Valutazione degli effetti di composti sullo sviluppo della funzione di vertebrati rete neurale utilizzando array di multi-elettrodi sistema endocrino

L'obiettivo generale di questo protocollo sperimentale è quello di testare gli effetti di composti che alterano il sistema endocrino, come i bisfenoli, sull'attività di spiking della rete delle reti neuronali dei vertebrati stabilite su array multi-elettrodi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella neurobiologia dello sviluppo e nella tossicologia ambientale, come il meccanismo d'azione delle tossine ambientali sullo sviluppo dell'attività di rete nel cervello embrionale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ora è possibile studiare gli effetti sui parametri della rete neuronale, come la velocità media di attivazione, il numero totale di picchi e l'ampiezza del picco, nonché la sincronia.

Il nostro studio precedente ha dimostrato che gli EDC influenzano la parola e il comportamento, che è un output diretto delle reti neuronali, e il nostro protocollo ora mira a comprendere l'effetto degli EDC su queste reti. Il giorno della placcatura neuronale, rimuovere una fiala di matrice extracellulare dal congelatore a 20 gradi Celsius negativi, spruzzare con etanolo al 70% e mettere su ghiaccio. Assicurati di scongelare la matrice extracellulare sul ghiaccio.

Non scongelare a temperatura ambiente poiché l'ECM polimerizza oltre gli zero gradi Celsius. Lavorare nella cappa BSL2 per diluire la matrice extracellulare al 25% aggiungendo 300 microlitri di terreno neurobasale freddo all'aliquota da 100 microlitri. Quindi, utilizzare una pipetta P200 per aggiungere 100 microlitri di soluzione di matrice extracellulare al 25% al centro dell'array multi-elettrodo, facendo attenzione a non toccare gli elettrodi.

Rimuovere immediatamente l'ECM lasciando una pellicola sottile sulla superficie. Coprire l'array multi-elettrodo e posizionarlo nell'incubatore di coltura tissutale fino al momento di placcare i neuroni. Inizia l'isolamento dei neuroni di pollo sterilizzando il guscio esterno di un uovo E7 con etanolo al 70%.

È importante mantenere condizioni sterili da questo punto in poi. Assicurarsi che tutti gli strumenti siano sterilizzati con etanolo al 70% e che le soluzioni siano sterili. È utile utilizzare una cappa di dissezione, ma non è assolutamente necessaria per le dissezioni se viene eseguita rapidamente.

Quindi, dopo aver recuperato e decapitato l'embrione, tagliare intorno agli occhi e rimuovere i bulbi oculari. Quindi, usa la pinza sottile Dumont numero cinque e le forbici a molla per praticare un'incisione sul lato ventrale e rimuovere gli strati esterni della pelle per esporre il proencefalo e il tectum ottico. Sbucciare e rimuovere con cura la membrana della buccia.

Trasferisci il proencefalo in un'altra capsula di Petri contenente HBSS e taglialo a pezzetti di circa due millimetri con le forbici a molla. Utilizzare una pipetta di trasferimento sterile per trasferire i pezzi di proencefalo in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Dopo che i pezzi di proencefalo sono affondati sul fondo della provetta da centrifuga, rimuovere quanto più HBSS possibile.

Quindi, aggiungere un millilitro di tripsina EDTA preriscaldata allo 0,5% e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Usa una pipetta Pasteur per rimuovere con cura la tripsina senza disturbare i pezzi di tessuto. Aggiungi un millilitro di terreno neurobasale e lascia che i pezzi di tessuto affondino sul fondo.

Dopo aver rimosso il terreno e ripetuto il lavaggio, aggiungere due millilitri di terreno neurobasale e triturare delicatamente fino a quando non si vedono più pezzi di tessuto. Diluire le cellule risospese da una a 10 con terreno neurobasale. Contare le cellule vitali utilizzando il colorante blu di tripano e un emocitometro.

Dopo il conteggio, piastrate le cellule dissociate su array multi-elettrodi rivestiti di ECM a una densità di 2.200 celle per millimetro quadrato. Il giorno successivo, aggiungere 10 micromolari di BPA in terreno neurobasale agli array multielettrodi trattati. Il giorno dell'acquisizione, sostituire il terreno di coltura con un terreno neurobasale fresco e rimettere gli array nell'incubatore a CO2 per almeno due ore prima della registrazione.

Avviare il software di registrazione e impostare la temperatura dell'array multi-elettrodo a 37 gradi Celsius facendo clic sull'icona della temperatura. Impostare i parametri di acquisizione selezionando i flussi nel pannello della finestra di sinistra e facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'icona della musa. Quindi, seleziona aggiungi elaborazione e rilevatore di picchi e fai clic su OK nella finestra pop-up.

Il rilevatore di picchi sei di STD apparirà sotto il nome del file. Quindi, fai clic con il pulsante destro del mouse sul rilevatore di picchi, seleziona aggiungi elaborazione e rilevatore di burst e fai clic su OK nella finestra pop-up. Il rilevatore di scoppio ISI apparirà sotto l'icona della musa.

Quindi, fai clic con il pulsante destro del mouse su burst detector, seleziona aggiungi compilatore di elaborazione e statistiche neurali. Nella finestra pop-up, assicurarsi che l'intestazione del file, le statistiche aggregate e la sincronia siano selezionate, quindi fare clic su OK. Il compilatore delle statistiche apparirà di seguito. Fare clic sull'icona dell'orologio nella parte inferiore dello schermo e modificare le informazioni nella sezione delle impostazioni per registrare ogni 5,1 minuti e registrare per cinque minuti.

Questa operazione verrà avviata immediatamente e verrà eseguita una sola volta. Dopo aver recuperato l'array multi-elettrodo dall'incubatrice, posizionarlo sull'unità di registrazione e bloccarlo in posizione. Avviare la registrazione dell'attività di rete facendo clic su avvia registrazione nella sezione di registrazione programmata.

In genere, un tempo di registrazione di cinque minuti è sufficiente, anche se è possibile ottenere registrazioni più lunghe, fino a 10 minuti. Dopo la registrazione, rimettere l'array multi-elettrodo nell'incubatore. Il numero medio di picchi è significativamente più basso nelle colture di proencefalo di pollo E7 trattate con BPA rispetto alle colture di controllo.

L'indice medio di sincronia è significativamente più basso nelle colture di proencefalo di pollo E7 trattate con BPA rispetto alle colture di controllo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di tre ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere sempre condizioni sterili anche durante la registrazione dell'attività del picco.

Seguendo questa procedura, l'effetto di potenziali farmaci, come gli antiepilettici e gli antidepressivi, sull'attività della rete può essere valutato come un passo verso la comprensione del loro meccanismo d'azione. Molti interferenti endocrini hanno effetti sottili sul cervello durante lo sviluppo che si manifestano come cambiamenti nel comportamento. Il comportamento è un output diretto dell'attività di rete sottostante.

Il nostro protocollo mira a sezionare gli effetti di questi composti sull'attività della rete.