo strato di PDMS con il canale a uno strato piatto di PDMS dopo averli rimossi dalla camera del plasma. Il microcanale è ora pronto per l'uso.Iniettare la gelatina di fibroina di seta rigenerata nel microcanale a due microlitri al minuto utilizzando una pompa per siringa. Regolare l'umidità relativa nell'area di elettrofilatura al 40 o 50% di umidità relativa mediante un umidificatore. Successivamente, accendere un rullo in modo che la superficie si muova a tre centimetri al secondo.Una volta che l'umidità si è stabilizzata, toccare la goccia di fibroina di seta rigenerata ed estrarre una fibra di seta nell'aria. Successivamente, posizionarla sul rullo attraverso il gap aereo di 10 centimetri. Il rullo estrarrà le rimanenti fibre di seta.Al termine, conservare le fibre in un essiccatore sigillato per 24 ore. Il giorno successivo, sottoporre le fibre a un trattamento post-operatorio stendendole quattro volte a 0,9 millimetri al secondo in etanolo al 80% utilizzando una macchina appositamente costruita. Mantenere le fibre stese fissate e immergerle in una soluzione di etanolo al 80% per un'ora.Infine, fissare le fibre post-trattate su un telaio di carta con una lunghezza di misura di 10 millimetri. Qui è mostrata una fibra di seta rigenerata allungata al microscopio elettronico a scansione. Queste fibre avevano un diametro medio di nove micron.Quando misurate sotto tensione, le fibre formate in condizioni di umidità relativa del 40% hanno presentato una resistenza a trazione leggermente superiore e una deformazione massima maggiore, ma un modulo di Young simile rispetto alle fibre formate in condizioni di umidità relativa del 50%. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe comprendere come eseguire la filatura a secco di una fibra di seta a partire da una soluzione acquosa di seta utilizzando un chip microfluidico ispirato alla biologia.

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