Costruzione e valutazione di un modello murino Osteolysis Calvarial tramite l'esposizione a particelle di CoCrMo in allentamento asettico
17 febbraio 2018
Questo manoscritto descrive un modello murino calvarial osteolisi da esposizione a particelle di CoCrMo, che costituisce un modello animale ideale per valutare le interazioni tra le particelle di usura e varie cellule nella mobilizzazione asettica.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di costruire e valutare il modello di osteolisi calvariale murina mediante esposizione a nanoparticelle di cobalto-cromo-molibdeno. L'osteolisi indotta da particelle di usura è una delle principali cause di allentamento asettico nel fallimento dell'artroplastica, ma i meccanismi sottostanti non sono chiari. A causa del lungo tempo di follow-up e dell'insorgenza sporadica, è difficile esplorare la partogenesi dell'allentamento asettico nei casi clinici.
Pertanto, è necessario un modello animale soggetto a usura per ulteriori studi. Nel nostro laboratorio, un modello di osteolisi calvariale muriale costruito con particelle di lega di cobalto è un modello efficace per studiare la partrogenesi dell'allentamento asettico. Ciò si ottiene generando prima particelle di cobalto-cromo-molibdeno su scala nanometrica da protesi in lega di cobalto e risospendendole in soluzione salina tampone fosfato a una concentrazione di 15 milligrammi per millilitro.
Il passo successivo consiste nell'identificare la posizione dell'incisione in corrispondenza di una linea tra i due punti medi tra due occhi e due orecchie, rispettivamente. Quindi, rimuovere il periostio cranico dal calvario mediante dissezione d'urto. Successivamente, prelevare 50 microlitri di nanoparticelle di lega di cobalto e incorporarle nella sutura centrale della calvaria.
Dopo due settimane di mantenimento, sacrificare alcuni topi e raccogliere la calvaria per la valutazione dell'osteolisi. L'osteolisi è evidente nei topi trattati con nanoparticelle in lega di cobalto, sia nelle immagini di colorazione micro-CT che in quelle di colorazione H ed E. Ottenere la lega di cobalto-cromo-molibdeno dalla protesi della lega di cobalto, ottenendo le particelle di cobalto-cromo-molibdeno dalla lega di cobalto-cromo-molibdeno mediante corrente continua di tre elettrodi ad alto vuoto.
Per quantificare il diametro medio delle particelle di cobalto-cromo-molibdeno, prendere un milligrammo di particelle in 1,5 millilitri di etanolo anidro e sospenderle mediante agitazione ultrasonica. Applicare una goccia, circa 20 microlitri, della sospensione sulla tavola obiettiva della microscopia elettronica a trasmissione e acquisire una serie di immagini. Utilizzare il software fornito per calcolare il diametro medio e la distribuzione granulometrica nelle immagini TEM.
Ecco le immagini TEM rappresentative sul pannello di sinistra, quello di destra mostra la distribuzione della dimensione delle nanoparticelle della lega di cobalto-cromo-molibdeno calcolata dal nostro software commerciale. Il diametro medio è di circa 50 nanometri. Autoclavare le particelle per 15 minuti per rimuovere le endotossine.
Quindi, risospenderli in soluzione salina tamponata con fosfato a una concentrazione di 15 milligrammi per millilitro come soluzione madre. Il prossimo passo è la costruzione del modello di osteolisi calvariale. Seleziona e anestetizza topi di sei settimane: sei topi per gruppo.
Posiziona gli animali in posizione privilegiata. Rimuovere il pelo e disinfettare la pelle del cranio con etanolo al 75%. Per l'incisione, identificare i due punti medi tra i due occhi e le orecchie, rispettivamente, e incidere la pelle lungo la linea che li unisce.
Rimuovere con cura e completamente il periostio cranico dal calvario mediante dissezione d'urto. Una chiara dissezione del periostio intensifica le interazioni tra le particelle nella calvaria. La sutura viene eseguita con cura su entrambe le estremità dell'incisione in una semplice sutura interrotta.
Di solito, sono necessari tre punti di sutura per una sutura completa. Per l'ultima fase, far passare la linea di sutura attraverso l'incisione senza annodare, tenendo entrambe le estremità della linea di sutura. Prelevare 15 microlitri di nanoparticelle in soluzione madre in lega di cobalto e inserirle nella sutura centrale della calvaria.
Annodare l'ultimo punto in una semplice sutura interrotta. Mantieni i topi per altre due settimane. Due settimane dopo, sacrifica l'animale e raccogli la calvaria.
Pulisci delicatamente tutti i tessuti molli sui campioni di calvaria con una pinzetta e fissa il tessuto in paraformaldeide al quattro percento a quattro gradi Celsius. Per la valutazione dell'osteolisi nel modello indotto da nanoparticelle di cobalto-cromo-molibdeno, eseguire la micro-CT ad alta risoluzione 24 ore prima della scansione micro-CT. Trasferimento di campioni di calvaria in soluzione salina tamponata con fosfato da paraformaldeide.
Il giorno della scansione micro-CT, raccogliere campioni di calvaria da soluzione salina tamponata con fosfato e fissarli su un supporto associato a uno strumento. Scansione della calvaria su strumento micro-CT. Esegui la ricostruzione tridimensionale con software assortiti.
La colorazione H ed E è un altro strumento per la valutazione dell'osteolisi in un modello indotto da nanoparticelle. Decalcificare i campioni di calvaria nella soluzione salina tamponata con fosfato, contenente il 15% di eilendiamminotetraacetico per tre settimane a quattro gradi Celsius. Incorporare la calvaria decalcificata nella paraffina e tagliarla in sezioni di due micrometri nell'area di deposizione delle particelle.
Colorare le sezioni con ematossilina ed eosina. Osservare il passaggio complessivo attraverso il morfismo e la microscopia ottica e acquisire micrografie. Ecco le immagini micro-CT rappresentative.
Le immagini di ricostruzione tridimensionale dei dati micro-CT sono mostrate nel pannello di sinistra. Nel pannello di destra sono mostrate le immagini della sezione trasversale dei topi di controllo, dell'operazione sham e dei topi trattati con nanoparticelle. L'osteolisi è evidente nel gruppo di trattamento con nanoparticelle.
Di seguito è riportata un'analisi quantitativa delle fotografie micro-CT da parte del software associato agli strumenti. Le misurazioni includono la densità minerale ossea, il volume osseo o il rapporto del volume totale, la percentuale di porosità totale, il numero trabecolare, lo spessore trabecolare e la separazione o la spaziatura trabecolare. I topi trattati con nanoparticelle di lega di cobalto mostrano una densità minerale ossea e un volume osseo significativamente inferiori, con una percentuale più elevata di porosità totale rispetto agli animali di controllo.
Ecco le immagini rappresentative della colorazione H ed E per campioni di calvaria da topi di controllo, con operazione fittizia e trattati con nanoparticelle. L'osteolisi è evidente anche nel gruppo di trattamento con nanoparticelle. Il modello di osteolisi calvariale murina costruito con nanoparticelle in lega di cobalto ha un alto tasso di successo nella modellazione dell'osteolisi indotta da particelle di usura.
Di seguito sono riportati alcuni fattori chiave. In primo luogo, le nanoparticelle di lega di cobalto migliorano l'interazione tra le particelle di usura e la calvaria. In secondo luogo, un'adeguata esposizione della calvaria e una chiara dissezione del periostio rendono l'interazione tra le particelle e la calvaria più intensa.
In terzo luogo, le misurazioni quantitative della perdita ossea mediante micro-TC facilitano l'accesso alle differenze nella perdita ossea tra i vari trattamenti, fornendoci solide prove per l'osteolisi rispetto alla tradizionale istomorfometria ossea. Il modello di osteolisi della calvaria di usura costruito con particelle di lega di cobalto è un modello ideale per studiare l'interazione tra la particella di usura e le diverse cellule nell'allentamento asettico. Come microfagi, fibroblasti, osteoclasti e osteoblasti.
Speriamo che il nostro modello sia utile per lo studio sull'allentamento asettico in futuro.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo manoscritto descrive un modello murino di osteolisi calvarica indotta da nanoparticelle di cobalto-cromo-molibdeno, che costituisce un modello animale ideale per valutare le interazioni tra particelle di usura e diverse cellule nel allentamento asettico. Questo modello è fondamentale per comprendere la patogenesi dell'osteolisi associata al fallimento dell'artroplastica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Ortopedia
Sfondo
- L'osteolisi indotta dalle particelle è una causa significativa del allentamento asettico negli impianti articolari.
- La meccanica alla base di questo processo rimane poco chiara.
- Gli studi clinici incontrano difficoltà a causa dei lunghi tempi di follow-up e delle manifestazioni sporadiche.
- Un modello animale affidabile è essenziale per ulteriori indagini.
Scopo dello studio
- Costruire e valutare un modello murino di osteolisi calvarica.
- Studiare le interazioni tra particelle di cobalto-cromo-molibdeno e diverse cellule.
- Migliorare la comprensione della patogenesi del allentamento asettico.
Metodi Utilizzati
- Generazione di particelle su scala nanometrica di cobalto-cromo-molibdeno da protesi in lega al cobalto.
- Risospensione delle particelle in soluzione salina tamponata al fosfato a una concentrazione di 15 mg/mL.
- Esposizione del tessuto calvarico murino alle particelle.
- Valutazione delle interazioni cellulari e delle risposte osteolitiche.
Risultati principali
- Il modello murino riproduce efficacemente l'osteolisi indotta dalle particelle di usura.
- Le interazioni tra le particelle e le cellule sono state valutate con successo.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dei meccanismi del allentamento asettico.
- Questo modello può essere utilizzato per futuri studi sul fallimento dell'artroplastica.
Conclusioni
- Il modello murino di osteolisi calvarica è uno strumento prezioso per la ricerca.
- Fornisce informazioni sulla patogenesi dell'osteolisi.
- Questo modello può contribuire a sviluppare strategie per ridurre il allentamento asettico.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'osteolisi indotta dalle particelle rimane una delle principali cause di allentamento asettico nel fallimento delle protesi articolari, tuttavia la comprensione dei meccanismi alla base è limitata dai vincoli degli studi clinici. Il modello murino della calvaria fornisce un sistema rapido e quantificabile per valutare le interazioni tra particelle e cellule, consentendo la riduzione del rischio preclinico di biomateriali e progettazioni di impianti. Questo approccio supporta la validazione degli obiettivi terapeutici e aumenta la fiducia predittiva nei processi di ricerca e sviluppo ortopedici nelle fasi iniziali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche riguardanti le interazioni tra particelle di usura e macrofagi, fibroblasti, osteoblasti e osteoclasti.
- Valore operativo: Facilita la riduzione del rischio biologico mediante la valutazione quantitativa della perdita ossea tramite micro-TC e istomorfometria.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio attraverso la modellizzazione delle risposte osteolitiche per guidare la scelta dei materiali degli impianti.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera output biologici standardizzati (densità minerale ossea, parametri trabecolari) per la valutazione di composti o rivestimenti.
- Riproducibilità: Un'elevata percentuale di successo e una bassa variabilità consentono lo screening su larga scala di modifiche alle particelle.
- Utilità della piattaforma: Compatibile con modelli transgenici/knockout per analizzare i percorsi meccanicistici nell'osteolisi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Modella la patogenesi del allentamento asettico per collegare la scoperta alla validazione preclinica.
- De-risking meccanicistico: Chiarisce i percorsi cellulari e molecolari che guidano l'osteolisi, al fine di prioritizzare i bersagli.
- Continuità traslazionale: Fornisce endpoint quantitativi (volume osseo, porosità) predittivi della performance dell'impianto in vivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il modello si inserisce nel continuum dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo la verifica di ipotesi nella fase iniziale della scoperta, lo sviluppo di saggi per lo screening e la valutazione meccanicistica prima dell'identificazione del composto leader.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui percorsi infiammatori e osteolitici indotti da particelle.
- Screening: Fornisce letture quantitative e standardizzate (parametri ossei da micro-TC) per la valutazione affidabile di composti o biomateriali.
- Analisi: Genera output misurabili (densità minerale ossea, spessore trabecolare, porosità) per confrontare diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega l'esposizione a particelle agli esiti osteolitici, fornendo informazioni per decisioni di avanzamento preclinico.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la valutazione di diverse particelle da usura e rivestimenti di impianti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nell'osteolisi indotta da particelle.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità attraverso protocolli definiti di esposizione alle particelle e valutazioni quantitative.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo una valutazione precoce del rischio biologico dei materiali degli impianti.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei biomateriali aggiustata in base al rischio, in base al potenziale osteolitico.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in chirurgia murina, manipolazione delle particelle e imaging micro-TC.
- Dipende da strumentazione per la generazione di particelle (elettrodo DC ad alto vuoto), preparazione delle sospensioni e quantificazione dell'osteolisi.
- Necessita di standardizzazione tra gruppi diversi per la somministrazione delle particelle, la tecnica chirurgica e i flussi di analisi.
- Aspetti da considerare per l'adattamento includono l'idoneità del modello per la valutazione della cronicità e studi sul carico meccanico.
- Limite pratico: non consente di valutare gli effetti delle forze meccaniche o dell'esposizione cronica a lungo termine alle particelle in base al materiale di origine.
