Ibridazione fluorescente In Situ ad alta risoluzione in embrioni della drosofila e tessuti mediante amplificazione del segnale Tyramide

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare i trascritti di RNA in atto all'interno di cellule e tessuti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare e dello sviluppo, come ad esempio dove si trova un RNA all'interno di una cellula, di un tessuto o di un embrione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che rileva le distribuzioni spaziali dell'RNA con alti livelli di risoluzione e sensibilità e a un costo contenuto rispetto ad altri metodi.

Inizialmente abbiamo sviluppato questo protocollo per studiare le distribuzioni subcellulari per il maggior numero possibile di RNA di Drosophila. Questo al fine di determinare l'estensione e la diversità delle distribuzioni subcellulari. Abbiamo iniziato il progetto lavorando con l'embrione, ma in seguito abbiamo adattato e ottimizzato il protocollo in modo da poter lavorare ad alta produttività con tessuti sezionati da larve e mosche.

L'aspetto più difficile della procedura è il numero di passaggi e il conseguente potenziale di errore, nonché la necessità di garantire l'assenza di RNA durante la produzione della sonda. Per facilitare la produttività e l'efficienza dei costi, le procedure illustrate in questo video utilizzano piastre per microtitolazione a 96 pozzetti per tutte le fasi. È anche facile adattare questo metodo a campioni più piccoli tagliando le piastre in strisce da otto o 12 pozzetti.

Inizia diluendo 10 microlitri di una coltura batterica notturna in 90 microlitri di acqua distillata doppia autoclavata in ciascun pozzetto di una nuova piastra PCR a 96 pozzetti. Denaturare il DNA a 95 gradi Celsius in un termociclatore per cinque minuti. Posizionare immediatamente il piatto sul ghiaccio per almeno cinque minuti.

Impostare le reazioni PCR in una nuova piastra PCR a 96 pozzetti. Utilizzare i primer universali appropriati e aliquotare 48 microlitri della miscela master PCR in ciascun pozzetto. Aggiungere due microlitri di ciascun modello di DNA plasmidico denaturato per pozzetto.

Eseguire l'amplificazione in una macchina per PCR a 96 pozzetti. Al termine dell'amplificazione, precipitare il prodotto PCR con una miscela di etanolo e acetato di sodio. Conservare i campioni per 30 minuti a meno 80 gradi Celsius.

Centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 2.250 volte g a quattro gradi Celsius per 45-60 minuti. Utilizzando una pipetta a collettore a vuoto a otto canali che ha una struttura che impedisce agli ugelli di andare sul fondo dei pozzetti aspirando i pellet, rimuovere con cura il surnatante. Lavare una volta con 160 microlitri di etanolo freddo al 70%.

Centrifugare a 2, 250 volte g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Capovolgere delicatamente la piastra a 96 pozzetti su un tovagliolo di carta per rimuovere le ultime gocce di liquido in ogni pozzetto e asciugare all'aria i pellet di DNA a temperatura ambiente per un'ora. Risospendere il DNA precipitato in 25 microlitri di acqua priva di RNasi.

Verificare le dimensioni e la resa dei prodotti PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio. Impostare le reazioni di trascrizione in vitro aggiungendo i componenti appropriati a ciascun pozzetto in una nuova piastra PCR a 96 pozzetti. Aggiungere 7,5 microlitri di modello di DNA a ciascun pozzetto corrispondente.

Coprire la piastra con del nastro sigillante. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 3-1/2 o quattro ore. Successivamente, aggiungere a ciascun pozzetto una miscela master composta da acqua distillata doppia trattata con DEPC, etanolo al 100% e acetato di sodio a tre molari.

Conservare a meno 80 gradi Celsius per 30 minuti. Centrifugare la piastra e lavare i pozzetti come mostrato in precedenza. Risospendere la sonda precipitata in 25 microlitri di acqua bidistillata trattata con DEPC.

Le sonde di RNA antisenso di nuova sintesi sono state eseguite su un gel di agarosio all'1% per verificarne l'integrità e la resa. In base all'intensità della banda, la resa può essere caratterizzata come resa bassa, resa tipica o resa alta. Dopo aver utilizzato cinque microlitri di ciascuna sonda per l'elettroforesi su gel di agarosio, mescolare i restanti 20 microlitri con 100 microlitri di soluzione di ibridazione e conservare a meno 80 gradi Celsius fino al momento del bisogno.

Per iniziare questa procedura, mettere da 20 a 30 larve in una capsula di Petri contenente PBS freddo in soluzione fix one e raffreddare su ghiaccio per due minuti per ridurre la motilità larvale. Sezionare le larve sotto il cannocchiale da dissezione. Usa un paio di pinze affilate per aprire con cura la parte anteriore e stringere i tessuti da parte posteriore a anteriore.

Dopo un massimo di 15 minuti, trasferire i tessuti sezionati in una provetta da 1,5 millilitri per il fissaggio e posizionarli su ghiaccio. Rimuovere il PBS e aggiungere 800 microlitri di soluzione fix one. Incubare su un miscelatore da banco per 30 minuti insieme ad altri tessuti precedentemente raccolti in sistemi di fissaggio.

Sciacquare i fazzoletti una volta con 800 microlitri di PBTT e mantenere il tubo sul ghiaccio mentre gli altri fazzoletti vengono raccolti e fissati. Raggruppare tutti i tessuti sezionati in un unico tubo di plastica da 15 millilitri contenente una rete nel coperchio del tubo. Aspirare il liquido in eccesso attraverso la rete del coperchio.

Lavare con 10 millilitri di PBTT e risciacquare con 10 millilitri di PBS. Per estinguere l'attività endogena della perossidasi del rafano, aggiungere cinque millilitri di perossido di idrogeno allo 0,3% in PBS e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Lavare due volte con 10 millilitri di PBTT.

Permeabilizzare i tessuti aggiungendo 10 millilitri di acetone pre-raffreddato all'80% e incubando a meno 20 gradi Celsius per 10 minuti. Lavare due volte con 10 millilitri di PBTT per reidratare i tessuti. Dopo aver lavato i fazzoletti come descritto nel protocollo di testo, conservare in soluzione di ibridazione a meno 20 gradi Celsius.

Se non viene utilizzato entro il giorno successivo, il gruppo filtro deve essere sostituito con un tappo normale. Aliquotare circa 20 microlitri per pozzetto di tessuti in una piastra PCR a 96 pozzetti su ghiaccio. Utilizzando una pipetta a otto canali, rimuovere la soluzione di ibridazione dai tessuti.

Aggiungere 100 microlitri di soluzione di ibridazione appena denaturata in ogni pozzetto e coprire con nastro sigillante. Pre-ibridare i tessuti a 56 gradi Celsius utilizzando un'unità di riscaldamento a bagno secco contenente perle di metallo per un minimo di 2-1/2 a tre ore. Denaturare 100 microlitri della sonda preparata in una piastra PCR a 96 pozzetti a 80 gradi Celsius per cinque minuti.

Raffreddare immediatamente con ghiaccio per cinque minuti. Rimuovere la soluzione di pre-ibridazione dai tessuti e aggiungere sonde specifiche per il gene denaturate a ciascun campione. Coprire con nastro sigillante in alluminio e ibridare a 56 gradi Celsius sotto perline di metallo in un'unità di riscaldamento a bagno asciutto per 16-18 ore durante la notte.

Prima di iniziare la procedura di rilevamento della sonda, preriscaldare tutte le soluzioni necessarie nell'unità di riscaldamento a 56 gradi Celsius. Trasferire con cura i tessuti ibridati in una piastra a 96 pozzetti che si adatta a un collettore per vuoto a piastre multipozzetti. I pozzetti di queste piastre hanno il fondo della membrana che consente la rimozione del contenuto sotto vuoto.

Rimuovere le sonde dalla piastra a 96 pozzetti e lavare i campioni con miscele di soluzione di ibridazione e PBTT secondo i passaggi indicati in questa tabella nell'unità di riscaldamento a 56 gradi Celsius. Dopo il terzo lavaggio con PBTT, rimuovere la piastra a 96 pozzetti dall'unità di riscaldamento, rimuovere la soluzione di PBTT e bloccare i tessuti con PBTTB su un miscelatore da banco a temperatura ambiente per 20 minuti. Aggiungere 100 microlitri di soluzione anticorpale per pozzetto e incubare per due ore sul miscelatore di campioni da banco.

Dopo aver risciacquato con PBTTB come descritto nel protocollo di testo, aggiungere 100 microlitri di soluzione di perossidasi di rafano streptavidina per pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 1-1/2 ore. Lavare due volte con PBTTB per cinque minuti per lavaggio. Successivamente, incubare i tessuti con la soluzione DAPI come descritto nel protocollo di testo.

Iniziare questa procedura incubando i campioni con la soluzione di tiramide e incubare i campioni per due ore sul miscelatore da banco al buio. Rimuovere la soluzione di tiramide dai tessuti una volta terminata l'incubazione. Dopo il lavaggio con PBT e PBS come descritto nel protocollo di testo, aggiungere 150 microlitri di terreno di montaggio antisbiadimento per pozzetto.

Conservare i campioni a quattro gradi Celsius durante la notte per consentire ai tessuti di affondare sul fondo del pozzetto o del tubo. Il giorno seguente, montare i campioni su un vetrino da microscopio e sigillarli con un vetrino coprioggetti. Infine, visualizza i campioni utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Vengono mostrati esempi di risultati ottenuti utilizzando questa procedura per embrioni precoci di Drosophila ed embrioni tardivi di Drosophila con segnali nell'amnioserosa, nei muscoli e nel sistema nervoso centrale. Il nome del gene con cui la sonda è stata ibridata è visualizzato in ogni pannello. Seguono esempi di tessuti larvali di terzo stadio, tubuli malpighiani, intestino medio, ghiandola salivare e muscolo.

Infine, vengono mostrate immagini rappresentative dell'ovaio adulto e dei testicoli adulti. Una volta padroneggiata e se eseguita in modo efficiente, questa tecnica può essere eseguita in soli due giorni. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di lavorare su un banco privo di RNasi con punte, tubi, piastre e soluzioni prive di RNasi e di utilizzare i guanti.

Se stai lavorando con un gran numero di campioni o sonde, non affrettare la procedura. Ed è anche una buona idea inventare trucchi per non dimenticare dove ci si trova. Quando segui questa procedura, puoi anche combinarla con altri metodi come il rilevamento di più sonde, sonde con proteine o marcatori cellulari.

Con questi è possibile rispondere a ulteriori domande come i modelli di espressione relativa, l'identità dei compartimenti cellulari e subcellulari e gli effetti in diversi background genetici o malattie. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la maggior parte dei tipi di ibridazione in situ in qualsiasi tipo di tessuto o embrione. Non dimenticare che lavorare con reagenti come formaldeide, perossido di idrogeno e formamide può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione della procedura è necessario prendere sempre precauzioni come la corretta manipolazione e smaltimento.