Name: In Vivo Rilevamento di umani cellule staminali mesenchimali adiposo-derivate in un modello di osteoartrite del ginocchio di ratto con colorante fluorescente lipofilico membrana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Scopri come monitorare la persistenza e la biodistribuzione di cellule staminali mesenchimali adiposo-derivate umane in un modello di osteoartrite del ginocchio di ratto mediante imaging fluorescente in vivo.

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Questo studio è stato supportato da Shanghai finanziamento dell'innovazione (1402H 294300) sponsorizzato dalla scienza e dalla tecnologia Commissione di Shanghai comune (CN) al Dr. Wen Wang. Vorremmo ringraziare il Dr. Guangdong Zhou (nazionale Tissue Engineering Center di Cina) per la sua assistenza tecnica e consulenza scientifica per questo manoscritto. Vorremmo anche ringraziare il signor Huitang Xia (ospedale del popolo di Shanghai nona) per il suo aiuto nel benessere degli animali.

procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal comitato di etica e locali istituzionali Animal Care con uno sforzo per ridurre al minimo la sofferenza animale. Il seguente protocollo è stato approvato dalla istituzionale Animal Care and uso Committee (IACUC) a Shanghai Ninth People &#8217; s ospedale affiliato a Shanghai JiaoTong University School of Medicine con il protocollo numero [2017] 063.
 1. istituzione di un modello di osteoartrite del ginocchio del ratto Surgically-Induced <ol><li>per questa procedura chirurgica, uso 8-12 settimana vecchi ratti Sprague Dawley (deviazione standard) con un peso corporeo tra 250 e 300 g.</li>
	<li>Anestetizzare gli animali con 40 mg/kg tiletamina e zolazepam 40mg/kg tramite iniezione intramuscolare.</li>
	<li>Metti l'animale in posizione laterale sinistra su un piatto riscaldato. Shave accuratamente il ginocchio destro con un rasoio. Disinfettare l'area chirurgica con soluzione di providone-iodio 10% seguita da etanolo al 70%, ripetere altre due volte e poi dipingere con soluzione di 10% providone-iodio e coprire l'area non chirurgica con un tampone chirurgico.</li>
	<li>Usando un bisturi chirurgico, praticare un'incisione di 2 cm lateralmente lungo il tendine rotuleo per esporre il jointcapsules.</li>
	<li>Utilizzare un bisturi chirurgico per recidere il legamento collaterale mediale. Riflettere il menisco verso il femore.</li>
	<li>Gocciolare soluzione sterile di cloruro di sodio 0,9% sulla superficie della cartilagine articolare durante il funzionamento per evitare che la cartilagine dall'asciugarsi.</li>
	<li>Afferrare il menisco mediale con il forcipe e tagliare attraverso il menisco al suo punto più stretto dal pignoramento tibial con un bisturi ( Figura 1A). Evitare di ferire la cartilagine.</li>
	<li>Chiudere la capsula articolare con un suturare assorbibile 4-0.</li>
	<li>Monitorare i ratti chirurgici fino a quando non riacquistano coscienza.</li>
	<li>Iniettare 20 mg/kg di gentamicina per prevenire l'infezione e buprenorfina 0,05 mg/kg attraverso un itinerario intramuscolare per alleviare il dolore dopo l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Mantenere i ratti in una struttura animale temperatura controllata sotto un ciclo di luce/buio di 12 h per 3-8 settimane all'insorgenza KOA. Gli animali continuano a ricevere il farmaco di dolore, compreso ma non limitato a buprenorfina (0,05 mg/kg, i.m.) e gentamicina (20 mg/kg, i.m.), se persistono i sintomi di dolore.</li>
</ol> 2. Valutazione di istologia del ratto KOA modello <ol><li>sacrificare i ratti con eccessiva CO 2 inalazione (Aggiungi un tasso di riempimento di circa il 30% del volume camera al minuto con l'anidride carbonica dell'aria esistente nella camera per rendere l'incoscienza animale entro 2-3 min flusso di CO2 di mantenere per un minimo di 1 min dopo respirazione cessa.) al indicato punti temporali (rappresentante risultati sono mostrati a 8 settimane di induzione di KOA che vanno da 3 a 8 settimane) dopo la chirurgia.</li> <li>sezionare la pelle e i muscoli intorno alle articolazioni di ginocchio e tagliare i giunti del ginocchio con un bisturi.</li>
	<li>Fissare i giunti di ginocchio in paraformaldeide al 4% (PFA) per 3 giorni a temperatura ambiente. In seguito, decalcificare i campioni in 20% acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per circa 4 settimane a 4 ° C e cambiare l'EDTA ogni 3 giorni. 
	Attenzione: Paraformaldeide è tossico, indossare adeguati dispositivi di protezione personale (PPE), come guanti e occhiali da vista.</li>
	<li>Disidratare i campioni utilizzando un processatore automatico. Impostare il menu per avviare un ciclo di risciacquo come segue: etanolo al 70% per 1 h; quindi 80% etanolo ed etanolo al 95% per 1 h rispettivamente; seguita da 2 cicli di etanolo al 100% per 1 h; Successivamente, xilene due volte per 1 h ogni volta e ogni volta di paraffina 3 volte a 58 ° C per 1 h. 
	Attenzione: Xilene è tossico, quindi indossate PPE appropriato, come guanti e occhiali da vista. 
	Nota: Facoltativamente, utilizzare vasi di Coplin per disidratazione manuale con la stessa impostazione come il processatore automatico.</li>
	<li>Posare la funzione mediale della faccia comune intatta e incorporarlo nel blocco paraffina con tessuto incastonato nel centro. 
	Nota: Facoltativamente, utilizzare pinze per incorporare i campioni il blocco di paraffina manualmente.</li>
	<li>Iniziare a tagliare 5 sezioni sagittali µm dal margine mediale del giunto per intervalli di 30 µm con 2 sezioni seriali di microtomo rotativo.</li>
	<li>Montare profili sulle lastre di vetro e deparaffinizzare le diapositive in xilene. Tra le 2 sezioni seriali, macchiare una diapositiva con ematossilina &#38; eosina (H &#38; E) colorazione: 0,1% ematossilina per 15 min, 1% soluzione di acido acetico per 10 s e 0,5% eosina per 10 min. E macchia l'altra diapositiva con safranina O/Fast Green colorazione: 0,1% ematossilina per 15 min, 0,02% Fast Green per 3 min., 1% soluzione di acido acetico per 10 s e 0,1% O di safranina per 3 min. 
	Attenzione: Xilene è tossico, indossare i dpi appropriati, come guanti, occhiali da vista.</li>
	<li>Punteggio ottenuto i vetrini colorati utilizzando il sistema di valutazione istopatologia di osteoartrite Research Society International (OARSI) in ratti 6.</li>
</ol> 3. Etichettatura di cellule staminali mesenchimali umane con la tintura fluorescente, ha fatto <ol><li>preparare fatto d'etichettatura delle cellule soluzione in etanolo al 100% ad una concentrazione di 1 mM. Proteggere la soluzione d'etichettatura delle cellule dalla luce e conservare a temperatura ambiente per 6 mesi.</li>
	<li>Crescere haMSCs con procedure di cultura cella standard in Dulbecco &#39; s modificato Eagle &#39; medium s (DMEM) completato con siero di vitello fetale penicillina e streptomicina e 10% 1% (FCS) in una capsula Petri 10cm.</li>
	<li>Staccare haMSCs con tripsina 0,25% 2ml con confluenza prima circa l'80% di 1 mM EDTA.</li>
	<li>Neutralizzare la tripsina con 4 mL di terreno di coltura e girare le cellule a 800 x g per 3 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Sospendere le cellule ad una densità di 1 x 10 6 cellule/mL nel mezzo di coltura privo di siero 5ml.</li>
	<li>Etichetta le cellule aggiungendo 50 µ l fatto soluzione d'etichettatura delle cellule nel mezzo di coltura privo di siero da 5 mL a 37 ° C per 50 min.</li>
	<li>Girare le cellule con etichettate a 800 x g per 3 min.</li>
	<li>Lavare le cellule due volte con 5 mL Tampone fosfato (PBS) a 800 x g per 3 minuti ciascuno,.</li>
	<li>Verifica la haMSCs etichettati utilizzando un microscopio a fluorescenza con un set di filtri Cy5.</li>
	<li>Contare le celle con la macchiatura blu di trypan e ottenere 2.5 x 10 6 cellule vitali in 100 µ l PBS iniettabile.</li>
</ol> 4. In Vivo Fluorescente Imaging per pista haMSCs <ol><li>otto settimane dopo l'intervento chirurgico (passaggio 1), anestetizzare i ratti KOA mediante iniezione intramuscolare di 25 mg/kg tiletamina e zolazepam 25 mg/kg.</li>
	<li>Radere accuratamente il ginocchio destro con un rasoio per esporre l'area del giunto. Disinfettare la zona comune con etanolo al 70%.</li>
	<li>Utilizzando un ago di siringa 26 G, iniettare 2,5 x 10 6 etichettati cellule sospese in 100 µ l PBS al centro della zona del triangolo formato dal lato mediale del legamento patellar, il condilo femorale mediale e del condilo tibiale mediale ( Figura 1B).</li>
	<li>Aprire il software di imaging e inizializzare la bioluminescenza in vivo imaging system.</li>
	<li>Posizione ratti nella posizione supina posizione nella fase centrale del sistema di imaging e chiudere la porta della camera.</li>
	<li>Verifica la &#34; fluorescente &#34; casella di controllo e seleziona Filtro fluorescente imposta di 640 nm per l'eccitazione e 680 nm per emissione ( Figura 2A).</li>
	<li>Selezionare campo di vista a D. impostare Pixelbinning su medio (8), F/Stop per esposizione e 2 ora di auto. Mantenere l'ottimale tempo di esposizione coerenza per ottenere risultati comparabili tra l'intero studio ( Figura 2A).</li>
	<li>Rimuovere l'animale dal palco e monitor per il recupero dall'anestesia. 
	Nota: Animale posto su un rilievo di riscaldamento coperto con 2-3 strati di spugna.</li>
	<li>Scegliete le unità di efficienza radiante per la misura della fluorescenza ( Figura 2B). Selezionare le regioni di interesse (ROI) per l'analisi e quantificare i segnali fluorescenti da ogni immagine ( Figura 2).</li>
	<li>Ripetere la procedura di imaging in vivo per ogni ratto in sequenza studiare haMSCs ritenzione longitudinale nel giunto. 
	Nota: Consigliamo di imaging gli animali &#39; segnali fluorescenti da sistema di imaging in vivo una volta ogni due giorni per la prima settimana dopo l'iniezione e una volta ogni settimana fino a quando il segnale non può essere rilevato.</li>
</ol>

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Li Meng, Hao Ming e Wen Wang sono dipendenti attuali e stock options possessori di cellulare biomedicina gruppo (Nasdaq: CBMG). Gli altri autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Norme di sicurezza e studi di biodistribuzione di terapia della cellula formativa sono urgentemente necessari prima che possiamo portare il trattamento rigenerativo delle cellule staminali per KOA dalla panchina al capezzale. Tuttavia, l'ambiente patologico della malattia svolge un ruolo importante nella persistenza e biodistribuzione di trapiantati haMSCs10. Recentemente, il nostro gruppo ha dimostrato che iniezione intrarticolare di haMSCs più persistenti in un ambiente di KOA patologico quanto ...

Osteoartrite del ginocchio (KOA) è un disordine degenerante derivanti dalla perdita di cartilagine articolare e l'infiammazione progressiva, che è diventata una malattia cronica importante negli anziani intorno al mondo1. Tuttavia, le attuali terapie con farmaci anti-infiammatori, integratori fisici e procedure chirurgiche possono fornire solo un sollievo temporaneo per dolore sintomatico2.
Adiposo-derivate cellule staminali mesenchimali umane (haMSCs) sono diventati un rimedio rigenerativo promettente per l'osteoartrite del ginocchio, a causa della loro differenziazione multipotenti potenziale per la rigenerazione della cartilagine e immunomodulatori proprietà3, 4. Rispetto ai percorsi farmacologici per studiare i meccanismi di azione in vivo, tracking live haMSCs in modelli animali di piccole dimensioni KOA è attualmente istruttivo per stabilire la spiegazione razionale per e la fattibilità della terapia haMSC prima applicazione clinica. Per i test preclinici, meniscectomia mediale (MM) destabilizza il carico meccanico del giunto per indurre KOA in ratti, che fornisce un modello relativamente fattibile con riproducibilità costante5. L'insorgenza di KOA indotta da MM è antecedente il transection del legamento crociato anteriore da solo o combinato con parziale meniscectomia mediale6. Pertanto, le interazioni a lungo termine tra haMSCs iniettato con il microambiente patologico di KOA sono spesso valutate in ratti indotti da MM7,8.
Anche se l'efficacia terapeutica di haMSCs è stato ampiamente riferita, pertinenti conoscenze sulla persistenza in vivo di haMSCs impiantato tramite iniezione intra-articolare (IA) è scarsa9,10. Quindi, sono stati sviluppati vari metodi di etichettatura cellulare, tra cui immunohistology11, luciferasi12, trasfezione13 proteina fluorescente verde, ossido di ferro di etichettatura per imaging a risonanza magnetica (MRI)14 e numerose cellule fluorescenti coloranti8,15,16. Confrontato con analisi di istologia laborioso, in vivo imaging non-invasivo si avvale di dispositivi ottici per rilevare la distribuzione in tempo reale e dinamica delle cellule identificate con segnali fluorescenti10,17. Per l'imaging funzionale di cellule vive, citocompatibili Contrassegno fluorescente è una tecnica di sofisticato monitoraggio radioattivo senza rivelare attività cellulari dopo trapianto di cellule staminali18. Inoltre, multicolore tinture fluorescenti lipofili possiedono vantaggi rispetto ai coloranti idrofiliche ammino-reattivi o proteine fluorescenti, compresi i loro permeabilità cellulare migliorata e rafforzata fluorescenza quantistica rendimenti19.
Così, i protocolli inclusi qui utilizzano un rosso laser per eccitare le cellule identificate con lipofilico carbocyanines fatto (DilC18(5)), che è un da' fluorescente Dil (dialkylcarbocyanines) analogico20. Gli spettri rosso-spostato di eccitazione e di emissione di evita interferenze autofluorescent e permette deep tissue imaging per un lungo periodo di tempo in animali vivi8. Questo metodo di rilevamento delle cellule in vivo etichettato con fatto è valido per il monitoraggio cellule staminali trapiantate, come haMSCs, in modelli animali, che è essenziale per capire e migliorare l'attuale terapia rigenerativa con cellule staminali.

<table><tbody><tr><td>Sistema di anestesia animale Matrx VMR</td><td>Sutura Midmark</td><td>VIP3000</td><td></td></tr><tr><td>4-0</td><td>Shanghai Jinhuan</td><td>KC439</td><td></td></tr><tr><td>Rasoio</td><td>Pritech</td><td>LD-9987</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd.</td><td>Nessuno</td><td></td></tr><tr><td>0,9% soluzione di cloruro di sodio</td><td>Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td></td><td></td>H43020455</tr><tr><td>Penicillina</td><td>Shanghai Kangfu chimico farmaceutico Co., Ltd.</td><td>Nessuno</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>Nessuno</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005</td><td>Diluire alla concentrazione finale del 10% in PBS</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>Diluire alla concentrazione finale del 20% in PBS</td></tr><tr><td>0,1% Soluzione di ematossilina, Mayer' s</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MHS16</td><td></td></tr><tr><td>0,5% Eosina Y soluzione, alcolica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110116</td><td></td></tr><tr><td>Safranina O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8884</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Excelsior ESTM Elaboratore di tessuti</td><td>Thermo Fisher</td><td>A78400006</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Histocentre&trade; 3 Inclusione tissutale Sonde</td> molecolari <td>B64100010</td><td></td>termo <td>Fisher</td> centrali</tr><tr><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td>DiD per<td>microtomo rotante completamente automatizzato</td></tr><tr><td></td><td>, Life Technologies</td><td>V-22887</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM Alto glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0,25% tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-114</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 10 cm</td><td>Centrifuga per V118877</td><td></td><td></td>Corning</tr><tr><td></td><td>Beckman</td><td>Optima MAX-TL</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di blu di tripano allo 0,4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td>Titetamme</td><td>Virbac (Zoletil 50)</td><td>1000000188</td><td></td></tr><tr><td>Zolazepam</td><td>Virbac (Zoletil 50)</td><td>1000000188</td><td></td></tr><tr><td>Siringa iposermica sterile per uso singolo 26G</td><td>Shanghai Misawa Medical Industry</td><td>Nessuno</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di imaging in vivo IVIS Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Living Imaging 4.0 software</td><td>PerkinElmer</td><td>Nessuno</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo rilevamento di umani cellule staminali mesenchimali adiposo-derivate in un modello di osteoartrite del ginocchio di ratto con colorante fluorescente lipofilico membrana

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

Per supportare l'applicazione clinica della terapia umana adiposo-derivate cellule staminali mesenchimali (haMSC) per l'osteoartrite del ginocchio (KOA), abbiamo esaminato l'efficacia di persistenza delle cellule e biodistribuzione di haMSCs nei modelli animali. Abbiamo dimostrato un metodo per assegnare un'etichetta della membrana cellulare di haMSCs con colorante fluorescente lipofilico. Successivamente, iniezione intra-articolare delle cellule con etichettate in ratti con KOA chirurgicamente indotta è stata monitorata in modo dinamico da un in vivo imaging system. Abbiamo impiegato il lipofilico carbocyanines fatto (DilC18 (5)), un analogo fluorescente da' di Dil (dialkylcarbocyanines), che utilizzato un laser rosso per evitare l'eccitazione del autofluorescence verde naturale dai tessuti circostanti. Inoltre, lo spettro di emissione rosso-spostato di permesso deep tissue imaging negli animali vivi e la procedura di etichettatura non causato nessun effetti citotossici o danno funzionale a haMSCs. Questo approccio ha dimostrato di essere un metodo di verifica efficiente per haMSCs in un modello di ratto KOA. L'applicazione di questo metodo potrebbe essere utilizzato anche per determinare la via di somministrazione ottimale ed il dosaggio delle MSC da altre fonti in studi pre-clinici.

Al fine di indurre modello KOA, MM è stato effettuato nel giunto di ginocchio destro di ratti SD (Figura 3). Otto settimane dopo la chirurgia, i ratti sono stati sacrificati e le sezioni di serie di giunti di ginocchio sono state valutate con entrambi H &#38; E e Safranina O/Fast Green macchiatura (Figura 4). Per H &#38; E colorazione, la superficie della cartilagine articolare ha esibito confini più ruvide al ginocchio chirurgia...

Questo protocollo descrive un modo efficiente per monitorare la persistenza delle cellule e la biodistribuzione di adiposo-derivate cellule staminali mesenchimali umane (haMSCs) di fluorescenza da' etichettatura in un modello di osteoartrite (KOA) del ginocchio di ratto tramite iniezione intra-articolare (IA).

In Vivo Rilevamento di umani cellule staminali mesenchimali adiposo-derivate in un modello di osteoartrite del ginocchio di ratto con colorante fluorescente lipofilico membrana

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare l'efficacia della persistenza cellulare e della biodistribuzione delle cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo umano in un modello di artrosi al ginocchio del ratto, o modello KOA, mediante imaging fluorescente in vivo. Il tracciamento in vivo delle cellule staminali può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del ripristino tissutale riguardo all'irritazione e alla distribuzione delle cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo umano nei modelli animali di KOA. Il principale vantaggio dell'uso del DiD è che il suo spettro di emissione spostato verso il rosso consente l'imaging di tessuti profondi in animali vivi, senza effetti citotossici né danni funzionali alle cellule marcate con il colorante.Posizionare innanzitutto un ratto maschio Sprague Dawley anestetizzato del peso di 250-300 grammi e di età compresa tra 8 e 12 settimane in posizione laterale sinistra su un tappetino riscaldato. Utilizzare un rasoio per rasare accuratamente il ginocchio destro e disinfettare l'area chirurgica con soluzione di iodopovidone al 10% e alcol al 70%. Coprire l'area non chirurgica con un campo operatorio.E utilizzare un bisturi per praticare un'incisione di due centimetri in senso laterale lungo il tendine rotuleo, esponendo così le capsule articolari. Successivamente, utilizzare un bisturi chirurgico per sezionare il legamento collaterale mediale, riflettendo il menisco verso il femore, e afferrare il menisco mediale con una pinza. Utilizzare un bisturi per tagliare attraverso il menisco nel suo punto più stretto, partendo dall'inserzione tibiale.Per ottenere un inizio affidabile e realizzabile dell'osteoartrosi del ginocchio (KOA), il lato del menisco corrispondente al femore deve essere completamente reciso in ciascun animale sperimentale. Successivamente, chiudere la capsula articolare con un punto di sutura riassorbibile quattro-O e monitorare il ratto fino al completo recupero. Otto settimane dopo l'intervento chirurgico, staccare le cellule mesenchimali derivate dal tessuto adiposo umano da una coltura all'80% confluenti utilizzando due millilitri di tripsina più EDTA per tre minuti a 37 gradi Celsius.Dopo alcuni minuti, neutralizzare la tripsina con quattro millilitri di mezzo di coltura completo e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Sospendere il pellet a una concentrazione di una volta 10 alla sesta cellule per millilitro in cinque millilitri di mezzo di coltura privo di siero. Etichettare quindi le cellule con 50 microlitri di soluzione di marcatura cellulare DiD per 50 minuti a 37 gradi Celsius.Al termine dell'incubazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e lavarle due volte con cinque millilitri di PBS per ogni lavaggio. Dopo l'ultima centrifugazione, diluire le cellule fino a raggiungere una concentrazione di 2,5 volte 10 alla sesta cellule vitali per 100 microlitri di PBS e caricare le cellule in una siringa da un millilitro dotata di un ago da 26 gauge. Successivamente, rasare nuovamente il ginocchio artritico del primo animale sperimentale per esporre l'area articolare e disinfettare la cute esposta con etanolo al 70%.Iniettare le cellule marcate al centro del triangolo formato dal lato mediale del legamento patellare, dal condilo femorale mediale e dal condilo tibiale mediale, quindi aprire il software di imaging. Inizializzare il sistema di imaging bioluminescente in vivo e posizionare gli animali in posizione supina sulla piattaforma centrale del sistema di imaging. Con la porta della camera chiusa, verificare la scatola fluorescente e selezionare i set di filtri fluorescenti di eccitazione ed emissione appropriati.Impostare il campo visivo su D, la curvatura del pixel su otto, l'apertura del diaframma su due e il tempo di esposizione su automatico. Dopo aver ottenuto le immagini, lasciare che gli animali si riprendano su un tappetino riscaldante con monitoraggio fino al completo recupero. Successivamente, nel software appropriato per l'analisi delle immagini, selezionare le unità di efficienza radiante per la misurazione della fluorescenza e le regioni di interesse per l'analisi, quindi quantificare i segnali fluorescenti provenienti da ciascuna immagine.In questo esperimento rappresentativo, sezioni seriali dell'articolazione del ginocchio di un ratto con osteoartrite al ginocchio indotta sono state valutate mediante colorazione con ematossilina-eosina (H&E) e safranina O/verde fast green a otto settimane dall'intervento chirurgico. Lo spessore della cartilagine articolare è più sottile nei ginocchi artritici rispetto alle articolazioni controlaterali non sottoposte a intervento, come osservato nelle sezioni colorate con H&E. Inoltre, i proteoglicani sono ridotti e il collagene fibrillato è aumentato nell'articolazione artritica, come visualizzato mediante colorazione con safranina O/verde fast green, indicando il progresso del fenotipo degenerativo di osteoartrite al ginocchio indotto dall'intervento chirurgico.Un'ora dopo la colorazione, le cellule mesenchimali umane derivate dal tessuto adiposo marcate con DiD mostrano una forma rotonda in vitro. Dopo 24 ore, le cellule mesenchimali marcate con DiD in coltura mostrano una forma allungata a fuso, confermando che il DiD non altera la capacità di adesione delle cellule. L'analisi delle ginocchia degli animali con osteoartrite otto settimane dopo l'intervento chirurgico rivela la presenza delle cellule marcate con DiD dal giorno zero fino al giorno 70 post iniezione.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della terapia con cellule staminali per determinare la routine e il dosaggio ottimali per l'iniezione sicura e fattibile di cellule staminali mesenchimali per il trattamento dell'osteoartrosi del ginocchio negli animali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come etichettare le cellule staminali mesenchimali umane con DiD per l'iniezione e il tracciamento in vivo nel modello di osteoartrosi del ginocchio indotta chirurgicamente nel ratto.

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Questo video mostra le tecniche per l'etichettatura delle cellule staminali embrionali umane e cellule staminali mesenchimali con coloranti fluorescenti. Questa tecnica può essere utilizzata per un monitoraggio in vivo di cellule staminali trapiantate con imaging ottico e per le correlazioni istopatologiche con microscopia a fluorescenza.

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Monitoraggio midollo osseo di topo monociti<em&gt; In Vivo</em

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In Vivo Imaging e tracciamento di tecnezio-99m etichetta cellule staminali mesenchimali del midollo osseo in Equine Tendinopatia

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Femore finestra del modello Camera per<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoraggio delle cellule nel midollo osseo murino

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In Vivo Rilevamento di umani cellule staminali mesenchimali adiposo-derivate in un modello di osteoartrite del ginocchio di ratto con colorante fluorescente lipofilico membrana (Video) | JoVE Journal

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