In Vivo Rilevamento di umani cellule staminali mesenchimali adiposo-derivate in un modello di osteoartrite del ginocchio di ratto con colorante fluorescente lipofilico membrana

Questo protocollo descrive un modo efficiente per monitorare la persistenza delle cellule e la biodistribuzione di adiposo-derivate cellule staminali mesenchimali umane (haMSCs) di fluorescenza da' etichettatura in un modello di osteoartrite (KOA) del ginocchio di ratto tramite iniezione intra-articolare (IA).

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare l'efficacia della persistenza cellulare e la biodistribuzione di cellule staminali mesenchimali di derivazione adiposa umana in un'osteoartrite del ginocchio di ratto, o in un modello KOA, utilizzando l'imaging fluorescente in vivo. Il monitoraggio delle cellule staminali in vivo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della matematica rigenerativa sull'irritazione e la distribuzione dell'adiposo umano derivato nelle cellule staminali mesenchimali in modelli animali KOA. Il vantaggio principale dell'utilizzo di DiD è che il suo spettro di emissione spostato nel ratto consente l'imaging dei tessuti profondi in animali vivi senza effetti citotici o danni funzionali alle cellule marcate con colorante.

Inizia posizionando un ratto Sprague Dawley maschio anestetizzato di 250-300 grammi, di età compresa tra 8 e 12 settimane, in posizione laterale sinistra su un cuscinetto riscaldato. Utilizzare un rasoio per radere a fondo il ginocchio destro e disinfettare l'area chirurgica con una soluzione di iodio povidone al 10% e etanolo al 70%. Coprire l'area non chirurgica con un tampone chirurgico.

E usa un bisturi per praticare un'incisione di due centimetri lateralmente lungo il tendine rotuleo per esporre le capsule articolari. Successivamente, utilizzare un bisturi chirurgico per sezionare il legamento collaterale mediale, riflettendo il menisco verso il femore, e afferrare il menisco mediale con una pinza. Usa un bisturi per tagliare il menisco nel punto più stretto dall'attacco tibiale.

Per ottenere un'insorgenza affidabile e fattibile della KOA, il lato femorale del menisco deve essere completamente tagliato in ogni animale da esperimento. Quindi, chiudere la capsula articolare con una sutura osservabile a quattro O e monitorare il ratto fino a quando non si è completamente ripreso. Otto settimane dopo l'intervento chirurgico, staccare le cellule mesenchimali umane di derivazione adiposa da una coltura confluente all'80% con due millilitri di tripsina più EDTA per tre minuti a 37 gradi Celsius.

Dopo alcuni minuti, neutralizzare la tripsina con quattro millilitri di terreno di coltura completo e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Risospendere il pellet a una concentrazione di una volta per 10 fino alla sesta cellula per millilitro in cinque millilitri di terreno di coltura privo di siero. Ed etichettare le cellule con 50 microlitri di soluzione di marcatura cellulare DiD per 50 minuti a 37 gradi Celsius.

Al termine dell'incubazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e lavarle due volte in cinque millilitri di PBS per lavaggio. Dopo l'ultima centrifugazione, diluire le cellule a 2,5 volte 10 fino alla sesta cellula vitale per 100 microlitri di concentrazione di PBS e caricare le cellule in una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 26. Successivamente, radere nuovamente il ginocchio artritico del primo animale da esperimento a esporre l'area articolare e disinfettare la pelle esposta con etanolo al 70%.

Iniettare le cellule marcate al centro del triangolo formato dal lato mediale del legamento rotuleo, dal condilo femorale mediale e dal condilo tibiale mediale e aprire il software di imaging. Inizializzare il sistema di imaging a bioluminescenza in vivo e posizionare gli animali in posizione supina all'interno dello stadio centrale del sistema di imaging. Con lo sportello della camera chiuso, controllare la scatola fluorescente e selezionare i set di filtri fluorescenti di eccitazione ed emissione appropriati.

Impostate il campo visivo su D, la flessione dei pixel su otto, lo stop F su due e il tempo di esposizione su auto. Dopo aver ottenuto le immagini, lasciare che gli animali si riprendano su un termoforo monitorato fino al completo recupero. Quindi, nell'apposito software di analisi delle immagini, selezionare le unità di efficienza radiante per la misura della fluorescenza e le regioni di interesse per l'analisi e quantificare i segnali fluorescenti da ciascuna immagine.

In questo esperimento rappresentativo, sezioni seriali dell'articolazione del ginocchio di un ratto indotto da osteoartrite del ginocchio sono state valutate mediante colorazione H&E e safranina O/Fast Green otto settimane dopo l'intervento chirurgico. Lo spessore della cartilagine articolare è più sottile nelle ginocchia artritiche rispetto alle articolazioni controlaterali senza intervento chirurgico, come osservato nelle sezioni colorate H&E. Inoltre, il proteoglicano è diminuito e il collagene fibrillato è aumentato nell'articolazione dell'artrite come visualizzato dalla colorazione safranina O/Fast Green, indicando la progressione del fenotipo degenerativo dell'osteoartrite del ginocchio indotta dall'intervento chirurgico.

Un'ora dopo la colorazione, le cellule mesenchimali umane di derivazione adiposa marcate con DiD mostrano una forma rotonda in vitro. Dopo 24 ore, le cellule mesenchimali marcate con DiD in coltura dimostrano una forma a fuso lungo confermando che DiD non modifica la capacità di aderenza delle cellule. L'imaging delle ginocchia degli animali osteoartritici otto settimane dopo l'intervento chirurgico rivela la presenza di cellule marcate con DiD dal giorno zero fino al giorno 70 dopo l'iniezione.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della terapia con cellule staminali per determinare la routine e il dosaggio ottimali per l'iniezione sicura e fattibile di cellule staminali mesenchimali per il trattamento dell'artrosi del ginocchio negli animali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come marcare le cellule staminali mesenchimali umane con DiD per l'iniezione e il monitoraggio in vivo nel modello KOA di ratto indotto chirurgicamente.