In Vitro e In Vivo rilevamento di Mitophagy in cellule umane, C. Eleganse topi

L'obiettivo generale di questi esperimenti è valutare i livelli di mitofagia nelle cellule umane, nei C.elegans e nei topi. La mitofagia è diventata un concetto molto importante all'incrocio tra neurodegenerazione, malattie metaboliche e invecchiamento, e la comprensione delle metodologie qui presentate e del loro uso futuro potrebbe aiutare a fare progressi in questo importante campo. I principali vantaggi di questa tecnica sono che rileva la mitofagia in modo robusto ed efficiente e consente il rilevamento della mitofagia sia in vitro che in vivo.

Questa tecnica qui presentata aiuterà i ricercatori a sviluppare nuove intuizioni e a sviluppare nuove strategie per la terapia contro le malattie neuro-generative, tra cui l'Alzheimer e il Parkinson, dove sappiamo che c'è una disfunzione mitocondriale. Oltre a fornire informazioni sui meccanismi molecolari della mitofagia, questi metodi possono portare alla scoperta di nuovi farmaci candidati attraverso lo screening degli induttori dei mitofagi. Le dimostrazioni visive di questi metodi sono fondamentali in quanto i livelli di mitofagia sono molto sensibili ai cambiamenti delle condizioni sperimentali sia nei C.elegans che nei topi.

Semina da 300.000 a un milione di cellule in un micropozzetto con fondo di vetro da 35 millimetri, micropozzetto da 10 millimetri, in modo che le cellule raggiungano il 70% di confluenza il giorno successivo. Mantenere le cellule in un terreno di coltura cellulare completo e incubarle in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, diluire 15 microlitri del reagente di trasfezione del DNA con 150 microlitri di terreno privo di siero secondo il protocollo del produttore.

Inoltre, diluire da due a cinque microgrammi di DNA plasmidico mito-Keima con 150 microlitri di terreno privo di siero. Aggiungere il plasmide mito-Keima diluito al reagente di trasfezione del DNA diluito e agitare la miscela per 10 secondi. Quindi incubare la miscela per 10 minuti a temperatura ambiente.

Quindi, aggiungere la miscela di reagenti per trasfezione del DNA goccia a goccia alle cellule, agitare delicatamente le piastre per cinque-10 secondi per mescolare la soluzione. A questo punto, rimettete le cellule nell'incubatrice e incubatele per 24 ore. Il giorno successivo, cambiare il terreno in un terreno di coltura cellulare completo fresco e quindi incubare le cellule trasfettate per altre 24 ore.

Visualizzare le cellule trasfettate utilizzando la microscopia confocale. Visualizzare in modo casuale 20 aree con un ingrandimento di 40 volte per documentare un totale di 100-200 celle in ogni pozzetto. Il primo giorno, prelevare larve L4 di animali transgenici che esprimono sia DCT-1 GFP che DSRed LGG-1 nelle cellule muscolari della parete corporea e posizionarle su una piastra di terreno di crescita di nematodi con semi OP50.

Posiziona da cinque a 10 vermi su ogni piatto da 3,5 centimetri usando almeno tre piatti. Al termine, incubare i nematodi a 20 gradi Celsius. Successivamente, il quinto giorno, sincronizzare i nematodi selezionando da 15 a 20 larve transgeniche L4 e trasferendole su piastre fresche con semi OP50.

Utilizzare almeno cinque piastre per ogni condizione sperimentale. Il settimo giorno, prepara alcune delle targhe del veicolo per la mitofagia che interessa le droghe di interesse e alcune da utilizzare come controlli positivi. Successivamente, esporre le piastre seminate di E.coli alla luce UV per 15 minuti a un'intensità di 222 microwatt per centimetro quadrato, per garantire che i composti che inducono la mitofagia sulle piastre non vengano metabolizzati dai batteri.

Ora, aggiungi il composto di interesse in 10 microlitri alla parte superiore delle piastre seminate e aggiungi una quantità equivalente di veicolo composto alle piastre del veicolo come controllo negativo. Per un controllo positivo dell'induzione della mitofagia, aggiungere il paraquat, un tossico mitocondriale. Agitare delicatamente le piastre fino a quando la soluzione non ricopre l'intera superficie e lasciare asciugare le piastre con i coperchi chiusi, a temperatura ambiente, per almeno un'ora.

Una volta asciutti, trasferire nei piatti da 10 a 20 animali transgenici adulti di due giorni. Incubarli a 20 gradi Celsius per due giorni. Il nono giorno, preparare tamponi di agarosio al 2% e aggiungere una goccia di levamisolo da 20 millimolari in M9, per tampone.

Immobilizzare gli animali transgenici per l'imaging posizionandoli nella goccia di levamisolo M9. Quindi, posiziona delicatamente un vetrino coprioggetti sulla parte superiore della goccia. Posizionare il campione su un tavolino per microscopio confocale e visualizzare le singole cellule muscolari della parete del corpo scattando immagini Z-stack con un ingrandimento inferiore a 63 volte.

Metti un fegato di topo mito-Keima fresco e isolato su una piastra di metallo raffreddata, su ghiaccio, per raffreddare rapidamente il tessuto. Tienilo lì mentre elabori il tessuto il più rapidamente possibile, poiché il segnale della proteina mito-Keima rimane stabile sul ghiaccio per un massimo di un'ora. Quindi, usa un paio di pinze curve per sollevare il campione di fegato e sciacquarlo con cinque millilitri di PBS ghiacciato.

Infine, visualizzare le sezioni di tessuto utilizzando la microscopia confocale con due eccitazioni sequenziali. Utilizzando la procedura qui presentata, le cellule HeLa umane sono state trasfettate con il plasmide mito-Keima. Le cellule sane hanno dimostrato una rete mitocondriale ben organizzata con poche incidenze di mitofagia.

Tuttavia, le cellule pretrattate con un disaccoppiatore mitocondriale FCCP, hanno mostrato un profondo aumento dell'incidenza della mitofagia. La mitofagia è stata misurata anche utilizzando la co-localizzazione di LAMP2 e COXII. Per il rilevamento in vivo della mitofagia in C. elegans, i nematodi transgenici che esprimono rosella MT nelle cellule muscolari della parete corporea sono stati trattati con otto millimolari di paraquat.

Il livello di induzione della mitofagia, indicato da una diminuzione del rapporto di fluorescenza sensibile al pH, è risultato significativamente diminuito nei nematodi trattati con paraquat. Inoltre, l'elevato numero di eventi di co-localizzazione tra GPF fusa con DCT-1 e LGG-1 fusa con DSR, indica la stimolazione mitofagica in risposta allo stress ossidativo. Infine, queste immagini rappresentano i segnali mito-Keima provenienti dal fegato e dal cervelletto di un topo mito-Keima.

I tessuti devono essere mantenuti freddi e sottoposti a imaging il più rapidamente possibile, ma se preparati correttamente, possono essere utilizzati per fornire informazioni sulla mitofagia in condizioni normali e fisiopatologiche. L'uso di questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel vasto campo della neurodegenerazione e della biologia dei mitocondri, per esplorare le funzioni mitocondriali in diversi sistemi modello, tra cui cellule in coltura, vermi o C. elegans e modelli murini. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una comprensione dei molteplici metodi da utilizzare nella valutazione quantitativa dei livelli di mitofagia sia nei C.elegans che nei topi.