Microscopia intravital del monocito Homing e l'angiogenesi tumore-relativa in un modello murino della malattia arteriosa periferica

Ciao, mi chiamo Christian Deffge. Sono un medico presso l'ospedale universitario di Magdeburgo e lavoro nel gruppo di ricerca cardiovascolare del Dr.Herold e del Professor Braun-Dullaeus. Studiamo l'aumento della crescita delle garanzie.

Pertanto, utilizziamo l'imaging. In questo video vogliamo spiegare i nostri metodi. Risospendere le cellule in un terreno di coltura privo di siero con una densità di una volta 10 per la sesta cellula per millilitro.

Aggiungere cinque microlitri di un millimolare di DIO e dimetilformammide a un millilitro di sospensione cellulare e risospendere con cura. Incubare la soluzione cellulare a 37 gradi centigradi per 20 minuti. Centrifugare le celle a 500 g per cinque minuti.

Spostare il surnatante e risospendere le cellule con un terreno caldo integrato con FCS a 37 gradi centigradi. Ripetere questo passaggio due volte. Contare le cellule con l'aiuto di una camera di conteggio Neubauer e della microscopia ottica.

Risospendere le cellule con una soluzione di cloruro di sodio. Iniettare le cellule nella vena caudale. La matrice di Matrigel è una preparazione ricostituita della membrana basale estratta dal sarcoma squamoso.

Esamina le molecole di test per la formazione di reti cellulari endoteliali o per le terapie antitumorali attraverso l'inibizione angiogenica. Rivalutare il potenziale angiogenico tumorale dei monociti che ci sforziamo di utilizzare per la terapia cellulare. Aggiungere 100 nanogrammi di BFGF, 300 nanogrammi di VEGFA e 26 unità internazionali di eparina in condizioni sterili al Matrigel.

Dopo aver agitato la soluzione, riempirla in una siringa da insulina da un millilitro e conservarla in ghiaccio fino al momento dell'uso. Per una migliore visibilità della placca sottocutanea Matrigel, radere la pelle del topo nel sito di iniezione. Puoi usare un bisturi affilato o una crema depilatoria.

Appoggiare l'animale sul tavolo e tenere la pelle del topo vicino al sito di iniezione sul fianco. Iniettare 500 microlitri di Matrigel per via sottocutanea. Per motivi pratici, è necessario iniettare il Matrigel in modo compatto in un unico punto per evitare la dispersione sottocutanea.

Sarà più facile rimuovere la matrice di Matrigel dal tessuto dopo aver sacrificato il topo alla fine dell'esperimento. Praticare l'iniezione di monociti con soluzione di cloruro di sodio prima della sperimentazione. Se i monociti non possono essere applicati per via sistemica, non ci sarà alcun effetto sistemico.

Nell'ambito di questo protocollo, abbiamo iniettato 2,5 milioni di monociti. Cerca di iniettare non più di cinque microlitri per grammo. Assicurati che il mouse sia riscaldato con l'aiuto di un termoforo durante l'intera procedura.

Per l'applicazione sistemica delle cellule, avrai bisogno di un contentore e una siringa da insulina da un millilitro, un ago da 30 g e i monociti risospesi e la soluzione di cloruro di sodio. Maneggiare con cura il mouse e trattenere l'animale nel sistema di contenzione. Assicurati che il mouse non sia danneggiato e abbia uno spazio adeguato per respirare.

Metti il sistema di ritenuta sul termoforo in modo che la coda possa toccare la piastra. Assicurati di disinfettare il sito di iniezione per evitare un'infezione. Identifica le vene della coda che si trovano sul lato laterale della coda.

Ruota la coda di 90 gradi in modo che la vena della coda appaia sul lato superiore della coda. Provare a iniettare la soluzione di monociti in un angolo piatto. Osservare l'animale per 30 minuti per cercare effetti collaterali sistemici.

Metti il topo nella sua gabbia dopo che l'animale si è completamente ripreso. Posizionare il mouse anestetizzato sul tavolino del microscopio preriscaldato dopo che il microscopio ha raggiunto condizioni stabili e le impostazioni sono state testate da un manichino. Fissare le zampe con del nastro adesivo.

Disinfettare la pelle nel sito della gamba o del fianco utilizzato per la microscopia. Radere la regione di interesse per una migliore manipolazione ed evitare interferenze con i capelli. Mantieni umida la regione di interesse.

In caso contrario, la qualità delle immagini e dei tessuti sarà compromessa. Posizionare la gamba tra due steli regolabili. Posizionare un bicchiere di copertura sopra gli steli.

Avviare la microscopia e regolare la posizione della gamba, se necessario. Le impostazioni del microscopio dipendono dal software utilizzato. Si prega di consultare il protocollo per ulteriori informazioni.

I nostri dati dimostrano che la microscopia intravitale rappresenta un potente strumento per la visualizzazione dei monociti trapiantati all'interno del flusso sanguigno in piccoli modelli animali. I monociti devono essere iniettati nel sistema venoso per mantenere gli effetti sistemici e per evitare gli emboli, che possono verificarsi se l'iniezione viene condotta nel sistema arterioso. Se si utilizza Matrigel, l'iniezione lenta per evitare la dispersione aiuterà con l'espiantazione della placca per ulteriori esami istologici.

All'interno della placca Matrigel, siamo in grado di misurare la vascolarizzazione contando i capillari all'interno di diversi contesti sperimentali. I risultati della microscopia intravitale possono essere verificati mediante esame istologico. Siamo in grado di trovare monociti rilevati dalla microscopia intravitale all'interno di tutte le sezioni di tessuto.

Se è necessario molto tempo per l'acquisizione delle immagini, la quantità di destrano di rodamina all'interno del vaso diminuisce. Per una migliore visibilità dei vasi, l'applicazione del destrano di rodamina deve essere ripetuta. L'uso di sonde positive per le cellule su Matrigel può aiutare a ottenere impostazioni ottimali.

L'obiettivo delle terapie per l'arteriopatia periferica o cardiopatia ischemica è aumentare il flusso sanguigno in altre aree perfuse causate dalla stenosi emodinamica. La terapia cellulare tramite perfusione potenziata da monociti attraverso la stimolazione della formazione collaterale è un'opzione non invasiva per i pazienti senza indicazioni per la chirurgia. Oltre allo sviluppo delle arterie collaterali nelle aree ischemiche, i monociti possono anche influenzare la crescita dei tumori.

Per studiare questi processi, utilizziamo l'iniezione di Matrigel in connessione con la microscopia intravitale. Il nostro obiettivo con questo protocollo è quello di dimostrare un modo semplice ed efficiente per studiare i processi immunologici causati dall'ischemia in un modello in vivo. Con questo nuovo metodo, siamo in grado di generare un ambiente di test più realistico rispetto al workup istologico del tessuto muscolare post mortem.