Rapida, regia di differenziazione delle cellule epiteliali del pigmento retinico da cellule staminali pluripotenti umane embrionali o indotto

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di dirigere efficacemente la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti in cellule epiteliali pigmentate retiniche in uno strato omogeneo. Questo metodo aiuta a rispondere a domande nel campo della ricerca retinica e oculistica, come ad esempio come si sviluppa la retina e come stabilire un modello di malattia con cellule staminali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è più veloce ed efficiente dei metodi spontanei.

Questo metodo utilizza una combinazione di fattori di crescita e piccole molecole per dirigere la differenziazione delle cellule staminali in modo che diventino RPE immature in 14 giorni e RPE funzionali mature dopo tre mesi. A dimostrare parti della procedura sarà Cassidy Arnold, direttore associato del laboratorio di biologia e ingegneria delle cellule staminali presso l'UC Santa Barbara. Per iniziare questa procedura, far crescere le colonie di cellule staminali in condizioni prive di alimentazione e siero fino a circa l'80% di confluenza prima del passaggio.

Quindi rivestire una piastra a 12 pozzetti con idrogel a base di matrice extracellulare secondo le raccomandazioni del produttore e lasciarla solidificare per un'ora a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo di che aliquotare il volume dei mezzi di differenziazione retinica e PBS senza calcio o magnesio necessari per il giorno zero e riscaldarli a bagnomaria a 37 gradi Celsius. Quindi aggiungi i fattori di crescita all'RDM riscaldato e porta l'EDTA a temperatura ambiente.

Se necessario, rimuovere tutte le colonie differenziate utilizzando un puntale per pipetta P10 in base alla morfologia dalle cellule staminali che verranno fatte passare per la differenziazione. Le cellule fibroblastiche tra le colonie, così come le cellule opache all'interno delle colonie, indicano le cellule differenziate da rimuovere. La rimozione manuale delle cellule è una delle fasi più critiche del protocollo, perché partire da una popolazione di cellule staminali completamente indifferenziata consentirà un arricchimento più efficiente.

Successivamente passaggio di un singolo pozzetto di una piastra a sei pozzetti in quattro pozzetti di una piastra a 12 pozzetti aspirando il terreno dalle cellule staminali e lavando i pozzetti una volta con due millilitri di PBS preriscaldato. Successivamente, aspirare il PBS e sciacquare ogni pozzetto tre volte con un millilitro di EDTA per pozzetto. Quindi inclinare delicatamente la piastra e aspirare l'EDTA.

Non agitare in alcun modo la piastra per evitare di sollevare prematuramente le celle. Dopo il terzo lavaggio, aggiungere nuovamente un millilitro di EDTA e incubare la piastra a temperatura ambiente nella cappa per tre-cinque minuti. Non disturbare la piastra durante questa incubazione.

Successivamente, aspirare l'EDTA e aggiungere un millilitro di RDM per pozzetto che verrà posizionato più 0,5 millilitri di terreno extra. Ad esempio, lavare un pozzetto di una piastra a sei pozzetti con 4,5 millilitri di RDM per placcare su quattro pozzetti di una piastra a 12 pozzetti. Quindi, usa un raschietto per staccare delicatamente le cellule.

Triturare le cellule in RDM pipettando su e giù cinque volte nel pozzetto e completare rapidamente questo passaggio per evitare il riattaccamento alla piastra. Mettere in un tubo conico. Dissociare grandi gruppi di cellule ma non triturare in sospensione a singola cellula.

Distribuire le cellule in modo uniforme nella pipetta e completare rapidamente questo passaggio per evitare che si riattacchino alla piastra. Se lo si desidera, utilizzare un microscopio ottico per osservare le dimensioni dei grumi di cellule. Successivamente, seminare le cellule su piastre a 12 pozzetti rivestite con ECM.

Inclinare la piastra avanti e indietro per distribuire uniformemente le cellule in tutti i pozzetti e posizionarla in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 fino al successivo cambio di terreno. In questa procedura, rivestire una piastra a sei pozzetti con ECM ridotto dal fattore di crescita secondo le raccomandazioni del produttore. Lasciarlo riposare per un'ora a temperatura ambiente durante la notte a quattro gradi Celsius.

Quindi aliquotare la quantità di DPBS necessaria e un millilitro di RDM per pozzo di arricchimento e riscaldarli a 37 gradi Celsius a bagnomaria. Portare l'enzima tripsina-simile a temperatura ambiente e riscaldare la quantità necessaria di terreno di supporto RPE a 37 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere un reagente antimicrobico e un inibitore ROCK all'RSM per ottenere una concentrazione finale di 0,5 volte l'antimicrobico e 10 l'inibitore ROCK micromolare.

Usa questo mezzo per i primi quattro-sette giorni per migliorare l'attaccamento. Quindi, aspirare il terreno esaurito da tutti i pozzetti e aggiungere un millilitro per pozzetto di RDM preriscaldato senza fattori di crescita. Se necessario, sezionare e raschiare via tutte le cellule non RPE utilizzando un puntale per pipetta P10 al microscopio da dissezione.

Dopo la dissezione, aspirare l'RDM e tutti i detriti cellulari e lavarli due volte con un millilitro di DPBS preriscaldato per pozzetto. Successivamente, aggiungere 0,5 millilitri di TDE per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, utilizzare un raschietto per rimuovere delicatamente le cellule dalla piastra.

Triturare delicatamente la sospensione enzimatica cellulare pipettandola su e giù tre o quattro volte per creare una sospensione uniforme. Successivamente, diluire la sospensione enzimatica cellulare in un rapporto da uno a 10 nell'RSM preriscaldato senza inibitore ROCK. Centrifugare la sospensione cellulare a 173 g per cinque minuti a temperatura ambiente.

Dopo cinque minuti, aspirare il terreno dal pellet cellulare e risospendere le cellule in RSM con 10 inibitori micromolari di ROCK. Quindi, filtrare le cellule utilizzando un colino a rete di nylon con pori da 40 micrometri. Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro e calcolare la concentrazione di cellule nella soluzione filtrata.

Successivamente, seminare le cellule sulle piastre rivestite di ECM ridotte con fattore di crescita in una volta da 10 a cinque cellule per centimetro quadrato in quattro millilitri di RSM con 10 inibitori micromolari di ROCK. Sostituire l'RSM con 10 inibitori micromolari di ROCK 48 ore dopo la semina cellulare e continuare a sostituire il terreno ogni tre o quattro giorni. Interrompere l'aggiunta dell'inibitore ROCK all'RSM dopo quattro-sette giorni.

Lasciare maturare le cellule per 28-35 giorni a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 e continuare a sostituire l'RSM ogni tre o quattro giorni. Qui sono mostrate le cellule staminali pluripotenti indotte immediatamente prima del passaggio per la differenziazione. Le cellule staminali sono piccole e densamente impacchettate all'interno delle colonie, che non sembrano contenere cellule differenziate come fibroblasti o passaggi opachi all'interno delle colonie.

Ecco le cellule RPE immature al secondo giorno. Le celle in questa fase dovrebbero essere ancora subconfluenti ed estendere le proiezioni negli spazi vuoti tra le celle. Queste celle vengono prelevate prima di rimuovere l'arricchimento il giorno 14.

Le cellule non RPE appaiono come macchie o nastri opachi. La macchia rotonda contiene cellule con una morfologia fibroblastica, mentre si pensa che le macchie opache siano retina neurale. Queste immagini mostrano l'RPE al passaggio zero, uno e tre del giorno 30.

Ad ogni passaggio, le cellule dovrebbero essere confluenti e sembrano avere i segni distintivi della morfologia epiteliale pigmentata retinica, inclusi bordi lucidi di fase e una forma poligonale. Una volta padroneggiate, le tecniche di passatura e arricchimento possono essere completate in una o due ore a seconda della scala della coltura cellulare. Seguendo questa procedura, tecniche come la quantificazione di geni o proteine e saggi funzionali possono essere utilizzati per rispondere a domande sulla capacità dell'RPE di secernere fattori di crescita o di fagocitare i segmenti esterni.

Gli articoli pubblicati da Dave Buchholz nel 2013 e Lindsay Leach nel 2015 descrivono in dettaglio lo sviluppo e l'ottimizzazione di questo metodo. Abbiamo fornito una dimostrazione dettagliata e approfondita di ogni fase della procedura per renderla prontamente disponibile ai ricercatori del settore. Buon esperimento.