Microinjection di proteine CRISPR/Cas9 in Channel Catfish, Ictalurus punctatus, embrioni per Gene Editing

Microiniezione della proteina CRISPR/Cas9 in embrioni di pesce gatto canale, Ictalurus punctatus per l'editing genetico. Lo sviluppo di un protocollo affidabile ed efficiente per l'editing genetico mirato nel pesce gatto del canale è fondamentale per lo studio della genomica funzionale. Soprattutto dopo che le risorse genomiche sono state arricchite dal sequenziamento del genoma del pesce gatto del canale.

Qui presentiamo un protocollo dettagliato per l'editing del genoma CRISPR/Cas9 nel pesce gatto del canale. Questo protocollo è stato sviluppato e convalidato prendendo di mira due geni immunitari correlati al pesce gatto canale. Il dominio del recettore Toll/interleuchina-1 contenente la molecola adattatrice, o gene TICAM1, e la lectina legante il ramnosio o gene RBL.

Tutte le procedure sono state eseguite presso l'unità di ricerca sulla genetica dei pesci dell'EW Shell Fisheries Research Center presso l'Università di Auburn in Alabama. Selezione dei riproduttori e deposizione delle uova. Scegli un riproduttore sano di pesce gatto di canale da un ceppo o da una linea genetica che desideri modificare.

I maschi e le femmine di pesce gatto del canale dovrebbero mostrare buone caratteristiche sessuali secondarie. Seleziona i maschi che hanno una testa larga e muscolosa che è più larga del resto del loro corpo con una papilla genitale ben sviluppata. Anche il colore scuro e le ferite cicatriziali dei combattimenti territoriali sono segni di prontezza sessuale.

Seleziona le femmine che hanno la testa più stretta del resto del corpo e hanno un addome morbido, palpabile e ben arrotondato. Per garantire la precisione e per evitare di stressare il pesce durante la manipolazione iniziale, interrompere l'alimentazione delle femmine due o tre giorni prima di esaminare la loro prontezza per la deposizione delle uova. La manipolazione del pesce deve essere eseguita rapidamente ma con attenzione per ridurre lo stress da manipolazione.

Tutte le procedure che richiedono la manipolazione delle femmine devono essere eseguite mentre i pesci sono tenuti nei sacchi per la deposizione delle uova. Poco prima dell'iniezione di ormoni, ottenere il peso corporeo delle femmine. I sacchi per la deposizione delle uova con le femmine all'interno possono quindi essere appesi in una vasca a flusso continuo con flusso d'acqua continuo e un'adeguata aerazione.

Caricare asetticamente l'implanter che ha un ago calibro 14 con 85 microgrammi per chilogrammo di analogo dell'ormone di rilascio dell'ormone luteinizzante. LHRHA. Sciacquare il sito di iniezione e la muscolatura dorsale con soluzione salina sterile allo 0,9% prima dell'iniezione. Inserire l'implanter con un angolo di 45 gradi e rilasciare l'impianto.

Estrarre l'ago e pulire il sito di iniezione con un batuffolo di cotone precedentemente imbevuto di etanolo al 70%. Posiziona il sacco per la deposizione delle uova nella vasca di contenimento in modo che il pesce sia completamente immerso nell'acqua da 15 a 20 centimetri sotto la superficie dell'acqua. Un'adeguata aerazione, comprese cinque o più parti per milione di ossigeno disciolto, una buona qualità dell'acqua sono importanti per l'ovulazione di ovuli di alta qualità.

Prevedi il tempo di ovulazione in base alla temperatura dell'acqua utilizzando la relazione in gradi ora. Di solito il primo controllo degli ovuli viene effettuato a circa 36 ore dall'iniezione di ormone e poi a intervalli di quattro ore. Per verificare l'ovulazione, solleva delicatamente il sacchetto per la deposizione delle uova sopra la superficie dell'acqua mentre cerchi le uova attaccate all'interno del sacchetto.

Quando vedi le uova, almeno 10 o giù di lì, questa femmina sta ovulando ed è pronta per essere spogliata a mano. Preparazione dello sperma. Gli spermatozoi possono essere preparati alcune ore prima dell'orario previsto per l'ovulazione.

I pesci maschi vengono soppressi e i testicoli vengono raccolti in un piccolo piatto di pesatura. Determina il peso dei testicoli. Rimuovere qualsiasi tessuto e lavare i testicoli con una soluzione salina allo 0,9% per rimuovere il sangue, se necessario.

I testicoli ben sviluppati sono bianchi con molte sporgenze villiformi. Schiacciare i testicoli e filtrare gli spermatozoi utilizzando una maglia da 100 micron. Utilizzare una soluzione salina allo 0,9% per lavare lo sperma dalla rete in una provetta da 50 millilitri.

La soluzione salina può essere aggiunta fino a 10 millilitri per grammo di testicoli. Determinare la concentrazione degli spermatozoi. Controllare la motilità e la vitalità.

Tuttavia, per queste procedure ciò non è necessario se i testicoli sono ben sviluppati. Lo sperma può quindi essere conservato a quattro gradi C e deve essere utilizzato entro 24 ore dalla preparazione. Raccolta e fecondazione degli ovociti.

Applicare uno strato molto sottile di grasso vegetale su una padella di deposizione delle uova pulita e asciutta di 20 centimetri di diametro. Mettere la femmina in una soluzione anestetica contenente 100 parti per milione di metanosolfonato di tricaina tamponato con bicarbonato di sodio fino a quando il pesce non è completamente anestetizzato. Rimuovi con cura il pesce dal sacchetto per la deposizione delle uova e immergilo in soluzione salina allo 0,9% per lavare via l'anestetico.

Asciugare completamente il pesce con un asciugamano pulito, evitando di rimuovere lo strato di muco sulla superficie del corpo del pesce. Applicare grasso vegetale nell'area intorno allo sfiato, comprese le pinne pelviche, per presentare l'attaccamento delle uova durante lo stripping manuale. Spellare a mano le uova nella teglia unta applicando una leggera pressione sulle ovaie.

Le uova buone dovrebbero fluire liberamente, essere di colore giallo dorato e avere grumi o coaguli di sangue minimi o assenti. Evitare il contatto tra le uova e l'acqua prima della fecondazione poiché l'acqua può stimolare la chiusura del micropilo. Per fecondare le uova per la micro iniezione, trasferirle a 200-300 uova in una bacinella di deposizione unta.

Aggiungere uno o due millilitri di soluzione di sperma agli ovuli e mescolare delicatamente. Aggiungi acqua fresca agli ovuli per attivare lo sperma e gli ovuli. Va aggiunta abbastanza acqua per coprire leggermente le uova.

Agitare delicatamente le uova per 30 secondi. La fecondazione dovrebbe avvenire in uno o due minuti. È importante fecondare le uova in un unico strato.

Le uova di pesce gatto aderiscono l'una all'altra, rendendo difficile la microiniezione di più strati di embrioni. Aggiungi altra acqua fresca alle uova fecondate e lascia che le uova si induriscano per 10-15 minuti. Le uova rimanenti non fecondate possono essere coperte con un asciugamano bagnato per evitare che si secchino e possono essere fecondate in poche ore.

La concimazione può essere effettuata in modo scaglionato. Un lotto da due a 300 ovuli può essere fecondato ogni 30-60 minuti per garantire l'alimentazione continua di embrioni allo stadio di una cellula per la micro iniezione e il controllo degli embrioni non iniettati. Estrazione e caricamento dell'ago.

Estrarre un capillare di vetro borosilicato con diametro esterno di un millimetro in due aghi. Conservare gli aghi in una scatola di carta con un pezzo di spugna in cui sono state praticate diverse incisioni. Per evitare di rompere l'ago, il diametro della spugna deve essere inferiore alla lunghezza dello stelo dell'ago.

La punta dell'ago può quindi essere aperta rompendo un piccolo pezzo di ago nella regione più sottile utilizzando un oggetto appuntito. In alternativa, l'ago può essere aperto pizzicando la regione più sottile della punta con un paio di pinze al microscopio. Preparare la soluzione iniettabile mescolando gli RNA guida con la proteina Cas9.

Il rosso fenolo può essere aggiunto per colorare la miscela proteica dell'RNA guida Cas9, con il rosso fenolo che costituisce fino a un terzo del volume totale. La miscela viene quindi incubata per 10 minuti su ghiaccio prima dell'uso. Con un micro caricatore, caricare 5-10 microlitri della miscela di RNA guida Cas9 nell'ago di iniezione.

Inserendo il micro caricatore nello stelo dell'ago ed espellendo lentamente la miscela mentre si ritrae la punta del micro caricatore. Evitare di intrappolare bolle d'aria all'interno. Fissare l'ago al supporto della micropipetta e garantire una connessione saldo.

E poi collegare il supporto al micro manipolatore. Garantire un movimento libero e stabile. Applicare la pressione per la microiniezione aprendo la bombola di azoto e regolando il regolatore di pressione.

Il volume di iniezione può essere influenzato dalla pressione, dal diametro dell'apertura dell'ago e dalla durata dell'iniezione. Per determinare il volume che si desidera iniettare, iniettare in una goccia di olio minerale posta su un emocitometro. Se necessario, la pressione e il diametro dell'ago possono essere regolati per aumentare o diminuire il volume dell'iniezione.

Iniettare più volte nell'olio minerale per garantire un volume costante. Micro iniezione di embrioni di pesce gatto. Applicare uno strato molto sottile di grasso vegetale su una piastra di Petri pulita di 100 millimetri.

Trasferire da 50 a 100 uova dalla vaschetta di fecondazione alla capsula di Petri e coprirle con la soluzione di Holtfreter. Le uova devono essere allineate l'una contro l'altra in un unico strato. Questo allineamento dovrebbe mantenere le uova in posizione durante il processo di microiniezione.

Posizionare la capsula di Petri con le uova sul tavolino del microscopio e tenerla con una mano. Abbassa l'ago con l'altra mano fino a perforare il corion e il tuorlo con un unico movimento regolare. La punta dell'ago deve essere il più vicino possibile al blastodisco prima di erogare il materiale di iniezione.

Premere il pedale ed erogare il materiale di iniezione nel tuorlo. Se il blastodisco non è chiaramente visibile, il materiale di iniezione può essere distribuito in diverse posizioni in tutto il tuorlo. Per fare ciò, l'ago viene inserito all'estremità più lontana del tuorlo.

Quindi premere il pedale ed estrarre contemporaneamente l'ago. Questo diffonde il materiale di iniezione in diversi punti del tuorlo. 50 nanolitri contenenti 2,5 nanogrammi di RNA guida e 7,5 nanogrammi di proteina Cas9 possono essere iniettati nel tuorlo senza problemi.

Ritrarre l'ago dolcemente per non danneggiare l'uovo. Quindi spostare la capsula di Petri per iniettare un altro uovo con la stessa procedura. Evitare di muovere la capsula di Petri durante il processo di iniezione in quanto ciò potrebbe danneggiare l'ovulo o rompere l'ago.

Rimuovere gli ovuli che si sono rotti o danneggiati a causa della microiniezione. L'iniezione può essere iniziata da 15 a 20 minuti dopo la fecondazione e continua finché gli embrioni sono ancora nello stadio di una cellula. Gli embrioni iniettati vengono riposti nella soluzione di Holtfreter con 10 PPM di doxiciclina e un'aerazione continua per sei-sette giorni fino alla schiusa.

La soluzione viene cambiata quotidianamente e gli embrioni morti vengono rimossi. Risultati. Questa figura mostra le mutazioni indotte da CRISPR/Cas9 nel gene TICAM1 del pesce gatto del canale. La sequenza blu rappresenta il motivo adiacente al protospaziatore o PAM, mentre la sequenza verde rappresenta il bersaglio per l'RNA guidato.

Ci si aspettava che si verificasse una rottura a doppio filamento indotta dalla proteina Cas9 nel sito dei due triangoli rossi. Le mutazioni di delezione sono rappresentate da una linea tratteggiata, in cui ogni trattino corrisponde a un nucleotide che è stato eliminato. Le sequenze rosse sono inserzioni mentre il viola rappresenta la mutazione di sostituzione.

Le frazioni di 78 rappresentano il numero di alleli mutati in 78 reazioni di sequenziamento. Ad esempio, 3/78 significa che un allele è stato rilevato in tre reazioni di sequenziamento su un totale di 78 reazioni. Il tasso di mutazione è stato del 79,2% in 24 individui analizzati.

Le mutazioni hanno provocato la rimozione di alcuni amminoacidi di troppo dalla proteina, modificando il frame di lettura a valle e terminando prematuramente la traduzione. Nella maggior parte delle mutazioni, oltre l'80% della sequenza proteica prevista per TICAM1 è stata troncata a causa del codone di stop prematuro. Questa figura mostra le mutazioni indotte da CRISPR/Cas9 nel gene RBL del pesce gatto del canale.

Le sequenze esoniche sono maiuscole mentre le sequenze introniche sono lettere minuscole. Le sequenze blu rappresentano il motivo adiacente al protospaziatore, mentre la sequenza verde rappresenta il bersaglio per l'RNA guidato. Ci si aspettava che si verificasse una rottura a doppio filamento indotta dalla proteina Cas9 nel sito dei due triangoli rossi.

Le mutazioni di delezione sono rappresentate da una linea tratteggiata in cui ogni trattino corrisponde a un nucleotide che è stato eliminato. Le sequenze rosse sono inserzioni. Le frazioni di 40 rappresentano il numero di alleli mutati in 40 reazioni di sequenziamento.

Ad esempio, 2/40 significa che un allele è stato rilevato in due reazioni di sequenziamento su un totale di 40 reazioni. Il tasso di mutazione è stato dell'87,5% in 40 individui analizzati. Le delezioni vanno da cinque coppie di basi a 183 coppie di basi, mentre sono state inserite fino a 20 coppie di basi.

Più del 70% degli indels ha portato a una proteina troncata che era del 10% o inferiore alla lunghezza della proteina wild type. In questo video, abbiamo dimostrato come microiniettare la proteina CRISPR/Cas9 in embrioni di pesce gatto di un canale cellulare. Le procedure descritte sono semplici, rapide ed efficienti.

E ha raggiunto con successo il knockout genico in due geni di pesce gatto canale. TICAM1 e RBL. A seconda di ciò che viene iniettato, il protocollo può essere modificato per includere altre sostanze biologicamente attive.

Può anche essere modificato per microiniettare altre specie di pesce gatto o altre specie di pesci che hanno una struttura e una composizione delle uova simili.