Name: Imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando Thy1-topi transgenici GCaMP6s (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Scopri l'imaging del calcio in vivo nella corteccia somatosensoriale primaria di topi transgenici Thy1-GCaMP6s utilizzando finestre ottiche bilaterali e microscopia a due fotoni. Questo metodo consente registrazioni prolungate dell'attività neuronale.

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Siamo molto grati a Wenbiao Gan (Skirball Institute, dipartimento di fisiologia e neuroscienze, New York University School of Medicine, USA) per indicazioni tecniche eccellenti e Patti Raley, Medical Editor (dipartimento di neurochirurgia, Indiana University School of Medicine), per il manoscritto di editing. Ringraziamo il Dr. Jinhui Chen (Istituto di ricerca neuroscienze Stark, Indiana University School of Medicine, USA) per la fornitura di B6. Topi di HJrs/J CG-Tg (Thy1- YFP). Questo lavoro è stato supportato in parte dalla Fondazione del direttore dell'ospedale generale di Jinan regione militare di Chines PLA 2016ZD03 (XJL) e NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562, merito recensione premio I01 BX002356 dal dipartimento dei veterani degli Stati Uniti Affari, Craig H Neilsen Foundation 296749, Indiana del midollo spinale e cervello lesioni Research Foundation, Mari Hulman George fondi di dotazione (XMX).

Tutte le procedure di gestione degli animali e chirurgica sono state effettuate come approvato sotto la guida per la cura e uso di animali da laboratorio (Consiglio nazionale delle ricerche) e gli orientamenti della Indiana University School di medicina istituzionali cura degli animali e dell'uso Comitato. Illustrazione schematica del setup imaging 2-fotone è illustrato nella Figura 1.
1. preparare l'animale per l'Imaging
<ol><li>Posizionare la garza sterile, tamponi di cotone e strumenti chirurgici sterilizzati nell'autoclave nell'area di chirurgia (tabella 1). Accendere un Micro Bead sterilizzatore per intersurgery sterilizzazione degli strumenti chirurgici.</li>
	<li>Anestetizzare il mouse (maschio o femmina, 1,5-2,5 mesi, 20 – 25 g) tramite l'iniezione intraperitoneale (i.p.) di una miscela di ketamina (17,2 mg/mL), xilazina (0,475 mg/mL) e acepromazina (0,238 mg/mL) (peso corporeo di 6 µ l/g). Attendere che la corretta profondità di anestesia è raggiunto quando l'animale cessa di rispondere ad uno stimolo di pizzico di punta e non ha nessun riflesso corneale. Durante l'intervento chirurgico, dare una dose di richiamo di 1/3 della dose originale dell'anestetico cocktail come necessario per mantenere lo stato originale di anestetico.</li>
	<li>Iniettare la buprenorfina per via sottocutanea (s.c.; 0.05-0.10 mg/kg) come agente analgesico prima della chirurgia. Applicare unguento protettivo per gli occhi dell'animale per evitare la formazione di cataratta e di essiccazione cornea.</li>
	<li>Posizionare un topo transgenico GCaMP6s su un rilievo di riscaldamento per prevenire l'ipotermia e coprirlo con un telo chirurgico sterile. Stabilizzare la testa dell'animale con un adattatore di Holding di testa per i topi.</li>
	<li>Radersi la testa sopra la maggior parte del cuoio capelluto con una lama di rasoio doppio taglio. Pulire l'area chirurgica con un tampone di alcool sterile preparazione seguito da soluzione povidone-iodio.</li>
</ol>2. cronica cranica finestra preparazione
<ol><li>Fare un taglio rettangolare del cuoio capelluto (2 x 3 mm) con un paio di forbici su un lato (a destra) del cranio. Spingere la pelle da parte con un batuffolo di cotone per creare un'area di esposizione di > 3 mm di diametro (Figura 3A). Rimuovere il tessuto connettivo attaccato al cranio raschiando delicatamente il cranio con una lama smussata microsurgical (bisturi lama n. 10; Figura 3).</li>
	<li>Delimitare la zona S1 delicatamente disegnando un cerchio (3 mm di diametro, centro coordinamento:-1,50 mm dal bregma e 2,5 mm dalla linea mediana) sul cranio usando uno studio dentistico trapano (Figura 2B).</li>
	<li>Eseguire la stessa procedura sul cranio sinistro (Figura 2B).</li>
	<li>Applicare un sottile strato di colla del cianoacrilato Super fino all'osso per fornire una base per applicazione di cemento dentale.</li>
	<li>Sotto un microscopio per dissezione, sottile giù una scanalatura circolare nel cranio intorno alla zona S1 utilizzando un microdrill ad alta velocità (Figura 3D). Lo scopo è quello di creare un bordo liscio per il posizionamento della finestra ottica su di esso.</li>
	<li>Applicare ripetutamente cerebrospinale artificiale (ACSF, temperatura ambiente) al cranio periodicamente durante il processo di diradamento per facilitare la foratura e dissipare il calore. Eseguire la foratura a intermittenza per evitare il surriscaldamento indotto da attrito. Succhiare via i detriti dell'osso con una linea del vuoto di casa o una pompa a vuoto.</li>
	<li>Dopo circa 2/3 di profondità dell'osso è forata, lentamente e con attenzione sottile osso restante 1/3 fino a quando un pezzo circolare del cranio (lembo osseo) è completamente esente da cranio circostante.</li>
	<li>Lentamente e con attenzione rimuovere il lembo osseo circolare con un paio di n. 5/45 forcipe ed esporre la dura madre (Figura 2; Figura 3E).</li>
	<li>La regione del cervello esposto. mantenere umido con ACSF (Figura 3E). Evitare danni ai vasi sanguigni pial, poiché l'emorragia sarà alterare il flusso sanguigno cerebrale, accelerare il gonfiamento del cervello e severamente degradare la qualità delle immagini.</li>
	<li>Eseguire la stessa procedura sul lato sinistro (controlaterale) del cranio.</li>
	<li>Per il montaggio la finestra ottica, uso ottico adesivo colla e cura tra coprioggetto strati uno alla volta. Se necessario, riscaldare la finestra ottica (50 ° C per 12 h) in un'incubatrice per migliorare l'incollaggio. La finestra ottica contiene 2 porzioni: la parte superiore contiene un singolo vetro coperchio rotondo con un diametro di 5 mm e la parte inferiore contiene 1 – 3 vetri di coperchio rotondi con un diametro di 3 mm (Figura 2D).</li>
	<li>Memorizzare la finestra ottica in etanolo (70%, vol/vol) e sciacquarlo con soluzione salina sterile prima dell'uso. Prima dell'installazione di finestra ottica, controllare la finestra ottica per imperfezioni, tra cui una non corretta quantità di adesivo o imprecise allineate sotto uno stereoscopio.</li>
	<li>Installare la finestra ottica sopra la regione di craniotomia (Figura 2D). La parte superiore della finestra ottica poggia sul cranio e la parte inferiore della finestra ottica si inserisce all'interno dell'apertura craniotomized e poggia su dura in presenza di CSF (Figura 2D, E).</li>
	<li>Sigillare la parte superiore del bordo finestra ottica al cranio con la colla Super cianoacrilato (Figura 2F; Figura 3F).</li>
	<li>Quando il cianoacrilato Super colla si è asciugata, applicare il cemento dentale nero (Dentsply) per coprire il bordo di vetro. Applicare il cemento dentale per tutte le esposte del cranio e della ferita di margini di bloccare la luce (Figura 2-H; Figura 3B).</li>
	<li>Eseguire la stessa procedura sul lato sinistro.</li>
	<li>Permettere all'animale di recuperare il termoforo e tornare l'animale alla sua gabbia a casa per il recupero sotto adeguata sorveglianza. Fornire cibo umido per facilitare la masticazione e idratazione. Per ridurre il dolore, amministrare buprenorfina s.c. (0.05 – 2,0 mg/kg) ogni postinjury di 8 – 12 h per 2 giorni. Consentire il mouse per recuperare per altri 7-10 giorni prima di formazione immagine.</li>
</ol>3. due-fotone imaging
<ol><li>Il giorno dell'esperimento, anestetizzare l'animale con ketamina e xilazina (dosi e mantenimento dell'anestesia come descritto sopra). Pulire la finestra cranica con etanolo al 75% (vol/vol).</li>
	<li>Posizionare il mouse sotto un imaging set-up che consiste di un microscopio di P 2 e l'adattatore di testa Holding, che riposa su un rilievo di riscaldamento con la sua testa immobilizzata attraverso le sbarre di orecchio attaccati a un titolare di testa del mouse.</li>
	<li>Un lato della finestra ottica dell'immagine alla volta. Per minimizzare le aberrazioni ottiche, assicurarsi che la finestra ottica e cranio giusto sono orientati perpendicolarmente all'asse ottico del microscopio.</li>
	<li>Prendere un'immagine iniziale della finestra cranica con illuminazione in campo chiaro con un ingrandimento 4x come una mappa di riferimento per la registrazione con angiografie di maggiore ingrandimento 2P (Figura 4A1).</li>
	<li>Ingrandire l'area di interesse utilizzando ingrandimento 10x (Figura 4A2).</li>
	<li>Selezionare un'area di interesse in zona S1 in strati corticali I o II (fino a 150 µm sotto la superficie pial). Se si desidera maggiore ingrandimento, utilizzare un obiettivo X 20.</li>
	<li>Ricerca di un campo di vista con più neuroni. Acquisire immagini utilizzando un microscopio di 2P (Figura 4B). Determinare il tempo di esposizione e livello luce di eccitazione (≈910 nm) basato sulla profondità e livello di espressione di GCaMP6s, con i segnali più deboli che richiedono tempi di esposizione più lunghi e concordemente meno risoluzione temporale. Generalmente utilizziamo ~ 4 µs per tempi di esposizione di pixel. Acquisire immagini a frame rate di 3 – 5 Hz con una risoluzione di 512 × 512 pixel.</li>
	<li>Iniziare a registrare la serie temporale. Memorizzare le coordinate di ogni regione di interesse (ROI) relativo il pattern vascolare o ai punti fiduciali in immagini di ingrandimento basso. Immagine il ROI stesso nel tempo. Eseguire la stessa procedura per osservare la dinamica del calcio della zona S1 sull'emisfero sinistro. Calcolare le modifiche in fluorescenza da ogni ROI.</li>
	<li>Acquisire le immagini singolarmente o in un filmato time-lapse (Figura 41-C3, D, E).</li>
	<li>Studio corticale sangue flusso dynamics in vivo da imaging coloranti fluorescenti destrano iniettati nella vena della coda dei roditori con microscopia di 2P. Utilizzare vasculatures come punti di riferimento per riconoscere e immagine la stessa ROI in sessioni di formazione immagine per lunghi periodi.</li>
</ol>4. elaborazione dei dati
<ol><li>Utilizzare ImageJ e origine per analisi di immagine. Importare sequenze di immagini con ImageJ (Figura 5A-B). Per immagini singole (o t-serie film), selezionare un ROI all'interno di un neurone imaged e 2 separati nelle vicinanze di regioni per la misura di sfondo (Figura 5). Acquisire totale intensità con un manager di ROI (Figura 5C). Nota: La figura 6 Mostra immagini rappresentative del calcio. Transitori di calcio (verde) e dei vasi sanguigni (rosso) mostrano in diversi momenti in secondi (Figura 6A-D) in un mouse alla 7D dopo l'installazione iniziale della finestra. Viene mostrata anche la z-proiezione di un periodo di registrazione di 3 min per canali rosso e verde (Figura 6E) o canale verde (Figura 6F). Una z-proiezione consente di visualizzare un'immagine compressa di tutte le immagini del film da cui un contorno grezzo e cerchio (che comprende il neurone oggetto di interesse in tutti i frame) è selezionato manualmente così come la selezione di 2 indipendente nelle vicinanze di regioni di sfondo ( Figura 6).</li>
	<li>Da ogni ROI, calcolare lo sfondo di fluorescenza media FB, FB = (FB1 + FB2) / 2 e le modifiche di fluorescenza del soma (F) espressa come ΔF/F, ΔF/F = (F-FB) / FB.</li>
	<li>Eseguire l'analisi di picco passo dopo passo utilizzando funzioni di ImageJ tra cui correzione della linea di base, picco individuazione/determinazione, integrazione di picco, picco raccordo o rubriche picco funzioni di analisi.</li>
</ol>

<ol><li>Cichon, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branch-specific+dendritic+Ca%282%2B%29+spikes+cause+persistent+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Branch-specific dendritic Ca(2+) spikes cause persistent synaptic plasticity.</a> Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).</li>
<li>Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Roumis, D. K., Glickfeld, L. L., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specialization+of+mouse+higher+visual+cortical+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Functional specialization of mouse higher visual cortical areas.</a> Neuron. 72 (6), 1025-1039 (2011).</li>
<li>Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+mapping+of+single+spines+in+cortical+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo.</a> Nature. 475 (7357), 501-505 (2011).</li>
<li>Mittmann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nat Neurosci. 14 (8), 1089-1093 (2011).</li>
<li>Katona, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+two-photon+in+vivo+imaging+with+three-dimensional+random-access+scanning+in+large+tissue+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes.</a> Nat Methods. 9 (2), 201-208 (2012).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+the+Dendritic+Spines+in+the+Hindlimb+Representation+of+the+Sensory+Cortex+after+Spinal+Cord+Hemisection+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Remodeling the Dendritic Spines in the Hindlimb Representation of the Sensory Cortex after Spinal Cord Hemisection in Mice.</a> PLoS One. 10 (7), e0132077(2015).</li>
<li>Keck, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+scaling+and+homeostatic+plasticity+in+the+mouse+visual+cortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic scaling and homeostatic plasticity in the mouse visual cortex in vivo.</a> Neuron. 80 (2), 327-334 (2013).</li>
<li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miniature+head-mounted+two-photon+microscope.+high-resolution+brain+imaging+in+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brain imaging in freely moving animals.</a> Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).</li>
<li>Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+resolution+functional+imaging+in+behaving+rats+using+voluntary+head+restraint%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cellular resolution functional imaging in behaving rats using voluntary head restraint.</a> Neuron. 80 (2), 371-384 (2013).</li>
<li>Luongo, F. J., Horn, M. E., Sohal, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+Microcircuit-Level+Substrates+for+Attention+Are+Disrupted+in+Mouse+Models+of+Autism%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Putative Microcircuit-Level Substrates for Attention Are Disrupted in Mouse Models of Autism.</a> Biol Psychiatry. 79 (8), 667-675 (2016).</li>
<li>Wachowiak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+dissection+of+odor+information+processing+in+vivo+using+GCaMPs+expressed+in+specified+cell+types+of+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical dissection of odor information processing in vivo using GCaMPs expressed in specified cell types of the olfactory bulb.</a> J Neurosci. 33 (12), 5285-5300 (2013).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).</li>
<li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nat Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Due-fotone imaging consente la misura simultanea dell'attività di molte cellule ad una risoluzione ragionevole alle fino a circa 800 µm sotto la superficie del cervello. Abbiamo integrato 2P e una tecnica di doppia finestra ottica con codificato geneticamente GCaMP6s per osservare la dinamica del calcio nelle popolazioni di somata neuronali strato V trova > 500 µm di sotto della pia. Con la finestra ottica aperta su ogni lato del cranio, il metodo consente registrazioni di attività neurale tra le regioni del cervello dei mammiferi simmetrica per prolungata e stabile del calcio imaging in vivo. Le prestazioni di chirurgia mini-invasiva per creare finestre ottiche dual cranio aperto e imaging 2P dell'attività neuronale in simmetriche S1 regioni sono aspetti fondamentali di questo metodo.
Esaminando l'attività di rete in regioni bilaterali S1 è che un esempio di come dual windows cranica potrebbe essere usato per sondare elaborazione nel cervello adulto in vivodell'informazione locale e simmetriche. Questo metodo può essere utilizzato anche per studiare l'attività neuronale (ad es. utilizzando Thy1 -GCaMP6s topi) e la plasticità corticale B6. CG-Tg (Thy1- YFP) HJrs/J da tessuto intatto delle corrispondenti regioni simmetriche in recupero dopo deafferentazione a causa di un infortunio di CNS unilaterale. Il metodo è utilizzabile anche per esaminare l'attività corticale in risposta alle strategie di stimolo periferico come optogenetica, stimolazioni elettriche o chimiche. Anche se abbiamo solo dimostrare la tecnica in zona S1, questo approccio potrebbe essere impiegato per indagare sulle attività in altre zone simmetriche del cervello vivente come i neuroni di strato V della corteccia motoria primaria (M1). Osservazioni sulla riorganizzazione delle regioni del cervello possono fornire un substrato neurale per comportamento adattivo di un motore, che svolge un ruolo critico nella postinjury recupero della funzione. Permette anche di misurazione cronica dell'attività simmetrica delle cellule geneticamente identificate durante il comportamento nei topi di testa-fisso.
Tecnicamente, gli investigatori devono prestare particolare attenzione alla qualità e alla consistenza di dual windows cranica. Assottigliato-cranio cranio finestra tecnica 12 è altamente consigliato per i principianti alla pratica. Le spine sono compartimenti di calcio a causa della loro morfologia e meccanismi locali di afflusso ed estrusione. In questo studio, abbiamo usato B6. Topi di HJrs/J CG-Tg (Thy1- YFP) come un esempio per dimostrare spine dendritiche dynamics in vivo (Figura 4). Un'installazione di finestra aperta-teschio di vetro può causare spina dorsale alto fatturato e risposte gliali reattive dopo chirurgia 12. Al contrario, con la tecnica del cranio assottigliato finestra spine e dendriti possono essere ben conservati.
Scelte di dimensioni e spessori di finestre ottiche sarà dipendono il campo di vista desiderata, la curvatura del teschio, cranio spessore e il tipo di formazione immagine 13. Insufficiente pressione dei vetrini ottico su dura può causare ispessimento del dura, ricrescita del cranio e aumentato il movimento del cervello. Al contrario, una pressione eccessiva dei vetrini ottico può ostacolare il flusso sanguigno corticale.
Per il montaggio di finestra ottica, colla e curare ulteriori strati di vetrini uno alla volta con adesivo ottico e luce UV di lunghezza d'onda. Per contribuire a rafforzare il legame adesivo, calda finestra fabbricata (50 ° C per 12 h) in un'incubatrice. Conservare il coprioggetto finestra ottica in etanolo al 70% (vol/vol) e, prima della chirurgia, sciacquarlo con soluzione salina sterile. La finestra ottica deve essere esaminato per imperfezioni (ad esempio, un importo non corretto di allineamento ottico di adesivo o imprecisa) sotto uno stereoscopio prima dell'uso per evitare il fallimento. Se l'adesivo ottico è troppo sottile, gli spazi d'aria può essere piegati, che può causare aberrazioni ottiche o distacco di vetro di copertura presso l'impianto. Al contrario, troppo adesivo ottico può causare overflow oltre i bordi della finestra cranica.
In breve, qui descriviamo una procedura sperimentale per la misurazione dinamica del calcio o morfologia dentritica attraverso windows cranica dalle regioni corticali somatosensoriali primarie simmetriche 2 in Thy1-GCaMP6s e Thy1topi transgenici - YFP, rispettivamente, usando la microscopia 2P. Questa tecnica può facilitare notevolmente il complesso rapporto strutturale e funzionale delle reti neurali di dissezione.

Calcio e dal suo regolamento sono essenziali nella mediazione di molteplici processi fisiologici. Dinamica del calcio di monitoraggio è utile per comprendere la funzione normale del cervello come pure stati patologici del cervello disturbi 1,2,3,4,5,6 ,7,8. Formazione immagine di fluorescenza di GCaMP6s è un potente strumento per quantificare i numeri di spike, tempismo, e frequenza, come pure i livelli di sinaptica in ingresso sia in vitro che in vivo 9,10,11.
Il cervello dei mammiferi esibisce simmetria contrassegnato lungo il piano sagittale. Anche se recenti ricerche neurologiche ha fatto luce sul rimodellamento corticale e attività neuronale innescati traumatica del cervello o del midollo spinale lesioni 6,7, i ruoli che il tessuto intatto di simmetricamente regioni corrispondenti giocare nel recupero sono ancora oscuri.
In questo studio, descriviamo le procedure sperimentali per la creazione di finestre ottiche simmetriche bilaterali per l'imaging in vivo . Utilizzando queste finestre ottiche, descriviamo la misurazione della dinamica del calcio da corteccia somatosensoriale primaria (S1) in topi transgenici GCaMP6s usando la microscopia 2P. Nella sezione risultati, vi mostriamo anche in vivo morfologia dentritica in diversi momenti della regione S1 nei topi transgenici EGFP usando la formazione immagine 2P. Il metodo di osservazione per quanto riguarda le dinamiche di rete nelle aree S1 bilaterale è ma un esempio iniziale di windows cranica aperta come dual aiuterà neuroscienziati per sondare elaborazione nel cervello dei mammiferi adulto in normale dell'informazione locale e simmetriche condizioni o nella malattia di diversa modelli in vivo.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J</td><td>Jackson</td><td>24275</td><td>Può essere qualsiasi ceppo prodotto dall'indicatore neuronale geneticamente codificato e dall'effettore che esprime l'indicatore di calcio fluorescente verde, GCaMP, in sottogruppi di neuroni eccitatori nella corteccia.</td></tr><tr><td>B6. Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ.</td><td>Jackson</td><td>7919</td><td>Può essere qualsiasi ceppo che esprime EGFP in sottogruppi di neuroni all'interno di specifiche popolazioni nella corteccia, fornendo una colorazione luminosa e vitale simile a quella del Golgi.</td></tr><tr><td>Dumont n. 5 pinze, standard, Dumoxel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Può essere di qualsiasi marca di scelta.</td></tr><tr><td>Dumont n. 5SF pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Può essere di qualsiasi marca di scelta.</td></tr><tr><td>Micro Sterilizzatore di perline</td><td>Southern Labware</td><td>B1201</td><td>Può essere di qualsiasi marca di scelta.</td></tr><tr><td>Harishige' s SG-4N Adattatore per il supporto della testa</td><td>Tritech Research</td><td>SG-4N</td><td>Può essere di qualsiasi marca a scelta.</td></tr><tr><td>Kit completo Ideal Micro-Drill</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-6065</td><td>Può essere di qualsiasi marca a scelta.</td></tr><tr><td>Frese per Micro Drill</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td>Può essere di qualsiasi marca di scelta.</td></tr><tr><td>Vetro di copertura rotondo, 3 mm</td><td>Harvard Biosciences</td><td>W4 64-0720</td><td>Può essere di qualsiasi marca a scelta.</td></tr><tr><td>Vetro di copertura rotondo, 5 mm</td><td>Harvard Biosciences</td><td>W4 64-0700</td><td>Può essere di qualsiasi marca a scelta.</td></tr><tr><td>Norland adesivo ottico</td><td>Norland Products</td><td>7106</td><td>Può essere qualsiasi marca di scelta.</td></tr><tr><td>Loctite super colla liquida</td><td>WB Mason</td><td>LOC1647358</td><td>Può essere qualsiasi marca di scelta.</td></tr><tr><td>Kit di cemento antiscivolo, polvere e solvente</td><td>Dentsply</td><td>675570</td><td>Può essere di qualsiasi marca a scelta. Mescola 5 parti di polvere di cemento dentale bianco (Grip Cement) con una parte di vernice in polvere di tempera nera (per proteggere dalla luce; alcuni utenti preferiscono un rapporto 10:1).</td></tr><tr><td>Schiuma gel</td><td>Moore Medical</td><td>2928</td><td>Può essere qualsiasi marca di scelta.</td></tr><tr><td>Forbici per micro dissezione</td><td>Roboz</td><td>RS-5841</td><td>Può essere di qualsiasi marca a scelta.</td></tr><tr><td>Liquido cerebrospinale artificiale (ASF)</td> <td>-</td><td></td> <td>L'ACSF contiene 125 mM di NaCl, 4,5 mM di KCl, 26 mM di NaHCO3, 1,25 mM di NaH2PO4, 2 mM di CaCl2, 1 mM di MgCl2 e 20 mM di glucosio. Bollare l'ACSF con ossigeno (95% di ossigeno, 5% di anidride carbonica) e regolare il pH a 7,4. Preparare una soluzione ACSF fresca prima di ogni esperimento.</td></tr></tbody></table>

imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando thy1-topi transgenici gcamp6s

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Il cervello dei mammiferi esibisce simmetria contrassegnato lungo il piano sagittale. Tuttavia, la descrizione dettagliata delle dinamiche neurali nelle regioni simmetriche del cervello negli animali mammiferi adulti rimane evasiva. In questo studio, descriviamo una procedura sperimentale per la misurazione dinamica del calcio attraverso finestre ottiche dual sopra bilaterale corticies somatosensoriale primaria (S1) in Thy1-topi transgenici GCaMP6s usando la microscopia (2P) 2-fotone. Questo metodo consente registrazioni e quantificazioni dell'attività neurale in regioni del cervello del mouse bilaterale uno alla volta nello stesso esperimento per un prolungato periodo in vivo. I principali aspetti di questo metodo, che può essere completato entro un'ora, includono procedure di chirurgia mini-invasiva per la creazione di finestre ottiche dual e l'uso di formazione immagine 2P. Anche se abbiamo solo dimostrare la tecnica in zona S1, il metodo può essere applicato ad altre regioni del cervello vivente facilitando la delucidazione di complessità strutturale e funzionale delle reti neurali del cervello.

Utilizzando la finestra ottica bilaterale, abbiamo ottenuto risultati da 2 esperimenti separati. Il primo esperimento impiegato topi che esprimono EGFP per varicosità dendritiche immagine. Figura 4 1-3 Mostra alcuni esempi di immagini acquisite in diversi momenti dopo l'impianto finestra ottica. Si noti che il numero e la posizione dei rami dentritici e spine sono notevolmente stabili tra le 2 visite (Figura 4, E, z-proiezione).
Il secondo esperimento impiegato Thy1 -GCaMP6s di topi transgenici per misurare il calcio intracellulare transitorio, illustrando così come la fisiologia del calcio può essere misurata all'interno di un singolo neurone in vivo (Figura 6). Questa tecnica può essere utilizzata per registrare e quantificare l'attività spontanea in popolazioni di neuroni piramidali strato V situati a come profondo come &gt; 500 µm di sotto della pia. Risposte medie spontanee nel corso del tempo (calcolato come la media risposte in ogni momento) possono essere calcolate in numerosi studi clinici. La tecnica di 2P ha il vantaggio di rilevare attività simultaneamente in popolazioni neuronali grande o disperse su un periodo esteso con piccola dispersione meccanica al cervello rispetto alle registrazioni multielettrodo.
Per generare una misura media accettabile, 5 – 10 prove sono raccomandate. Il numero di prove sarà dipendono le risposte spontanee o variabilità intrinseca delle risposte ad uno stimolo particolare. Se tutti i passaggi sono seguiti rigorosamente, come descritto in precedenza, un ricercatore addestrato in sia tecnica finestra cranica assottigliato-cranio e in vivo imaging calcio 2 P dovrebbe essere in grado di ottenere registrazioni di 100 – 200 neuroni su entrambi i lati da 1 – 2 animali al giorno.
Dopo l'analisi di picco, una raccolta di risultati quali la posizione reale di picco, l'ampiezza reale, l'area e la larghezza a metà altezza (FWHM) per ogni picco può essere ottenuta.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig1.jpg"> Figura 1 : Illustrazione schematica dei componenti di una finestra ottica cranica per l'imaging di 2 fotoni (2P). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig2.jpg"> Figura 2 : Disegno schematico Mostra passaggi chiave per la preparazione di una finestra cranica. (A) sotto un microscopio per dissezione, togliere la pelle sopra l'area chirurgica utilizzando un paio di forbici chirurgiche. (B) utilizzare un microdrill ad alta velocità per produrre una scanalatura circolare (diametro 3 mm) sul cranio sopra la zona S1 fino all'osso della falda all'interno della scanalatura si è staccata dall'osso circostante. (C) rimuovere lentamente il lembo osseo per esporre il sottostante dura. (D) montare la finestra ottica con vetrini con 2 diversi diametri. Il coprioggetto superiore ha un diametro maggiore (5 mm) e i vetrini inferiore (di solito 1-3) hanno un diametro più piccolo (3 mm). Lo spessore dei vetrini per essere installato sarà dipendono lo spessore del cranio. (E) posto il coprioggetto sull'apertura circolare del cranio per creare una finestra ottica. La porzione inferiore dei vetrini dovrebbe rientrare nell'apertura cranica. Fondo i vetrini delicatamente dovrebbe contattare la dura madre. (F) sigillo finestra bordi al cranio con colla del cianoacrilato. (G) quando si asciuga il cianoacrilato, applicare cemento dentale nera laterale alla parete di colla. (H) riempire la finestra cranica con ddH2O e utilizzare obiettivi di immersione in acqua per l'imaging. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig3.jpg"> Figura 3 . Creazione di finestre bilaterali sul cranio. (A), A immagine fotografica spettacoli 2 cranica ottici finestre su ogni lato del cranio che ricopre la zona S1. (B) ad alto ingrandimento della regione "in box" dell'immagine (A) mostrare finestre ottici bilaterale esponendo il sottostante dura e vasi sanguigni. Barra della scala = 680 µm. (C) esposte del cranio. (D) creazione di una scanalatura circolare all'interno del quale si vede una falda dell'osso centrale. Barra della scala = 900 µm. (E) dopo la rimozione del lembo osseo, l'apertura cranica è stato riempito con liquido cerebrospinale artificiale (ACSF). Barra della scala = 720 µm. (F) installazione della finestra ottica sopra l'apertura cranica e il bordo della finestra con colla super di tenuta. La dura e vasi sanguigni sono visibili attraverso la finestra ottica. Barra della scala = 600 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig4.jpg"> Figura 4 : Calcio e dendritiche imaging. (A1) Identificare le aree di interesse utilizzando vasi sanguigni (BV) come punti di riferimento in Thy1-GCaMP6s topi. (A2) Identificare le stesse celle con etichettate (frecce rosse) nel tempo utilizzando gli stessi punti di riferimento e record. (B) rappresentante Z-proiezione di segnali di calcio nei neuroni (frecce rosse) della corteccia somatosensoriale primaria (S1). Barra della scala = 10 µm. (C1-3) visualizzazione dei dendriti (verde) e un vaso sanguigno (rosso) in B6. CG-Tg (Thy1- YFP) HJrs/J a diverse profondità nel livello II della regione S1 a 1 giorno dopo l'installazione di finestra ottica. (D) Z-proiezione di immagini multiple alla stessa regione a 1 giorno. (E) Z-proiezione di immagini multiple alla stessa regione a 7 giorni dopo l'installazione di finestra ottica. Notare la notevole stabilità del numero e posizione delle spine adulti e rami dentritici tra 1 giorno e 7 giorni dopo l'installazione di finestra ottica. Barra della scala = C-E 5 µm (C-E). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig5.jpg"> Figura 5 : L'analisi del segnale calcio. (A, B) Esempi di filmati importati t-serie con ImageJ per analisi di dati di 2 neuroni (neurone 1 e 2, rispettivamente). Foglio di calcolo (C), A Mostra i dati sull'intensità di illuminazione dalla regione di interesse (ROI; all'interno del neurone e 2 distinte regioni vicine come misure di sottofondo). (D) calcolo del picco: ΔF/F = (F-FB) / FB, FB = (FB1 + FB2) / 2 (lo sfondo di fluorescenza media [FB] e le modifiche di fluorescenza del soma [F] espresso come ΔF/F). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig6.jpg"> Figura 6 . Immagini rappresentative del calcio. (A-D) Vasi sanguigni (rossi) a diversi tempi in secondi in un mouse a 7 giorni dopo l'installazione di finestra ottica e calcio transienti (verde). Freccia gialla: un neurone relativamente meno attivo. Freccia bianca: un neurone chiodando. (E, F) Z-proiezione di un periodo di registrazione di 3 min per il verde (calcio) canali (E) e rosso (vasi sanguigni) e il solo canale verde (F). (G) selezionati sono contrassegnati i neuroni e le loro aree di sfondo adiacente. Barra della scala = 10 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Descriviamo una procedura sperimentale per la misura di attività neuronale attraverso finestre ottiche dual sopra bilaterale corticies somatosensoriale primaria (S1) in Thy1-GCaMP6s topi transgenici utilizzando 2 fotoni (2P) microscopia in vivo.

Imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando Thy1-topi transgenici GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Questo metodo consente la registrazione e la quantificazione dell'attività neurale attraverso le regioni corticali bilaterali del topo per un periodo prolungato in vivo. La tecnica dei due fotoni ha il vantaggio di rilevare l'attività simultaneamente in una popolazione neuronale grande o dispersa per un lungo periodo. Le implicazioni di questa tecnica si estendevano verso lo studio dei modelli di attività in popolazioni neuronali definite in diverse regioni del cervello vivente.12 ore prima di iniziare la procedura, riscaldare le finestre ottiche a 50 gradi Celsius in 70%etanolo. Una finestra ottica è costituita da un vetro di copertura superiore rotondo di cinque millimetri di diametro e una porzione inferiore contenente un vetro di copertura rotondo di tre millimetri di diametro. Alla fine dell'incubazione riscaldante, confermare una mancanza di risposta al dito del dito su un topo Thy1 GCaMP6s anestetizzato da 20 a 25 grammi da 1 1/2 a 2 1/2 mese e applicare un unguento agli occhi dell'animale.Posizionare il mouse su un tappetino riscaldante coperto da un drappo sterile e utilizzare un adattatore per la tenuta della testa per i topi per stabilizzare la testa. Radere la maggior parte del cuoio capelluto con un rasoio a doppio bordo e pulire la pelle esposta con tamponi sequenziali sterili per la preparazione dell'alcol e scrub per soluzioni di povidone-iodio. Quindi usa un paio di forbici per fare un taglio rettangolare di due per tre millimetri nel cuoio capelluto sul lato destro del cranio.Utilizzando un batuffolo di cotone, spingere la pelle da parte per creare un'area di esposizione di diametro superiore a tre millimetri e utilizzare una lama microchirurgica smussata per rimuovere delicatamente il tessuto connettivo attaccato al cranio. Con un trapano dentale, contrassegnare delicatamente un cerchio di tre millimetri di diametro intorno all'area S1. Dopo aver fatto un cerchio simile sul lato sinistro del cranio, applicare un sottile strato di supercolla cianoacrilato su entrambi i lati dell'osso per fornire una base per un'applicazione di cemento dentale.Al microscopio sezionato, utilizzare un micro trapano ad alta velocità per assottigliare una scanalatura circolare sul lato destro del cranio intorno all'area S1 per creare un bordo liscio, aspirando i detriti ossei con un vuoto se necessario. Dopo aver raggiunto una profondità ossea di circa 2/3, assottigliare lentamente e con cura il restante 1/3 di osso fino a quando un lembo osseo circolare non è stato completamente liberato dal cranio circostante. Utilizzare un paio di pini 5/45 per rimuovere lentamente e con cura il pezzo circolare di osso per esporre la dura, facendo attenzione a evitare di danneggiare i vasi piali.Dopo aver rimosso un lembo osseo dal lato sinistro del cranio nello stesso modo, sciacquare la finestra ottica per il lato destro del cranio con soluzione salina sterile e verificare la presenza di imperfezioni sotto un microscopio stereo. Installare la finestra ottica sulla regione craniotomica con la parte superiore della finestra appoggiata sul cranio e la parte inferiore all'interno dell'apertura craniotomizzata, appoggiata sulla dura, in presenza di liquido spinale cerebrale. Utilizzare la supercolla cianoacrilato per sigillare la parte superiore del bordo ottico della finestra al cranio.Quando la colla si è asciugata, applicare il cemento dentale nero sul bordo del vetro, sul resto del lato destro del cranio esposto e sui margini della ferita per bloccare la luce. Quindi installare la finestra ottica sinistra e consentire all'animale di riprendersi con il monitoraggio fino alla piena rimortiquenza. Da sette a 10 giorni dopo la procedura, posizionare l'animale anestetizzato nell'adattatore per la tenuta della testa su una pastiglia riscaldante al microscopio a due fotoni, facendo attenzione che la finestra ottica e il lato destro del cranio siano orientati perpendicolarmente all'asse ottico del microscopio.Acquisire un'immagine iniziale della mappa di riferimento della finestra cranici utilizzando l'illuminazione a campo luminoso al quattro volte l'ingrandimento. Dopo aver acquisito più immagini della stessa regione di interesse, immaginiamo la dinamica del calcio all'interno dell'area S1 nell'emisfero sinistro e calcola i cambiamenti nella fluorescenza da ogni regione di interesse su entrambi i lati del cranio. In queste immagini rappresentative, i dendriti e un vaso sanguigno all'interno di un topo che esprime EGFP sono stati visualizzati a diverse profondità nello strato due della regione S1 un giorno dopo l'installazione della finestra ottica.Le immagini della proiezione Z sono state catturate nei giorni uno e sette dopo l'impianto della finestra ottica, illustrando un numero notevolmente stabile e la posizione di rami dendritici e spine nel periodo sperimentale. La misurazione del transitore intracellulare di calcio nei topi transgenici Thy1 GCaMP6s consente la quantificazione dell'attività spontanea del calcio e delle popolazioni di neuroni piramidali di livello cinque situati profondi fino a 500 micrometri sotto la pia, nonché il calcolo del numero medio di risposte spontanee nel tempo. Un ricercatore addestrato sia nella preparazione della finestra cranica che nelle tecniche in vivo di imaging del calcio a due fotoni dovrebbe essere in grado di ottenere registrazioni di 100-200 neuroni su entrambi i lati del cranio in uno o due animali al giorno.Con una finestra ottica aperta su ciascun lato del cranio, il metodo consente la registrazione dell'attività neurale attraverso le regioni simmetriche del cervello dei mammiferi per l'imaging di calcio prolungato e stabile in vivo. Questo metodo può anche essere utilizzato per studiare l'attività corticale e la plasticità dopo lesioni unilaterali al sistema nervoso periferico o centrale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come installare finestre cranici bilaterali per misurare la dinamica del calcio usando il microscopio a due fotoni nei topi transgenici Thy1 GCaMP6s.

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Questo video dimostra la registrazione dell'attività neurale del cervello attraverso una finestra ottica nei topi transgenici. I topi esprimono una proteina fluorescente che consente il rilevamento delle attività neurali. Una piccola parte del cranio viene accuratamente rimossa per installare una finestra ottica e il cranio viene quindi coperto con cemento nero per bloccare la luce prima dell'imaging.

Installazione di finestre ottiche nel cervello di topi transgenici per l'imaging delle attività neurali

Fonte: Maruoka, H., et. al. Imaging simultaneo della dinamica microgliale e dell'attività neuronale in topi svegli. J. Vis. Exp. (2022) Questo video mostra una procedura di microscopia a due fotoni per l'imaging dell'attività neuronale e della dinamica microgliale in un topo sveglio durante la stimolazione visiva, evidenziando i transitori del calcio e le interazioni cellulari.

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