Caratterizzazione biochimica e strutturale del carboidrato trasporto substrato-proteina-SP0092

L'obiettivo generale di questa procedura è la caratterizzazione biochimica e strutturale di una proteina legante il substrato di carboidrati da streptococcus pneumoniae. Questo metodo può aiutare a fornire dati chiave per aiutare gli studi didattici sulla proteina legante il substrato, come l'identificazione dei profili di stabilità del tampone, gli stati di oligomerizzazione e le strutture atomiche. Il vantaggio di questa procedura è che fornisce dati che possono aumentare il tasso di successo della cristallizzazione e la soluzione della struttura per le proteine leganti il substrato in modo robusto e semplice.

Innanzitutto, preparare 48 soluzioni tampone con un intervallo di pH compreso tra 4,0 e 9,5 e concentrazioni di cloruro di sodio comprese tra zero e 0,5 molari. Erogare 40 microlitri di ciascuna soluzione in una piastra a 96 pozzetti. Ottenere una soluzione purificata della proteina legante il substrato scelta.

Aggiungere cinque microlitri della soluzione SBP a ciascun pozzetto per una concentrazione di uno o due milligrammi per millilitro. Quindi aggiungere cinque microlitri di un colorante fluorescente 20 volte concentrato in ciascun pozzetto. Miscelare le soluzioni pipettando verso l'alto e verso il basso.

Sigillare la piastra con pellicola adesiva trasparente. Centrifugare la piastra a 112 volte G a temperatura ambiente per due minuti. Configura un sistema PCR in tempo reale per passare da quattro a 99 gradi Celsius a una velocità di tre gradi al minuto con un tempo di attesa di 10 secondi.

Impostare il sistema in modo che esegua letture di fluorescenza ogni mezzo grado. Impostare l'impostazione del filtro a fluorescenza. e assegnare i campioni.

Esegui l'esperimento e identifica la condizione tampone con la temperatura di fusione più alta. Successivamente, preparare un tampone con il pH scelto e la concentrazione di cloruro di sodio che includa il 2,5% in volume di glicerolo e una concentrazione di TCEP di 0,5 millimolari. Caratterizzazione dell'SBP purificato con cromatografia analitica ad esclusione dimensionale con diffusione della luce multi-angolo.

Identificare le specie più stabili adatte alla cristallizzazione e utilizzare il SEC preparatorio per ottenere frazioni pure di tali specie. Eseguire test di pre-cristallizzazione per determinare la concentrazione proteica ottimale per la cristallizzazione. Utilizzare un sistema robotico di cristallizzazione per erogare le soluzioni di cristallizzazione commerciali desiderate nei serbatoi di soluzione di una piastra a goccia ottica a 96 pozzetti.

Quindi utilizzare il sistema per erogare 100 nanolitri della soluzione proteica in ogni pozzetto di goccia di cristallizzazione. Trasferire 100 nanolitri di ciascuna soluzione di cristallizzazione dai pozzetti del serbatoio alle gocce del pozzetto corrispondenti. Sigillare la piastra con pellicola adesiva ottica.

Utilizzare un microscopio o un sistema di imaging automatizzato per valutare la formazione e la crescita dei cristalli ogni uno o due giorni per due settimane e successivamente una volta alla settimana. Quando si sono formati cristalli sufficientemente grandi e ben sagomati, preparare un lotto della soluzione di cristallizzazione con un ulteriore 25% in volume di glicerolo che funga da crioprotettore. Quindi, riempi un dewar di schiuma con azoto liquido.

Immergere un contenitore per campioni unipuck nell'azoto liquido e lasciare raffreddare l'involucro. Quindi ritaglia la pellicola su una goccia contenente un cristallo di interesse. Depositare 0,5 microlitri di crioprotettore su un vetrino di copertura vicino alla goccia o nella camera di rilascio vuota della stessa condizione, se disponibile.

Attacca a una bacchetta magnetica un crioloop montato su una base standard SPINE. Usa il cryoloop per trasferire il cristallo di interesse alla goccia di crioprotettore. Quindi utilizzare il criociclo per trasferire il cristallo dal crioprotettore alla prima posizione vuota dell'involucro del campione di unipuck sommerso.

Ripeti questo processo per raccogliere altri cristalli. Una volta che tutti i cristalli di interesse sono stati caricati nell'involucro del campione, utilizzare la bacchetta del disco per posizionare la piastra di base dell'unipuck sull'involucro. Trasportare l'unipuck in azoto liquido alla linea di luce.

Utilizzare pinze criogeniche e uno strumento di caricamento del dewar del disco per caricare l'unipuck nel dewar dello scambiatore di campioni della linea di luce e per staccare l'involucro del campione. Quindi selezionare il campione nel software della linea di luce da caricare e centrare automaticamente il campione nel fascio di raggi X. Acquisire uno spettro di fluorescenza a raggi X e identificare eventuali elementi che possono essere utilizzati in un esperimento di diffrazione anomala.

Determinare la lunghezza d'onda ottimale per la raccolta di dati di diffrazione anomala eseguendo una scansione dell'energia del bordo di assorbimento dei raggi X. Quindi acquisisci tre modelli di diffrazione dei raggi X a intervalli di 45 gradi in modalità di oscillazione standard per determinare automaticamente i parametri della cella dell'unità cristallina, la simmetria e il limite di diffrazione. Importare i parametri di raccolta dati consigliati nel software della linea di luce ed eseguire un esperimento di diffrazione anomala a lunghezza d'onda singola o multipla, a seconda dei casi.

La stabilità della proteina legante il substrato SP0092 in vari tamponi salini è stata valutata per identificare la soluzione tampone ottimale. Le temperature di fusione più elevate sono state riscontrate per tamponi con un pH di 6,5 e concentrazioni di cloruro di sodio comprese tra zero e 0,2 molari. Per la procedura è stato selezionato un tampone con un pH di 6,5 e una concentrazione di cloruro di sodio di 0,2 molari.

I vari stati di oligomerizzazione di SP0092 sono stati identificati e separati con SEC-MALS. Un'analisi del profilo SEC a diverse concentrazioni proteiche ha indicato che l'aumento della concentrazione proteica innesca l'oligomerizzazione, suggerendo che gli oligomeri più grandi sono più stabili ad alte concentrazioni. Coerentemente con ciò, i grandi oligomeri hanno prodotto cristalli nelle prove di cristallizzazione, mentre il monomero no.

fluorescenza a raggi X di cristalli SP0092 nativi e marcati con selenometionina ha indicato che lo zinco si lega alla proteina in entrambe le forme. Il segnale anomalo è stato massimizzato sintonizzando la lunghezza d'onda dei raggi X incidente sui bordi di assorbimento dei raggi X dello zinco o del selenio. È stato quindi ottenuto un set di dati anomalo completo e l'analisi automatizzata innescata dalla presenza di un segnale anomalo ha generato mappe iniziali delle strutture proteiche.

I modelli integrati in queste mappe iniziali sono stati poi perfezionati e convalidati per produrre i modelli finali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come completare una caratterizzazione strutturale completa di una proteina legante il substrato o di qualsiasi potenziale bersaglio proteico. Le implicazioni di questa tecnica si estendono allo sviluppo di nuove terapie per la malattia mirococcale, in quanto fornisce informazioni fondamentali per la progettazione basata sulla struttura di inibitori per questa classe di proteine.

Questi metodi possono essere applicati anche alle proteine leganti il substrato di altri organismi e potenzialmente possono essere utilizzati per qualsiasi tipo di proteina.