Name: Ibridazione fluorescente In Situ ad alta risoluzione in embrioni della drosofila e tessuti mediante amplificazione del segnale Tyramide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: Impara l'ibridazione in situ con amplificazione del segnale tyramide per rilevare RNA ad alta risoluzione in embrioni e tessuti di Drosophila. Questo metodo economico utilizza piastre a 96 pozzetti per analisi ad alto rendimento.

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Finanziamento per questo progetto ha fornito una sovvenzione alla HMK dal canadese istituti di salute ricerca (concedere 133473 MOP).

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li>
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<li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).</li>
<li>Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilk%2C+R+%22Current+Protocols+Essential+Laboratory+Techniques%22">Current Protocols Essential Laboratory Techniques</a>. , Wiley Online Library. Vol. 9.3.1-9.3.24 1-9 (2010).</li>
<li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+mRNA+Localization+in+Animal+Cells+and+Why+It+Matters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li>
<li>Martin, K. C., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+Localization%3A+Gene+Expression+in+the+Spatial+Dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension.</a> Cell. , 719-730 (2009).</li>
<li>Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+and+pervasive+subcellular+distributions+for+both+coding+and+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs.</a> Genes Dev. 30, 594-609 (2016).</li>
<li>Zhou, X. L., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+kidney+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules.</a> Dev Biol. 271, 322-338 (2004).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nessun concorrenti interessi finanziari.

Il protocollo descritto fornisce un metodo altamente riproducibile, sensibile ed economico per la rilevazione della maggior parte RNAs in fissa embrioni della drosofila o tessuti. Anche se leggermente più complessa rispetto più tradizionalmente utilizzato metodo di fosfatasi alcalina di sonda rilevazione, la risoluzione ottenuta da pesce è molto più grande e la sensibilità è paragonabile o migliore 7,8. Utilizzando piastre microtiter intero o parziale, dei protocolli possono essere utilizzati per analisi su larga scala o limitati di geni di interesse. Dovrebbe essere notato che le sonde generate potrebbero rilevare tutti o multiple della giuntura di trascrizione forma a meno che le sonde sono più specificamente progettati (cioè, singoli esoni). Anche se abbiamo testato sonde piccole come 200 nucleotidi con discreto successo, sonde più piccole tendono ad essere meno efficaci e possono essere meno specifici. Chiaramente, questo protocollo non è appropriato per la rilevazione di piccoli introni, esoni, o elaborati microRNA.
Sebbene questo approccio utilizza un passaggio enzimatico per aumentare la forza del segnale, intensità del segnale sembra essere proporzionale all'espressione genica in una relativamente lineare e ampia gamma di livelli di espressione. A maggiore ingrandimento, il segnale è visto come puncta o macchioline all'interno di cellule e tessuti. Per le trascrizioni relativamente rare sono visti solo pochi piccoli puncta. Abbondanza di trascrizione aumenta, questi si sviluppano in numero e dimensioni. Come con la singola molecola pesce (smFISH), singola puncta piccolo può anche corrispondere a singolo RNAs e inoltre dovrebbe essere facilmente quantificato utilizzando il software di imaging e informatica. Confronti di immagini pubblicate ottenute mediante smFISH con le immagini che abbiamo abbiamo curato per i medesimi obiettivi suggeriscono che il complessivo, la sensibilità e la risoluzione dei due metodi sono relativamente simili, anche se questo dovrebbe essere testato tramite i confronti più rigorosi. Dato il costo molto più elevato di smFISH, il metodo fornito qui dovrebbe dare risultati simili a una frazione del costo. Tuttavia, se l'obiettivo è quello di rilevare piccole trascrizioni o parti distinte di trascrizioni, smFISH è raccomandato.
A causa delle dimensioni più piccole di alcune sonde FISH, questo metodo può anche essere meglio a tessuti penetranti che sono grandi o con barriere significative. Tuttavia, il nostro uso di livelli più elevati di detersivo e tweaks di fissazione e permeabilizzazione tessuto sembrano hanno risolto questo problema. Infine, sebbene sviluppato per tessuti di Drosophila , il buffer di detergente alta descritto qui per tessuti dissecati dovrebbe funzionare anche per tessuti, nonché la maggior parte altri organismi ed embrioni della drosofila .

Nuovi metodi di rilevamento RNA genoma come RNA-seq hanno notevolmente ampliato la nostra conoscenza di dove e quando i geni sono espressi, e a quali livelli di1. Tuttavia, questi forniscono relativamente scarsa risoluzione spaziale e temporale. Ibridazione in situ RNA permette la distribuzione spaziale delle trascrizioni da osservare visivamente in tessuti fissi, rivelando così i dettagli di localizzazione cellulare e subcellulare2. Usando l'ibridazione in situ fluorescente (FISH) permette maggiore risoluzione spaziale come consente l'utilizzo di tecniche di microscopia potente, come di microscopia confocale e leggero foglio3. Marcatori fluorescenti come DAPI è utilizzabile anche per stabilire relazioni sottocellulare4. PESCE, inoltre, facilita l'osservazione di più di RNA e proteine contemporaneamente con chiare indicazioni di sovrapposizione a livello subcellulare. Reagenti unici e passaggi necessari per doppia marcatura possono essere trovati nei seguenti riferimenti3,5.
Le procedure descritte qui utilizzano 96 piatti di microtitolo per tutti i passaggi, tra cui produzione di modello di cDNA (PCR della Colonia), produzione di sonda RNA (mediante trascrizione della polimerasi dipendente dal dilavamento T7, T3 o SP6), ibridazione in situ , e sviluppo del segnale fluorescente. Un numero sufficiente di embrioni o tessuti vengono aggiunti a ogni bene della piastra 96 pozzetti per consentire la valutazione della coerenza e della variabilità. Bene, allora ognuno riceve una sonda diversa. Dopo lo sviluppo di segnale, embrioni o tessuti da ogni pozzetto sono schierati su vetrini da microscopio individuali per l'analisi al microscopio.
L'uso di amplificazione del segnale di microarray (TSA) per sonda rilevazione produce segnali robusti con una risoluzione eccezionale subcellulare 5,6,7,8. La localizzazione subcellulare di RNA è un importante meccanismo di regolazione 9 che sembra accadere con praticamente tutti gli RNA 4,10,11. Queste analisi hanno inoltre dimostrato che molte trascrizioni che non vengono rilevate da RNA-seq vengono prontamente rilevate da pesce 8. L'adattamento di RNA in situ ibridazione per piastre da 96 pozzetti permette l'analisi di fino a 96 geni di interesse in un momento (più se ulteriori piastre vengono utilizzati), rendere possibile l'analisi di DataSet di grandi dimensioni. Tagliando le piastre in sezioni più piccole, il metodo è anche facilmente adattato a pochi campioni. Il protocollo fornito è appropriato per l'analisi delle distribuzioni di RNA nella maggior parte dei tipi di tessuti. Anche se non indicato, è adattabile ai non - tessutidella drosofila pure.

<table><tbody><tr><td>Provette da centrifuga coniche in polipropilene da 15 ml</td><td>Frogga Bio</td><td>TB15-500</td><td>Certificato senza DNasi e RNasi</td></tr><tr><td>2x PCR Master Mix con colorante (Ambiogene)</td><td>Biomart (Canada)</td><td>141106-1K</td><td>Certificato senza DNasi e RNasi</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga coniche in polipropilene da 50 ml</td> Piastra di filtrazione a 96 pozzetti certificata <td>Frogga Bio</td><td>TB50-500</td> Piastra di filtrazione a 96 pozzetti <td>senza DNasi e RNasi</td></tr><tr><td>(1,2 um, PVDF idrofilo membrana</td><td>EMD MILLIPORE</td><td>MSBVS1210</td><td>Utilizzato per rimuovere il liguid dal fondo della piastra con tessuti flottanti</td></tr><tr><td>Piastra PCR a 96 pozzetti (200 &mu; l)</td><td>Denville</td><td>C18096-10</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa Acrodisc (0,2 u)</td><td>PALL</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa Acrodisc (0,45 u)</td><td>PALL</td><td>PN4614</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA002.500</td><td></td></tr><tr><td>AXYGEN Piastre di conservazione per saggi a 96 pozzetti</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-P96-450V-C</td><td>Per conservare le scorte di glicerolo batterico</td></tr><tr><td>AXYGEN Alluminio Guarnizioni per piastre</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-PCR-AS-200</td><td>Per sigillare le piastre</td></tr><tr><td>AXYGEN Punte a foro largo (200 ul)</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-T205-WB-C</td><td>Per trasferire campioni</td></tr><tr><td>Biotina-SP (spaziatore lungo) Frazione IgG Monoclonale di topo Anti-Digossina</td><td>Jackson ImmunoResearch Lab</td><td>200062156</td><td>Anticorpo primario per in situ (conc. stock 1 mg/ml, conc. di lavoro 2,5 &mu; g/ml o 1/400 di diluizione.</td></tr><tr><td>MARCA: Collettore a 8 canali (autoclavabile)</td><td>BrandTech Scientific, Inc.</td><td>704526</td><td>Per rimuovere i liquidi dalla parte superiore delle piastre PCR a 96 pozzetti</td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C1919</td><td>Concentrazione di riserva 34 mg/ml disciolto e 0,2&mu; m filtrato in 100 % EtOH (utilizzare come 1/1000)</td></tr><tr><td>Cianina 3 Tiramide (Cy3-TSA)</td><td>Fatto in</td><td></td> casa <td>Potrebbe essere ordinato da Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA</td></tr><tr><td>DABCO (1,4-Diazabiciclo[2.2.2]ottano)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D2522</td><td>Reagente antisbiadimento in terreno di montaggio</td></tr><tr><td>Digoxigenina-11-uridina-5'-trifosfato</td><td>Roche</td><td>11-209-256-910</td><td></td></tr><tr><td>Gabbia per la raccolta degli embrioni</td><td>Home made N</td><td>/A Dimensioni</td><td>: 75 cm X 75 cm X 75 cm realizzato con Polimetilmetacrilato</td></tr><tr><td>Centrifuga Eppendorf 5804</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5804</td><td>Centrifuga per piastre a 96 pozzetti su rotore A-Z-DWP Formamide</td></tr><tr><td></td><td>Bioshop</td><td>FOR001.500</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Bioshop</td><td>GLY002.4</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Bioshop</td><td>GLN001.500</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784-250MG</td><td>Stock: 50 mg/ml. Concentrazione di lavoro 1 mg/ml in soluzione di ibridazione</td></tr><tr><td>Lab Armor Beads</td><td>DiaMed</td><td>LAA42370-001</td><td>Riempire l'unità di riscaldamento</td></tr><tr><td>Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-998-347</td><td>Miscelazione del campione</td></tr><tr><td>Mesh - 100 micons</td><td>FlyStuff</td><td>57-103</td><td>Per la raccolta di embrioni</td></tr><tr><td>Mesh - 800 micron</td><td>SEFAR - Nytex</td><td>06-780/53</td><td>Per la cattura di tessuti sciolti / può essere utilizzato per tubi speciali nella figura 4.</td></tr><tr><td>Micro Cover Glasses</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>Dimensioni: 22 X 22 mm</td></tr><tr><td>Micro vetrini, frstd</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>Dimensioni: 25 X 75 mm</td></tr><tr><td>Collettore per vuoto a piastre multipozzetto</td><td>Pall Corporation</td><td>Pall Corporation P/N 5017</td><td>Rimuovere il liquido dal fondo della piastra filtrante a 96 pozzetti</td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Bioshop</td><td>PAR070.500</td><td></td></tr><tr><td>Macchina PCR</td> di fissazione <td>Bio-Rad</td><td>Modello: DNA Engine PTC-200</td><td>Piastra a 96 pozzetti PCR e denatura della sonda</td></tr><tr><td>Soluzione di acido picrico</td><td>Sigma-aldrich</td><td>80456</td><td>Per la fissazione dei tessuti Soluzione I</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCL)</td><td>Bioshop</td><td>POC308</td><td></td></tr><tr><td>Coperchio in PP per piastre a 96 pozzetti, 100/confezione</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-P-LID-PP</td><td>Coperchio per la conservazione</td></tr><tr><td>delle piastre Serbatoi di reagenti monouso Progene (50 ml, sterili)</td><td>UltiDent Scientific</td><td>825-1-50-5S</td><td>Manipolazione dei liquidi</td></tr><tr><td>Progene Foglio di alluminio perforabile</td><td>UltiDent Scientific</td><td>87-CFILM-AL</td><td>Guarnizione Piastra a 96 pozzetti, proteinasi K senza DNasi e RNasi</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-aldrich</td><td>P2308- 5MG</td><td>Permeabilizzazione dell'embrione</td></tr><tr><td>Inibitore della ribonucleasi RiboLock</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td>Set da 40 unità/ul</td></tr><tr><td>di ribonucleoside trifosfato (NTP)</td><td>Roche</td><td>11277057001</td><td>Sonda per RNA Sitesi</td></tr><tr><td>Acqua priva di RNasi</td><td>GIBCO</td><td>10977015-500ml</td><td>Sintesi per sonda RNA</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td>Rimozione della contaminazione da RNasi</td></tr><tr><td>DNA a singolo filamento dai testicoli di salmone</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D9156</td><td>Per soluzione di ibridazione</td></tr><tr><td>Latte scremato (senza grassi)</td><td>Bioshop</td><td>SKI400.500</td><td>La concentrazione di lavoro è dell'1 % in 1 X PBT o PBTT come reagente bloccante</td></tr><tr><td>Acetato di sodio (NaOAc) 3 M, pH=5,2 (senza RNasi)</td><td>Bioshop</td><td>SAA333</td> La <td>concentrazione di lavoro è del 10 % (v/v) per la precipitazione di DNA o RNA</td></tr><tr><td>SP6 RNA polimerasi</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0131</td><td>20 unità/ul</td></tr><tr><td>Colpo in acciaio inossidabile per bagno di sabbia</td><td>VWR</td><td>13259-274.</td><td>Per riempire l'unità di riscaldamento</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio e sorgente luminosa a collo d'oca</td><td></td><td>Leica Modello: MZ6</td><td>Dissezione tissutale e montaggio</td></tr><tr><td>Streptavidina, perossidasi di rafano (HRP) coniugato</td><td>Sonde molecolari</td><td>S911</td><td>Stock di anticorpi secondari: 1 mg/ml, utilizzare una diluizione 1/1000 (1 &mu; g/ml) per in situ.</td></tr><tr><td>T3 RNA Polimerasi</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0101</td><td>20 Unità/ul</td></tr><tr><td>T7 RNA Polimerasi</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0111</td><td>20 Unità/ul</td></tr><tr><td>Stazione di punta (10 ul)</td><td>Axygen</td><td>T-300-STK-S</td><td>Certificato DNasi e RNasi</td></tr><tr><td>senza Tip station (200 ul)</td><td>Sorbio</td><td>27770T</td><td>Certificato DNasi e RNasi</td></tr><tr><td>( 1ml)</td><td>Sorbio</td><td>10200</td><td>Certificato </td></tr><tr><td>TRITON X-100</td><td>Bioshop</td><td>TRX506</td> senza DNasi e RNasi La <td>concentrazione di lavoro è dello 0,3% in 1 X PBT per i tessuti in situ</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop</td><td>TWN510</td><td>La concentrazione di lavoro è dello 0,1% in 1 X PBT per embrione in situ</td></tr><tr><td>Carta da filtro qualitativa Whatman, grado 3</td><td>Sigma-aldrich</td><td>WHA1003917</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Company </td><td>Numero catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td>Preparation</td></tr><tr><td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octano) glicerolo anti-sbiadimento DABCO</td><td></td><td></td><td>(1,25 g), glicerolo (35 ml o v/v 70 %) e 1 X PBS (15 ml, o v/v 30 %). Tenere buio e roccia in cella frigorifera. Conservare a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>1 X PBT (1L)</td><td></td><td></td><td>1 X PBS con 1 ml di Tween 20 (0,1 %)</td></tr><tr><td>1 X PBTT (1L)</td><td></td><td></td><td>1 X PBS con 1 ml di Tween 20 (0,1 %) e 3 ml di Triton-X-100 (0,3 %)</td></tr><tr><td>1 X PBTB (1L)</td><td></td><td></td><td>1 % di latte scremato in 1 X PBT</td></tr><tr><td>1 X PBTTB (1L)</td><td></td><td></td><td>1 % di latte scremato in 1 X PBTT</td></tr></tbody></table>

ibridazione fluorescente in situ ad alta risoluzione in embrioni della drosofila e tessuti mediante amplificazione del segnale tyramide

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Nei nostri sforzi per determinare i modelli di espressione e localizzazione subcellulare di Drosophila RNAs su una base del genoma e in una varietà di tessuti, abbiamo sviluppato numerose modifiche e miglioramenti al nostro originale fluorescente in situ protocollo di ibridazione (pesce). Per facilitare la velocità effettiva e convenienza, tutte le fasi, dalla generazione di sonda per il rilevamento del segnale, vengono eseguite utilizzando piastre microtiter a 96 pozzetti esone. Digoxygenin (DIG)-etichettati antisenso RNA sonde sono prodotte utilizzando DNA genomico o cDNA cloni come modelli. Dopo il fissaggio del tessuto e permeabilizzazione, sonde sono ibridate al trascrizioni di interesse e quindi rilevato utilizzando una successione di anticorpo anti-DIG coniugato con biotina, streptavidina coniugata con perossidasi di rafano (HRP) e coniugato fluorescente tyramide, che in presenza di HRP, produce un intermedio altamente reattivo che si lega alle regioni densi dell'elettrone di proteine immediatamente adiacente. Questi passaggi di amplificazione e localizzazione producono un segnale robusto e altamente localizzato che facilita la localizzazione sia trascrizione cellulare e subcellulare. I protocolli forniti sono stati ottimizzati per produrre segnali altamente specifici in una varietà di tessuti e stadi di sviluppo. Inoltre vengono forniti riferimenti per variazioni aggiuntive che consentono la rilevazione simultanea di più trascrizioni, o trascrizioni e proteine, allo stesso tempo.

Figura 6 Mostra esempi di risultati ottenuti con questa procedura. Il top 3 pannelli mostrano esempi di primi embrioni della drosofila (Figura 6, pannelli A-C), il successivo 3 pannelli mostrano esempi di ritardo embrioni della drosofila con segnali in tessuti differenti (amnioserosa, muscoli e sistema nervoso centrale, rispettivamente (Figura 6, pannelli D-F). Poi ci sono esempi da 3rd instar larvali tessuti (Figura 6, pannelli G-J). Pannelli K e L Visualizza immagini rappresentative da adulti gonadi (ovaie e testicoli, rispettivamente). Centinaia di immagini è state caricate e annotata nel nostro ricercabili 'fluorescente in situ moscerino della frutta database' (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig1.jpg"> 
Figura 1. Contorno di fluorescenza in situ di ibridazione (pesce) protocollo chiave attrezzature e. (A) l'amplificazione di PCR del cDNA. (B) trascrizione In vitro per generare gene-specifico antisenso DIG - sonde di RNA in una piastra a 96 pozzetti (foto della piastra mostrata in b). (C) e (D): adulti (femminile: rapporto maschio 2:1. 300-400 mosche/bottiglia) mosche sono permesso di accoppiarsi per 3-4 giorni. Embrioni da una raccolta durante la notte il cibo di farina di mais standard a 25 ° C a una scatola di plastica ben ventilata (1 L di cibo di farina in un contenitore di dimensioni: 8 "X 8" X 3" LWH) o a nuove bottiglie mantenendo una corretta densità larvale. Per la raccolta di tessuto, polvere di lievito attivo dovrebbe essere spruzzata sulla sommità del cibo a 24, 48 ore dopo (AEL) la deposizione delle uova. (E-H): Gli esperimenti di ibridazione fluorescente in situ effettuate oltre 3 giorni consecutivi. Per gli embrioni o tessuti che non galleggiano, utilizzare una piastra PCR a 96 pozzetti, come mostrato in fotografia b con aspiratore 8 canali (foto c). Per i tessuti che galleggiano, come la maggior parte dei tessuti larvale, utilizzare un filtro con il fondo piatto (fotografia in d) e rimuovere il liquido dal basso con un aspiratore collettore utilizzando bassa pressione (foto e). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig2.jpg"> 
Figura 2. Determinazione del rendimento sonda RNA. Recentemente sintetizzato sonde antisenso RNA osservate su un gel di agarosio 1% (5 µ l/lane). Il rendimento può essere categorizzato (basato sull'intensità della band) come 'bassa resa' in vicoli 3 e 10, 'rendimento tipico' nelle corsie 1, 4, 5, 6 e 8 o 'ad alto rendimento' nelle corsie 2, 7, 9, 11 e 12. Per campioni con 'rendimenti tipici', utilizzare 10-15 µ l di sonda diluito in 100 µ l di soluzione di ibridazione per ogni esperimento in situ . Diluire i campioni con alti rendimenti della sonda con la soluzione di ibridazione aggiuntiva secondo l'intensità di banda rispetto a un'intensità 'tipico sonda'. Mirare ad avere concentrazioni di sonda finale approssimativamente uguale in ciascun pozzetto. La freccia punta verso una delle sonde' RNA', la banda superiore su ogni corsia è il modello di DNA originale. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig3.jpg"> 
Figura 3. Principali passaggi per una raccolta di embrioni su larga scala e fissazione. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig4.jpg"> 
Figura 4. In casa tube per rimuovere il liquido dai tessuti larvali o galleggianti. Alcuni tessuti larvali e adulti galleggiano in soluzione durante la fissazione. Questo semplice strumento è costituito da una rete di nylon, tenuta da un 200 µ l taglio punta, seguita da una mancia di 1 mL come un adattatore per collegare a un aspiratore. Liquido può essere tranquillamente rimosso senza perdere qualsiasi tessuto. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig5.jpg"> 
Figura 5. Amplificazione del segnale di tyramide. (1) scavare-contrassegnata sonda RNA antisenso ibridizza con senso endogeno RNA. (2) Immuno-affinità che lega tra anticorpo primario coniugato con biotina e DIG-UTP. (3) HRP coniugato streptavidina biotina si lega. (4) HRP catalizza la reazione di cianina 3-microarray e perossido di idrogeno per formare i radicali di breve durata cianina 3-microarray. (5) i radicali cianina 3-microarray associare ai residui della tirosina di proteine nelle vicinanze. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig6.jpg"> 
Nella figura 6. Rappresentante in situ immagini ibridazione. Ogni pannello viene illustrato un esempio di un RNA diverso (mostrato in ciano) e nuclei macchiati con DAPI (mostrato in rosso). (A-C) Esempi di primi embrioni della drosofila . (D, F) Esempi di tardi embrioni della drosofila . (G-J) Esempi di 3rd instar larvale tessuti della drosofila (tubuli malphigian, muscolo, della ghiandola salivaria e del midgut rispettivamente). (K) adulto dell'ovaia. (L) testicolo adulto. Ogni pannello viene visualizzato il nome del gene che la sonda è ibridazione a. Barre di scala = 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Il protocollo descritto di RNA in situ ibridazione del permette la rilevazione del RNA in embrioni della drosofila interi o tessuti dissecati. Utilizzando piastre microtiter a 96 pozzetti e amplificazione del segnale di microarray, trascrizioni possono essere rilevate alla velocità effettiva, sensibilità e alta risoluzione e ad un costo relativamente basso.

Ibridazione fluorescente In Situ ad alta risoluzione in embrioni della drosofila e tessuti mediante amplificazione del segnale Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare i trascritti di RNA in situ all'interno di cellule e tessuti. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della biologia cellulare e dello sviluppo, come ad esempio dove all'interno di una cellula, di un tessuto o di un embrione si trova un determinato RNA. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di rilevare le distribuzioni spaziali dell'RNA con elevata risoluzione e sensibilità, e a un costo ridotto rispetto ad altri metodi.Abbiamo inizialmente sviluppato questo protocollo per studiare le distribuzioni subcellulari di un numero il più possibile elevato di RNA di Drosophila. Ciò al fine di determinare l'entità e la diversità delle distribuzioni subcellulari. Abbiamo iniziato il progetto lavorando con embrioni, ma successivamente abbiamo adattato e ottimizzato il protocollo in modo da poter lavorare in alto rendimento con tessuti dissecati da larve e moscerini.L'aspetto più complesso della procedura è il numero di passaggi e il conseguente rischio di errore, oltre alla necessità di garantire l'assenza di RNA durante la produzione della sonda. Per facilitare l'elevata produttività e l'efficienza economica, le procedure mostrate in questo video utilizzano piastre microtitolatrici a 96 pozzetti per tutti i passaggi. È inoltre semplice adattare questo metodo a un numero minore di campioni, tagliando le piastre in strisce da otto o dodici pozzetti.Iniziare diluendo 10 microlitri di una coltura batterica da incubazione notturna in 90 microlitri di acqua doppio-distillata autoclavata in ciascun pozzetto di una nuova piastra PCR a 96 pozzetti. Denaturare il DNA a 95 gradi Celsius in un termociclatore per cinque minuti. Posizionare immediatamente la piastra sul ghiaccio per almeno cinque minuti.Impostare le reazioni PCR in una nuova piastra PCR a 96 pozzetti. Utilizzare i primer universali appropriati e aliquotare 48 microlitri della miscela master PCR in ogni pozzetto. Aggiungere due microlitri di ciascun DNA plasmidico denaturato come stampo per pozzetto.Eseguire l'amplificazione in una termociclatore PCR a 96 pozzetti. Al termine dell'amplificazione, precipitare il prodotto PCR con una miscela di etanolo e acetato di sodio. Conservare i campioni per 30 minuti a meno 80 gradi Celsius.Centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 2.250 ×g a quattro gradi Celsius per 45-60 minuti. Utilizzando una pipetta a otto canali con manifold a vuoto dotata di una struttura che impedisce alle punte di raggiungere il fondo dei pozzetti durante l'aspirazione dei pellet, rimuovere con attenzione il soprannatante. Lavare una volta con 160 microlitri di etanolo al 70% freddo.Centrifugare a 2.250 ×g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Capovolgere delicatamente la piastra a 96 pozzetti su un tovagliolo di carta per rimuovere le ultime gocce di liquido da ogni pozzetto ed essiccare all'aria i pellet di DNA a temperatura ambiente per un'ora. Risospendere il DNA precipitato in 25 microlitri di acqua priva di RNasi.Verificare le dimensioni e il rendimento dei prodotti di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio. Impostare le reazioni di trascrizione in vitro aggiungendo i componenti appropriati in ciascun pozzetto di una nuova piastra PCR a 96 pozzetti. Aggiungere 7,5 microlitri di stampo di DNA in ciascun pozzetto corrispondente.Coprire la piastra con del nastro sigillante. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un periodo compreso tra 3 ore e mezza e 4 ore. Successivamente, aggiungere in ogni pozzetto una miscela madre costituita da acqua bidistillata trattata con DEPC, etanolo al 100% e acetato di sodio 3 M.Conservare a meno 80 gradi Celsius per 30 minuti. Centrifugare la piastra e lavare le pozzette come mostrato in precedenza. Risospendere la sonda precipitata in 25 microlitri di acqua bidistillata trattata con DEPC.I nuovi sonde di RNA antisenso appena sintetizzati sono stati sottoposti a elettroforesi su gel di agarosio all'1% per verificarne l'integrità e il rendimento. Sulla base dell'intensità della banda, il rendimento può essere classificato come basso, tipico o elevato. Dopo aver utilizzato cinque microlitri di ogni sonda per l'elettroforesi su gel di agarosio, mescolare i restanti 20 microlitri con 100 microlitri di soluzione di ibridazione e conservare a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso.Per iniziare questa procedura, posizionare da 20 a 30 larve in una piastra di Petri contenente PBS freddo nella soluzione di fissaggio e raffreddare sul ghiaccio per due minuti per ridurre la motilit&agrave; delle larve. Dissezionare le larve sotto un microscopio stereoscopico. Utilizzare un paio di pinzette affilate per aprire con attenzione la parte anteriore e spingere i tessuti dalla parte posteriore verso quella anteriore.Dopo un massimo di 15 minuti, trasferire i tessuti dissecati in una provetta da 1,5 millilitri per la fissazione e porre sul ghiaccio. Rimuovere il PBS e aggiungere 800 microlitri di soluzione di fissaggio uno. Incubare su un agitatore da banco per 30 minuti insieme ad altri tessuti precedentemente raccolti e in fase di fissazione.Risciacquare i tessuti una volta con 800 microlitri di PBTT e mantenere il tubo sul ghiaccio mentre vengono raccolti e fissati ulteriori tessuti. Riunire tutti i tessuti dissecati in un unico tubo di plastica da 15 millilitri contenente una rete nel coperchio del tubo. Aspirare il liquido in eccesso attraverso la rete presente nel coperchio.Lavare con 10 millilitri di PBTT e risciacquare con 10 millilitri di PBS. Per inibire l'attività della perossidasi endogena, aggiungere cinque millilitri di perossido di idrogeno allo 0,3% in PBS e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Lavare due volte con 10 millilitri di PBTT.Permeabilizzare i tessuti aggiungendo 10 millilitri di acetone all'80% pre-raffreddato e incubando a meno 20 gradi Celsius per 10 minuti. Lavare due volte con 10 millilitri di PBTT per reidratare i tessuti. Dopo il lavaggio dei tessuti come descritto nel protocollo testuale, conservare nella soluzione di ibridazione a meno 20 gradi Celsius.Se non utilizzato entro il giorno successivo, l'assiemaggio del filtro deve essere sostituito con un tappo normale. Aliquotare circa 20 microlitri per pozzetto di tessuti in una piastra PCR a 96 pozzetti su ghiaccio. Utilizzando una pipetta multicanale con manifold, rimuovere la soluzione di ibridazione dai tessuti.Aggiungere 100 microlitri di soluzione di ibridazione appena denaturata in ogni pozzetto e coprire con del nastro sigillante. Pre-ibridare i tessuti a 56 gradi Celsius utilizzando un bagno a secco riscaldato contenente perle di metallo per un tempo minimo compreso tra due ore e mezza e tre ore. Denaturare 100 microlitri della sonda preparata in una piastra PCR a 96 pozzetti a 80 gradi Celsius per cinque minuti.Raffreddare immediatamente in ghiaccio per cinque minuti. Rimuovere la soluzione di pre-ibridazione dai tessuti e aggiungere sonde specifiche per il gene denaturate a ciascun campione. Coprire con nastro sigillante in alluminio e ibridare a 56 gradi Celsius sotto perle metalliche in un bagno asciutto per 16-18 ore durante la notte.Prima di iniziare la procedura di rilevamento della sonda, preriscaldare tutte le soluzioni necessarie nell'unità di riscaldamento a 56 gradi Celsius. Trasferire con attenzione i tessuti ibridati in una piastra a 96 pozzetti adatta a un manifold a vuoto per piastre multipozzetto. I pozzetti di queste piastre presentano fondi in membrana che consentono la rimozione del contenuto sotto vuoto.Rimuovere le sonde dalla piastra a 96 pozzetti e lavare i campioni con miscele di soluzione di ibridazione e PBTT seguendo i passaggi indicati in questa tabella nell'unità di riscaldamento a 56 gradi Celsius. Dopo il terzo lavaggio con PBTT, rimuovere la piastra a 96 pozzetti dall'unità di riscaldamento, eliminare la soluzione PBTT e bloccare i tessuti con PBTTB su un agitatore da banco a temperatura ambiente per 20 minuti. Aggiungere 100 microlitri di soluzione anticorpale per pozzetto e incubare per due ore sul mixer per campioni da banco.Dopo aver lavato con PBTTB come descritto nel protocollo testuale, aggiungere 100 microlitri di soluzione di streptavidina perossidasi di ravanello per pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 1 ora e 1/2. Lavare due volte con PBTTB per cinque minuti per ogni lavaggio. Successivamente, incubare i tessuti con la soluzione di DAPI come descritto nel protocollo testuale.Iniziare questa procedura incubando i campioni con la soluzione di tiaramide e incubare i campioni per due ore sul mixer da banco al buio. Rimuovere la soluzione di tiaramide dai tessuti al termine dell'incubazione. Dopo aver lavato con PBT e PBS come descritto nel protocollo testuale, aggiungere 150 microlitri di mezzo di montaggio antifade per ogni pozzetto.Mantenere i campioni a quattro gradi Celsius durante la notte per consentire ai tessuti di sedimentare sul fondo della pozzetta o del tubo. Il giorno successivo, montare i campioni su un vetrino da microscopia e sigillare con un coprioggetto. Infine, acquisire le immagini dei campioni utilizzando un microscopio a fluorescenza.Sono mostrati esempi di risultati ottenuti utilizzando questa procedura su embrioni di Drosophila precoci ed embrioni di Drosophila tardivi con segnali nell'amnioserosa, nei muscoli e nel sistema nervoso centrale. Il nome del gene al quale la sonda si è ibridata è indicato in ciascun pannello. Seguono esempi da tessuti di larve di terzo stadio, tubuli di Malpighi, midgut, ghiandola salivare e muscolo.Infine, vengono mostrate immagini rappresentative di ovaio adulto e testicolo adulto. Una volta acquisita padronanza e se eseguita in modo efficiente, questa tecnica può essere completata in soli due giorni. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di lavorare su un bancone privo di RNasi, utilizzando punte, tubi, piastre e soluzioni prive di RNasi, e di indossare guanti.Se si lavora con un elevato numero di campioni o sonde, non affrettare la procedura. È inoltre consigliabile escogitare dei trucchi per non dimenticare a che punto ci si trova. Quando si segue questa procedura, è possibile combinarla con altri metodi, come la rilevazione di sonde multiple, sonde con proteine o marcatori cellulari.Con questi è possibile rispondere ad ulteriori domande riguardo i modelli di espressione relativi, le identità cellulari e dei compartimenti subcellulari, nonché gli effetti in diversi contesti genetici o in presenza di malattie. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire la maggior parte dei tipi di ibridazione in situ in qualsiasi tipo di tessuto o embrione. Non dimenticare che lavorare con reagenti come formaldeide, perossido di idrogeno e formammide può essere estremamente pericoloso e che si devono sempre adottare precauzioni come un'idonea manipolazione e smaltimento durante l'esecuzione della procedura.

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Ibridazione fluorescente In Situ ad alta risoluzione in embrioni della drosofila e tessuti mediante amplificazione del segnale Tyramide (Video) | JoVE Journal

Ibridazione fluorescente In Situ ad alta risoluzione in embrioni della drosofila e tessuti mediante amplificazione del segnale Tyramide

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