Name: Personalizzato Peptide matrici per il rilevamento di anticorpi HLA nei trapianti dorgano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Scopri il metodo di array antigenico personalizzato per rilevare alloanticorpi HLA anti-donatore nei trapianti d'organo. Questa tecnica utilizza set antigenici personalizzati basati sulle sequenze HLA individuali per migliorare la comprensione delle risposte immunitarie.

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Ringraziamo la d. ssa Shawn Li e Li Xing della Western University in Canada per la loro assistenza gentile con SPOT produzione di matrice. Siamo grati ai membri del personale presso il nucleo di istocompatibilità e presso la completa Transplant Center della Northwestern University per la fornitura di servizi di esempio. Questo lavoro è stato parzialmente supportato da ausiliari Board di Northwestern Memorial Hospital e da un fondo di avvio facoltà forniti dalla Northwestern University di J.J..

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dalla Northwestern University Institutional Review Board (IRB protocollo #: STU00104680). Un flusso di lavoro complessivo del protocollo è illustrato nella Figura 1.
 1. analisi bioinformatica di donatore e destinatario HLA sequenze <ol><li>recuperare sequenze dal database di IMGT/HLA 15.
	<ol><li>Il report tipizzazione HLA di ottenere sia il donatore dell'organo e il suo destinatario. 
		Nota: Garantire procedure adeguate per proteggere cartelle cliniche riservate sono utilizzate. In genere, è necessaria per le linee guida istituzionali IRB un'approvazione Institutional Review Board (IRB) di protocollo di studio o di prova sperimentale. Se rapporti di HLA sono stati da PCR-basata digitando (di alta o bassa risoluzione) o basati su sequenziamento digitando (SBT), passare direttamente al punto 1.1.3. Se le sequenze sono state ottenute dal sequenziamento genomico/HLA e se sono completi, utilizzare queste sequenze direttamente invece. Occasionalmente, quando digitando solo incomplete o sequenziamento risultati sono disponibili, seguire il passaggio aggiuntivo 1.1.2. per assegnare il &#34; mancante &#34; alleli tramite lo strumento di web descritto al punto 1.1.2.</li>
		<li>Apri le combinazioni ambigue Allele seguendo web link - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html e la ricerca utilizzando il &#8220; ambiguo strumento di ricerca di combinazioni di Allele &#8221; funzione per recuperare gli alleli ipotetici. Quindi, passare al punto 1.1.3. per immettere il nome di allele.</li>
		<li>Aprire il modulo di Query IMGT/HLA Allele al seguente il link web - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html e l'oggetto input &#8217; nomi di allele s (ognuna individualmente, come mostrato nella Figura 2) nella &#8220; ricerca per &#8221; casella. Fare clic sul &#8220; ricerca di alleli ora &#8221; pulsante. Nomi di allele HLA devono utilizzare sistemi di denominazione standard (cioè, A *, A * 01, A * 01:01:01:01 e qualsiasi precedente delle denominazioni come A * 01010101).</li>
		<li>Trovare il nome di allele corrispondente sullo schermo. Fare clic sul pulsante allele.</li>
		<li>Copia il &#34; sequenza della proteina &#34; e incollarlo in un documento di testo sotto una riga di intestazione di &#34; &#62; nome di allele &#34;. Efficacemente, il documento è in formato FASTA (FAST-All) del nome di allele e sequenza.</li>
	</ol></li> <li>Eseguire geniche multiple allineamenti degli alleli del donatore e del destinatario/paziente.
	<ol><li>Uno gene (cioè, DQB1 * 03:01:01:01) alla volta, copiare e incollare tutti i quattro alleli delle sequenze FASTA donatore e paziente (due dal donatore) e due dal paziente in un documento di testo combinato. A questo punto, è importante denotare differenzialmente nomi allele donatore da nomi paziente allele (opzioni includono l'uso differenziale di superiore vs minuscole; o creare un'estensione di prefisso o suffisso distintiva per ogni nome di allele per contrassegnare separatamente donatore vs. pazienti alleli). L'ordine di ingresso delle sequenze non è importante, perché seguendo l'ordine sarà mescolata secondo i livelli di somiglianza tra qualsiasi coppia di sequenze di allineamento.</li>
		<li>Copia e incolla le sequenze in FASTA formattare (come visto nella Figura 3) dall'alto nella &#8220; immettere le sequenze di input &#8221; casella sito Web Cluster Omega: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.</li>
		<li>Fare clic su &#34; inviare il lavoro alla &#34; utilizzando le impostazioni standard dei parametri: come &#34; PROTEINŔ e &#34; Clustal w / numeri &#34;. Eseguire l'allineamento cliccando su &#34; invia &#34;. Un allineamento delle sequenze di quattro viene visualizzato sullo schermo ( Figura 4).</li>
	</ol></li> <li>Mark donatore-specific disadattamento. 
	Nota: Si dovrebbe essere appositamente notato che le sequenze alleliche date qui erano basate sui risultati della tipizzazione HLA, non sequenziali. Di conseguenza, c'è un rischio che può essere mancata variazione di sequenza rilevante nella coppia donatore-destinatario particolare. Questo potenziale problema sarà mitigato come più e più centri trapianto adottano precise digitando ad alta risoluzione e DNA sequenziamento diretto.
	<ol><li>Copia e incolla il testo di allineamento in un documento di testo e creare un nuovo documento. Se il formato del file allineato è disturbato, correggere il formato modificando stile e dimensione: utilizzare sempre &#34; Courier New &#34; carattere in tipo di piccole dimensioni per adattare le righe. Salva il documento dopo i problemi di formattazione sono risolti.</li>
		<li>Controllare manualmente le sequenze allineate per identificare tutti i residui non corrispondenti che appartengono unicamente al donatore. Contrassegnare ciascuna di questi residui di donatore-specific utilizzando un colore di carattere distintivo.</li>
		<li>Sottolineare tutte le lettere nel donatore &#39; s sequenze che estendere 14 residui entrambi up - e a valle del disadattamento di donatore-specific contrassegnato (calcolato come 15 dell'amminoacido del peptide meno 1 residuo della mancata corrispondenza).</li>
	</ol></li> <li>Derivare sequenze peptidiche 15-mer una serie sovrapposte. 
	Nota: La ragione per la scelta di peptidi 15-mer era basata sulla conoscenza generale degli epitopi tipici essendo 4-9 amminoacidi di lunghezza. Di conseguenza, quando abbiamo applicato un &#34; finestra mobile &#34; procedura con un passo di 4 aminoacidi ( Figura 1), la nostra selezione di una lunghezza di 15 aminoacidi lasciato un 15-4 = 11 aminoacido sovrapposizione tra qualsiasi peptidi vicini in una serie. In teoria, questa sovrapposizione di 11 dell'amminoacido è sufficiente a coprire tutti gli epitopi immuni di fino a 9 amminoacidi di lunghezza, affinché nessun epitopo sia inavvertitamente &#34; dividere &#34; a metà con solo sequenze parziali sulla matrice.
	<ol><li>Utilizzare le sequenze sottolineate come modelli per derivare in sequenza breve 15 sequenze di aminoacidi in una serie che si sovrappongono di 4 residui tra qualsiasi due sequenze immediatamente adiacenti della serie.</li>
		<li>Copia e incolla questi 15 sequenze dell'amminoacido in un foglio di calcolo ( Figura 5) in un formato di colonna accompagnati da colonne di notazione che includono i nomi corrispondenti degli alleli dei donatori. Un'ulteriore colonna per includere posizioni aa residuo può essere utile.</li>
	</ol></li> <li>Ripetere i passaggi da 1.1.3. 1.3. per ogni allele HLA (cioè, A, B, C, DQA1, DQB1, DRB1 e DP) del donatore e la coppia di destinatario per derivare le 15 sequenze aa breve del donatore.</li>
	<li>Copia e incollare tutte le colonne in un foglio di lavoro master per creare una colonna lunga e continua di tutte le sequenze aa 15 da tutti gli alleli del donatore. Annotare il numero totale di righe del documento (per le sequenze peptidiche).</li>
</ol> 2. Progettazione del Layout di matrice Custom e produzione chiamate <ol><li>genera un foglio di calcolo di sequenze peptidiche con allele corrispondente. La matrice ha 20 righe e 30 colonne e può contenere fino a 20 x 30 = 600 punti per i peptidi. A seconda del numero totale dei peptidi registrato nel passaggio 1.5 da un donatore particolare e basato la nostra esperienza passata con due esempi che avevamo provato a Liu et al. 17, 600 posto matrice può contenere tutte le sequenze generate da ~ 2 casi di trapianto separati.
	<ol><li>Piano razionale e di piùfficace modo per montare i set dei peptidi all'interno del formato 600-punto della matrice.</li>
		<li>Se più di un soggetto può andare bene in una matrice di intera, inserire righe vuote dopo il primo donatore &#39; sequenze di s in base al numero totale di righe che può essere diviso per 30 (il numero di punti in una riga sulla matrice).</li>
		<li>Subito dopo l'ultima riga vuota per il primo set di sequenze, incollare l'intera colonna di contenuto della sequenza dal secondo caso di trapianto.</li>
		<li>Ripetere questi passaggi fino a quando la matrice viene riempita e non più casi possono essere aggiunti senza superare i 600 punti. Se intere righe vuote vengono lasciate per riempire nella parte inferiore, &#34; spostare &#34; la riga vuota per essere posizionato tra i set di due donatori. Questo ampio spazio lasciato tra i casi rende il taglio della membrana dopo il completamento della sintesi più facile - seguendo passo 3.2. qui di seguito.</li>
	</ol></li> <li>Programmare le sequenze peptidiche nel contesto del layout di matrice. Il programma del sintetizzatore SPOT richiede un formato di testo delle sequenze (sequenza di un peptide di una riga), che può essere ottenuto direttamente tramite il salvataggio del foglio di calcolo risultante dal passo 2.1.4 come un documento di testo semplice (senza le colonne supplementari per i nomi di allele, aa posizioni ecc.).</li>
	<li>Esecuzione automatizzata del peptide matrice sintesi via il sintetizzatore SPOT. L'intera operazione di sintesi è dettagliata in Marica et al. 21. Si noti che Fmoc sintesi di due matrici richiede ~ 4-5 giorni.</li>
</ol> 3. Sonda e antisieri Reprobe da una serie temporale di un individuo destinatario del trapianto.
 Nota: la matrice della membrana 600-spot ha le dimensioni ~ 7 cm x 13 cm. Dopo la sintesi, le matrici possono essere conservate a temperatura come membrane asciutte per almeno due anni, quando al riparo da luce diretta. Evitare di piegare eccessivo della membrana per preservare la longevità per uso ripetuto.
<ol><li>Reidratare la matrice di membrana con etanolo e Visualizza imperfezioni del peptide macchiati con Ponceau S.
	Matrice <ol><li>reidratare la membrana che trasportano i peptidi seguendo una procedura graduale ottimizzata in Li et al. 24. <ol><li>immergere la membrana di matrice in 20 mL di etanolo al 100%.</li>
			<li>Aggiungere 20 mL di acqua distillata acqua per diluire la soluzione di etanolo al 50% e incubare a temperatura ambiente per 15 min.</li>
			<li>Modificare la soluzione di immersione in 40 mL di acqua 100% tre volte e incubare per 15 minuti ogni volta.</li>
			<li>Lavare in un buffer di lavoro corretto, ad esempio, 20 mL di TBST (soluzione fisiologica tamponata con 0,1%), tre volte per 5 minuti ciascuno.</li>
		</ol></li> <li>Ponceau S colorazione della matrice per visualizzare i peptidi sintetici <ol><li>aggiungere 20 mL della soluzione di Ponceau S pre-formulato direttamente alla matrice idratata ed incubare per 30 ~ s con agitazione.</li>
			<li>Run distillata acqua continuamente sopra la membrana a-macchia Ponceau S colore di sfondo. Durante il processo, peptide macchie di colore rosso possono diventano visibili.</li>
			<li>Separare le porzioni della matrice per ciascun donatore tagliando con attenzione tra le sezioni della matrice per i singoli casi. Contrassegnare l'orientamento di ciascun array.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Matrice pre-block.
	<ol><li>Blocco la membrana in 20 mL di 5% senza grassi del latte dissolto nel buffer di TBST. Questa soluzione basata su latte ulteriormente de-macchierà Ponceau S colore. Sostituire il buffer di latte più volte al fine di ottenere immagini più chiare di peptide.</li>
		<li>Per scopi di record-keeping, scattare una foto dell'immagine Ponceau S della matrice utilizzando una macchina a mano (esempio in Figura 6).</li>
		<li>Continuare il blocco della membrana in 5% senza grassi del latte a 4 ° C durante la notte o a temperatura ambiente per 2 h con dondolo.</li>
	</ol></li> <li>Matrice incubare con trapianto antisiero. 
	Nota: Dovrebbe essere notato che un fenomeno noto come prozona o l'effetto del gancio può derivare da interferenze di complemento-dipendente nelle analisi degli anticorpi del siero. Per aggirare questo problema, può essere considerato un passo di pretrattamento del siero opzionale con EDTA o calore inattivazione dei campioni del siero.
	<ol><li>Rimuovere il tampone bloccante e lavare la membrana con 20 mL di TBST tre volte il giorno successivo per 5 minuti ogni volta.</li>
		<li>Aggiungere 20 µ l del siero grezzo del destinatario a 20 mL del 2,5% del latte nel buffer di TBST e incubare la membrana per 2-3 h a temperatura ambiente. Si noti che in questo giro iniziale del sondaggio, è consigliabile che l'ultimo post-trapianto siero (o probabilmente più sensibilizzato siero) nelle serie temporali in primo luogo viene utilizzato. Questo si basa sul presupposto che gli esemplari precedenti della serie, in particolare dai punti di tempo pre-trapianto, hanno meno varietà di alloanticorpi che tendono a sviluppare nel tempo. In questo modo, qualsiasi possibilità di interferenze di segnale da &#34; riporto &#34; tra turni di sondaggio può essere chiaramente distinto dalla reattività di alloanticorpo veramente sviluppato dovuto le risposte immunitarie contro l'innesto.</li>
	</ol></li> <li>Lavare la matrice utilizzando 20 mL di TBST e incubare con l'anticorpo secondario.
	<ol><li>Lavare la membrana tre volte per 10 minuti ogni volta.</li>
		<li>Incubazione con anticorpo secondario di capra anti-umano IgG-HRP (perossidasi di rafano) alla diluizione di 1: 10.000 nel buffer TBST completati con 1% di latte per un altro 2 h.</li>
	</ol></li> <li>Wash e sviluppare il blot.
	<ol><li>Lavare la membrana tre volte con TBST per 10 minuti ogni volta.</li>
		<li>Eseguire enhanced chemiluminescenza (ECL) uso 5 mL di soluzione di luminol fresco mescolato con 5 mL di soluzione di perossido per sviluppare la membrana (per 1 min).</li>
		<li>ECL visualizzare segnali utilizzando un imager adatto (cioè, ChemiDoc Imaging Systems o Azure C600).</li>
	</ol></li> <li>Analizzare e quantificare il blot.
	<ol><li>Salvare le immagini sviluppate ( Figura 7, immagine in basso) ed eseguire la quantificazione dell'intensità spot.</li>
	</ol></li></ol> 4. Confronta antisiero reattività in tutta una serie di tempo clinica.
<ol><li>Striscia matrice.
	<ol><li>a questo punto, tenere la membrana bagnato a tutte le ore.</li>
		<li>Striscia la membrana incubando con 20 mL di tampone commerciale stripping a 37 ° C per 20 min e poi lavare la membrana con TBST tre volte per 10 minuti ciascuno. Quindi ripetere il blocco (passo 4.2) e sondaggio (punto 4.3) utilizzando un diverso siero del paziente preso in un punto diverso tempo.</li>
	</ol></li> <li>Blocco spogliato membrana. 
	Nota: Dopo stripping, la membrana può essere riutilizzata per un altro giro di sondaggio di un siero diverso dallo stesso paziente in una serie temporale.
	<ol><li>Bloccare la membrana utilizzando 5% latte buffer come prima (Vedi punto 3.2).</li>
	</ol></li> <li>Reprobe un antisiero diverso dalla stessa serie di tempo (ripetere i passaggi da 3,3-3,6; esempio indicato in Figura 7, immagine in alto). 
	Nota: La matrice spogliata quindi può essere utilizzata per reprobe un altro campione di siero. Poiché i peptidi sono coniugati covalentemente alla matrice di supporto della membrana, abbiamo mostrato che la matrice può essere riutilizzata per fino a 20 giri di stripping e reprobing cicli senza perdere la sua performance.</li>
	<li>Stoccaggio a lungo termine di matrici.
	<ol><li>Store la membrana in tampone TBS completati con 0,02% w/w sodio azide come conservante. Utilizzare un sacchetto di plastica per l'archiviazione a lungo termine. A 4 ° C sotto protezione dalla luce diretta, la membrana bagnata può essere conservata per almeno 2 anni.</li>
	</ol></li></ol> 5. Acquisizione dati e analisi <ol><li>Annotare manualmente i peptidi dell'antigene positivo.
	<ol><li>Individuare macchie mostrando segnali di anticorpo positivo e determinare ciascuna delle loro posizioni in griglia.</li>
		<li>Evidenziare le righe corrispondenti nel foglio di lavoro master per i peptidi positivi.</li>
	</ol></li> <li>Recuperare sequenze peptidiche elencati nel foglio di lavoro master ( Figura 7, elenco inferiore). Secondo il principio di progettazione descritto al punto 1.4.1., vicine macchie seriale condividono sequenze significativamente sovrapposti (15-4 = 11), pertanto gli epitopi reattivi possono essere condivise dai peptidi in una serie consecutiva.
	<ol><li>Evidenziare eventuali punti positivi che si verificano in successione.</li>
	</ol></li> <li>Determinare epitopo minima lunghezza per ogni peptide in una serie.
	<ol><li>Evidenziare eventuali sequenze di epitopo potenzialmente condivisa basate sulla sovrapposizione di segmenti di peptidi reattive.</li>
	</ol></li> <li>Modello strutturalmente antigene epitopi.
	<ol><li>Ottenere strutture cristalline di prototipo HLA da Protein Data Bank trovato al seguente link web: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do.</li>
		<li>Visualizzare il prototipo struttura HLA in Pymol (download da www.pymol.org).</li>
		<li>Mappa &#34; o modello scoperto gli epitopi anti-donatori per le strutture 3D delle molecole HLA prototipo mettendo in evidenza le sequenze peptidiche reattiva ( Figura 8). Fare clic su &#34; Display &#34;, poi &#34; sfondo &#34; e selezionare &#34; bianco &#34;. Per salvare l'immagine, vai a &#34; File &#34; e &#34; Salva immagine con nome &#34; e selezionare il formato di file &#34; png &#34;.</li>
	</ol></li> <li>Riportare risultati e assegnare gli epitopi reattivi per gli alleli corrispondenti.</li>
	<li>Confronto matrice risultati ai risultati della singolo-antigene Perline (SAB), se disponibile. 
	Nota: Il test SAB utilizzando antigeni allelico singoli misura la reattività dell'anticorpo verso un pannello fisso delle proteine HLA. Singoli peptidi che mostrano reattività dell'anticorpo appartengono a determinati alleli HLA che, se anche incluso nel pannello SAB, consentono un confronto diretto tra la matrice e i risultati SAB. Il nostro studio precedente 17 ha mostrato un alto livello di correlazione tra i risultati, suggerendo che gli epitopi peptidici contribuiscano in modo significativo la reattività complessiva del Sab. Inoltre, i risultati di matrice anche rivelano i livelli dell'aminoacido di specificità.
	<ol><li>Ottenere SAB risultati da un laboratorio HLA che fornisce informazioni su se e quali alleli del donatore sono reattivi a post-trapianto sieri del paziente. Risultati dal passaggio 5.5. Basato su una matrice analisi forniscono anche informazioni su corrispondenti alleli donatore positivi a reattività alloanticorpo.</li>
		<li>Risultati confrontare SAB e array.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il design della matrice SPOT descritto qui è per lo studio sperimentale della specificità alloanticorpo nel trapianto contro gli antigeni HLA del donatore di organi. In contrasto con il dosaggio SAB esistente ampiamente utilizzato in clinica, il metodo di matrice di antigene ha un grande vantaggio nel suo design flessibile che può ospitare le vere sequenze HLA del donatore individuale. La nuova piattaforma sfrutta le potenzialità della tecnologia di sequenziamento del DNA rapido avanzamento che sarà presto in grado di pr...

Terapia del rimontaggio dell'organo che ordinariamente viene condotta in tutto il mondo ha salvato milioni di vite. Trapianto di organo solido si verifica in circa 100 pazienti per milione di persone negli Stati Uniti ogni anno, mentre un numero maggiore sono ancora su liste d'attesa per ricevere i donatori di organi a causa di una grave carenza di approvvigionamento (secondo le informazioni fornite dall'organo Appalti e rete di trapianto - OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). Trapianto d'organo è altamente regolamentato al fine di ridurre gli sprechi di organo e salvare vite umane, ma gli strumenti scientifici utilizzati per informare questi regolamenti sono limitati in efficacia. Per esempio, la comunità scientifica riconosce pienamente gli Stati altamente polimorfici di molecole HLA e accurati test genetici del DNA mediante battitura a macchina ad alta risoluzione e basato su sequenze digitando (SBT) sono state sviluppate in anni recenti1, 2. Tuttavia, i metodi di collaudo alloanticorpo non sono ancora stati in grado di produrre la vasta gamma di singole sequenze HLA come sonde di antigene. Il test standard al giorno d'oggi utilizza un pannello invariabile di ~ 100 antigeni allelico che sono costituiti da comuni varianti di HLA, A, B, C, DQ, DP e DR sequenze in popolazioni umane3,4,5,6. Frequentemente, sequenze di HLA del donatore effettivo non sono inclusi nel pannello test, costringendo trapianto di medici e chirurghi di dedurre la reattività di donatore-specific sulla base di somiglianze condivise tra donatore effettive sequenze e corrispondenti "standard" nella test kit7,8. Di conseguenza, a volte è difficile fare una stima affidabile del rischio di rifiuto basato su anticorpo prova Risultati9,10,11,12. Di conseguenza, nuove personalmente test personalizzabili per gli alloanticorpi sono urgentemente necessari13,14.
I geni HLA codificano per i recettori (MHC) del complessi maggiore di istocompatibilità hanno una funzione chiave nella risposta immunitaria6. Geni HLA sono conosciuti per essere i più polimorfici geni del genoma umano6. A causa della rapidi progressi nel DNA sequencing strategie per i geni HLA, nuove varianti alleliche (o semplicemente indicati come alleli) vengono scoperti in un esplosivo tasso15,16. Entro il marzo 2017, 16.755 convalidati alleli erano stati depositati al Database IMGT/HLA (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), di cui 12.351 erano di classe I e 4.404 erano dei gruppi II classe. In netto contrasto, solo poco più di 100 alleli distinti sono rappresentati nel test standard single-antigene Perline (SAB), che è usato ordinariamente per rilevare gli alloanticorpi nel trapianto dell'organo. Il metodo di RFA è costruito su una piattaforma Luminex mediante citometria a flusso. Poiché il test utilizza un set di invariabile di antigeni, a parte minore variabilità di lotti in produzione, la prova di antisiero può essere standardizzata robustamente tra individui e tra laboratori5. Tuttavia, questo test è in grado di catturare tutti gli alloanticorpi sviluppati specificamente contro gli alleli dei donatori, in particolare quando le sequenze del donatore sono assenti dal SAB set. Anche se la produzione personalizzata di antigeni dei donatori basato su sequenze veri sono desiderabili, restano sfide tecniche in procedure di collaudo e di razionalizzare la produzione necessaria.
Recentemente abbiamo descritto una metodologia alternativa in uno studio di fattibilità del trapianto renale soggetti17. Il metodo utilizzato gli antigeni peptidici in un formato di matrice per il sondaggio pre- e post-trapianto sieri di soggetti individuali. Ogni matrice è stato personalizzato costruito utilizzando il punto sintesi metodo18,19,20,21,22,23 che produce antigeni peptidici, ogni 15 amminoacidi di lunghezza, interamente basato su alleli HLA del donatore dell'organo rispettivo di A, B, C, DQA1, DQB1 e DRB1. Sintesi SPOT sono operato su una membrana di cellulosa con standard Fmoc-chimica22 e possono produrre centinaia di peptidi personalizzati in parallelo con un sistema completamente automatizzato robot19,21. La matrice di membrana possa sopportare vari cicli di spogliatura e reprobing cicli. Nel nostro studio retrospettivo17, abbiamo rilevato i cambiamenti nei modelli di antigene con antisieri stored trapianto raccolti in una serie di tempo (cioè, prima e dopo il trapianto). Qui descriviamo il protocollo tecnico per il flusso di lavoro tra cui progettazione, produzione, analisi di sondare e risultato di antisiero. Il metodo è destinato per il rilevamento di alloanticorpi contro epitopi specifici lineari su molecole HLA dei donatori del trapianto.

<table><tbody><tr><td>Array di peptidi</td><td>INTAVIS Bioanalytical Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione Ponceau S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td></td></tr><tr><td>Latte scremato</td><td>Bio Rad Laboratories</td><td>1706404</td><td></td></tr><tr><td>TBST</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>10711454001</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-umane di capra; HRP&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A18811</td><td></td></tr><tr><td>Substrato ECL occidentale Clarity</td> Bio <td>Rad Laboratories</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>Ripristina il tampone di stripping Western Blot</td><td>Thermo Scientifics</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di imaging su gel ChemiDoc</td><td>Bio Rad Laboratories</td><td>1708265&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

personalizzato peptide matrici per il rilevamento di anticorpi hla nei trapianti d'organo

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

Nei trapianti d'organo, la funzione e la longevità dell'innesto criticamente si basano sul successo del controllo della reattività di rigetto immunologico contro gli antigeni umani del leucocita (HLA). Istocompatibilità linee guida sono basate su prove di laboratorio di immunità anti-HLA, che presenta sia come pre-esistente o de novo generato anticorpi HLA che costituiscono una barriera importante trapianto. Prove correnti sono costruiti su una piattaforma di singolo-antigene Perline (SAB) utilizzando un insieme fisso di ~ 100 antigeni ricombinanti preselezionati per sondare sieri di trapianto. Tuttavia, negli esseri umani esiste una maggiore varietà di tipi di HLA, con nessun due individui diversi da gemelli identici che possono condividere la stessa combinazione di sequenze di HLA. Mentre avanzate tecnologie per la tipizzazione HLA e sequenziamento diretto precisamente è in grado di catturare qualsiasi mancata corrispondenza nella sequenza di DNA tra un donatore e HLA del destinatario, il dosaggio di SAB, a causa della sua limitata varietà nella rappresentazione di sequenza, è in grado di rilevare con precisione gli alloanticorpi specificamente contro il donatore HLA mismatches. Abbiamo cercato di sviluppare un metodo complementare, utilizzando una tecnologia diversa per rilevare e caratterizzare gli anticorpi HLA anti-donatori su base personalizzata. Lo strumento di screening è una matrice su ordinazione del peptide donatore HLA-derivato di sequenze di per sondaggio post-trapianto sieri del destinatario dell'organo per valutare il rischio di rigetto anticorpo-mediato. Su un singolo array per una coppia donatore-ricevente, fino a 600 unici peptidi sono realizzati sulla base sequenze di proteine HLA del donatore, ogni peptide portando almeno un residuo non corrispondente in una sequenza 15-amino acida. Nei nostri esperimenti pilota per confrontare modelli di antigene per sieri pre- e post-trapianto su queste matrici, siamo stati in grado di rilevare i segnali anti-HLA con la risoluzione che ci ha permesso di individuare gli epitopi immuni coinvolti. Questi personalizzato antigene array permettono il rilevamento ad alta risoluzione degli epitopi HLA del donatore-specific nel trapianto dell'organo.

Nello studio originale utilizzando la matrice di proiezione metodo17, abbiamo iscritto un totale di 5 soggetti di trapianto di rene. Abbiamo ottenuto i risultati del nostro gruppo e dei loro rispettivi donatori di tipizzazione di HLA. Loro storia medica e allelica anticorpali da SAB prove erano anche disponibili a noi. Nel nostro studio pilota di questi 5 pazienti, abbiamo messo a punto due diverse metodologie: una matrice standard composta da un pannello fisso di ...

Mancate corrispondenze nelle sequenze (HLA) l'antigene umano del leucocita tra donatore di organi e destinatario coppie sono la principale causa di rigetto anticorpo-mediato nel trapianto dell'organo. Qui presentiamo l'uso di matrici di antigene personalizzati che si basano su sequenze di singoli donatori HLA per sondare gli alloanticorpi di anti-donatori HLA nei destinatari dell'organo.

Personalizzato Peptide matrici per il rilevamento di anticorpi HLA nei trapianti d'organo

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

L'obiettivo generale di questo metodo personalizzato con array per il rilevamento di alloanticorpi è delineare gli epitopi dell'antigene leucocitario umano o HLA nel trapianto d'organo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del trapianto d'organo riguardo agli epitopi immunitari specifici coinvolti nel rigetto del trapianto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è completamente personalizzabile, consentendo l'inclusione di set di antigeni personalizzati che possono riflettere le sequenze HLA di singoli donatori d'organo.La tecnica ha il potenziale di rilevare epitopi HLA specifici per aloanticorpi. Per recuperare le sequenze dal database del progetto International Immunogenetics Project sulle cellule leucocitarie umane, nella pagina delle combinazioni di alleli ambigue, aprire il modulo di ricerca degli alleli e inserire il nome del primo allele del soggetto nel campo di ricerca. Cliccare su Cerca Alleli Ora e individuare il nome dell'allele corrispondente visualizzato sullo schermo.Fare clic su Allele e copiare e incollare la sequenza proteica in un documento di testo sotto una riga di intestazione con il nome dell'allele, in modo da organizzare il nome dell'allele insieme alla sequenza in formato FASTA. Una volta identificate tutte le sequenze, copiare e incollare le sequenze dal formato FASTA nella casella "enter your input sequences" sul sito web di Cluster Omega e fare clic su "submit your job" utilizzando le impostazioni standard dei parametri. Quindi fare clic su submit.Verrà visualizzato un allineamento delle sequenze. Per evidenziare le differenze specifiche del donatore, copiare e incollare il testo dell'allineamento in un nuovo documento di testo e utilizzare un colore di carattere distintivo per marcare ogni residuo specifico del donatore non corrispondente all'interno delle sequenze allineate che appartiene esclusivamente al donatore. Sottolineare tutte le lettere nelle sequenze del donatore che si estendono di 14 residui a monte e a valle delle differenze specifiche del donatore evidenziate e utilizzare le sequenze sottolineate come modelli per derivare in modo sequenziale brevi sequenze di 15 amminoacidi in una serie che si sovrappongono di quattro residui tra due sequenze adiacenti qualsiasi nella serie.Copiare e incollare queste 15 sequenze di aminoacidi in un foglio di calcolo in formato colonna, accompagnate da colonne di annotazione che includono i nomi corrispondenti degli alleli donatori. Per progettare un layout personalizzato di array, generare un foglio di calcolo contenente le sequenze di peptidi con le relative attribuzioni alleliche, composto da 20 righe e 30 colonne. Successivamente, inserire le sequenze in ciascuna delle celle dell'array e utilizzare il sintetizzatore automatico per eseguire la sintesi automatizzata dell'array peptidico.Quando si progetta un array, è fondamentale utilizzare le sequenze HLA di donatori individuali come modello per ricavare il set di antigeni. Dopo che gli array sono stati sintetizzati, bloccare le membrane con 20 millilitri di latte scremato al 5% disciolto in soluzione salina tamponata al Tris con 0,1% di tween 20 o TBST per il periodo di incubazione appropriato sotto agitazione. Successivamente, lavare la membrana tre volte con 20 millilitri di TBST fresco per cinque minuti per ogni lavaggio, seguito da incubazione con 20 microlitri di siero grezzo del ricevente in TBST con latte al 2,5% per due o tre ore a temperatura ambiente.Al termine dell'incubazione, lavare la membrana tre volte per 10 minuti per ogni lavaggio e incubare le membrane con l'anticorpo secondario IgG di capra anti-uomo coniugato con perossidasi di rafano (HRP) per due ore. Rimuovere l'anticorpo secondario non legato con tre lavaggi di 10 minuti ciascuno in TBST e sviluppare le membrane in cinque millilitri di soluzione di luminolo appena preparata più cinque millilitri di soluzione di perossido. Dopo un minuto, visualizzare i segnali di chemiluminescenza amplificata su un dispositivo di imaging adeguato.Dopo aver salvato le immagini sviluppate, incubare le membrane con 20 millilitri di tampone di stripping commerciale a 37 gradi Celsius per 20 minuti, seguito da tre lavaggi di 10 minuti ciascuno in TBST. Successivamente, bloccare, ri-probabilizzare e visualizzare le membrane come appena dimostrato, utilizzando un campione di siero dello stesso paziente ottenuto in un diverso punto temporale. Per annotare manualmente i peptidi antigenici positivi, individuare i punti con segnali positivi di anticorpo nei file delle immagini sviluppate salvati e determinare la posizione sulla griglia di ciascuno di essi.Recuperare quindi le sequenze peptidiche dal foglio di lavoro principale per identificare eventuali sequenze di epitopi condivisi in base ai segmenti sovrapposti dei peptidi reattivi. Per modellare strutturalmente gli epitopi dell'antigene, ottenere le strutture cristalline prototipiche dell'HLA dal protein data bank e visualizzare la struttura prototipica dell'HLA in Pymol. Evidenziare le sequenze peptidiche reattive per mappare gli epitopi anti-donatore scoperti sulle strutture tridimensionali dell'HLA prototipico.Quindi fare clic su Display e Background e selezionare Bianco, salvando i dati come file PNG. Dopo il sequenziamento di allineamenti multipli degli alleli di questo paziente donatore rappresentativo come appena dimostrato, è stato ottenuto un file di allineamento per ciascuno degli alleli. Le sequenze modello del donatore sufficientemente lunghe da coprire tutti i residui non corrispondenti sono state quindi identificate e sottolineate, e sono state derivate tre serie di peptidi da 15 amminoacidi per il primo allele.Dopo aver analizzato tutti gli alleli del donatore, un totale di 202 peptidi è stato caricato su un array per il rilevamento specifico del siero post-trapianto del donatore. Il confronto dei risultati con quelli ottenuti da un successivo rilevamento del siero pre-trapianto del donatore ha rivelato i segnali anticorpali associati al campione post-trapianto, nei quali diversi residui specifici del donatore, non corrispondenti al ricevente, sembravano coinvolti nell'indurre la reattività anticorpale. Quando gli epitopi reattivi agli anticorpi su HLA-DQA1 e DQB1 sono stati modellati su una struttura eterodimerica co-cristallizzata, un segmento prominente della struttura noto come filamento beta uno è stato identificato come un'area critica con una probabilità molto maggiore di essere bersaglio di alloanticorpi tra i soggetti trapiantati in un coorte rappresentativo di cinque casi.Una volta padroneggiata, la tecnica può essere completata in sette-otto ore se eseguita correttamente. Dopo il suo sviluppo, la tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del rigetto del trapianto per esplorare il rilevamento personalizzato di alloanticorpi specifici del donatore.

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Un nuovo metodo DC indipendente per l'induzione e l'espansione di antigene-specifica delle cellule T è descritta. HLA-A2 Ig Cellule artificiali basati Antigen Presenting (aAPC) vengono caricati con HLA-A2 peptidi limitato ad ampliare in modo efficace CTL di specificità antigenica diversi. Questa tecnologia ha un grande potenziale per CTL-immunoterapia adottiva.

HLA-Ig celle in base Antigen Presenting artificiale per Efficiente Ex vivo Estensione dei diritti dell&#39;uomo e CTL

Questo video mostra un test per rilevare gli alloanticorpi HLA anti-donatore nei riceventi di organi. Un array di peptidi viene sintetizzato per rappresentare potenziali epitopi per il rigetto d'organo mediato da anticorpi. L'array viene incubato con il siero del ricevente, contenente alloanticorpi che si legano ai loro epitopi bersaglio. Il legame degli anticorpi viene rilevato utilizzando la chemiluminescenza per identificare gli epitopi HLA specifici del donatore che stimolano la reattività...

Un rilevamento basato su array di peptidi di alloanticorpi HLA anti-donatore nei riceventi di organi

Questo video mostra una tecnica che applica la tecnologia dei microarray di peptidi per profilare la specificità degli anticorpi che riconoscono le modifiche post-traduzionali (PTM) sui peptidi istonici. Un vetrino di microarray contenente peptidi istonici immobilizzati coniugati con fluorofori con combinazioni note di PTM viene trattato con anticorpi specifici per PTM target. Questo processo aiuta a identificare la specificità dell'anticorpo per il bersaglio e la sua potenziale reattività...

Una tecnologia di microarray peptidici per la profilazione della specificità degli anticorpi

Saggi biochimici con molecole ricombinanti umani MHC II grado di fornire rapide, approfondimenti quantitativi nella identificazione degli epitopi immunogenico, la cancellazione o il design. Qui, un saggio di legame peptide-MHC II scalata a 384 pozzetti è descritto. Questo formato conveniente, deve risultare utile nel campo della proteina deimmunization e progettazione di vaccini e sviluppo.

Un saggio di legame High Throughput MHC II per l&#39;analisi quantitativa dei peptidi epitopi

Intatte classe I complessi HLA / peptide sono capannone dalle cellule tumorali, che rappresenta un potenziale biomarcatore cancro rilevante. Utilizzando la tecnologia dei sensori senza etichetta e il recettore delle cellule T mimando anticorpi monoclonali, rilevamento di capannone MIF / HLA-A * 02: 01 complessi in sovranatanti cellulari MDA-MB-231, spillo siero umano, e plasma del paziente è dimostrata, consentendo lo sviluppo di un romanzo cancro piattaforma diagnostica.

Rilevamento dei leucociti umani Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizzando libero-Label Biosensor Tecnologia

Questo articolo descrive un metodo per la generazione e la propagazione di cloni di cellule T umane che rispondono specificamente a un alloantigene definito. Questo protocollo può essere adattato per la clonazione di cellule T umane specifiche per una varietà di ligandi peptidici-MHC.

Generazione di Human alloantigene-specifiche cellule T da sangue periferico

Descriviamo qui un metodo per generare microarray di antigeni personalizzabili che possono essere utilizzati per la rilevazione simultanea di autoanticorpi sierici IgG e IgM da esseri umani e topi. Questi array consentono il rilevamento quantitativo e ad alto rendimento di anticorpi contro qualsiasi antigene o epitopo di interesse.

Generazione di due colori Antigen microarray per la rilevazione simultanea di autoanticorpi IgG e IgM

Qui, gli autori presentano un protocollo semplice ed efficiente per definire un epitopo antigenico lineare utilizzando un anticorpo monoclonale purificato e la scansione dei peptidi attraverso l'ibridazione dot-blot. L'epitopo identificato può quindi essere utilizzato in applicazioni terapeutiche e diagnostiche.

Identificazione di un Epitopo Lineare B-cell monoclonale riconosciuto Peptide scansione-assistito

Questo manoscritto descrive i metodi per applicare la tecnologia del microarray peptide alla profilazione di specificità degli anticorpi che riconoscono gli istoni e le loro modificazioni post-traslazionali.

Analisi della specificità degli anticorpi istonici con microarray di peptide

Qui, presentiamo un protocollo per la purificazione di complessi peptidici MHC di classe I e classe II da linee cellulari di topi e umani che forniscono dati immunopeptidomici di alta qualità. Il protocollo si concentra sulla preparazione del campione utilizzando anticorpi disponibili in commercio.

Immunopeptidomics: Isolamento di peptidi associati A MHC di classe I e II di topi e umani per l'analisi della spettrometria di massa

Scopri il metodo di array antigenico personalizzato per rilevare alloanticorpi HLA anti-donatore nei trapianti d'organo. Questa tecnica utilizza set antigenici personalizzati basati sulle sequenze HLA individuali per migliorare la comprensione delle risposte immunitarie.

Personalizzato Peptide matrici per il rilevamento di anticorpi HLA nei trapianti d'organo

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