Targeting dei tioli cisteina per in Vitro site-specific glicosilazione delle proteine ricombinanti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di incorporare residui di cisteina nelle proteine mediante mutagenesi sito-diretta in siti nativamente glicosilati e impiegare approcci di attaccamento e valutazione del glucosio in vitro per valutare l'efficienza e gli effetti strutturali della glicosilazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia strutturale, come ad esempio, quali sono le conseguenze strutturali della glicosilazione delle proteine e in che modo queste modifiche influenzano i meccanismi sottostanti della funzione? I principali vantaggi di questa tecnica sono che è facilmente adattabile allo studio o alla gestione della glicosilazione.

È altamente efficiente e sia le perturbazioni strutturali che l'efficienza possono essere valutate rapidamente. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie perché i modelli di glicosilazione alterati sono stati associati a diversi tumori e disturbi neurodegenerativi. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sugli effetti delle proteine glicosilate in modo nativo, potrebbe anche fornire informazioni molto necessarie su come alterare i modelli di glicosilazione può contribuire a questa gamma di malattie.

Per introdurre una singola mutazione della cisteina nel vettore di espressione, preparare due provette di reazione PCR individuali. Nella prima provetta, aggiungere il primer mutageno in avanti e nella seconda provetta, aggiungere il primer mutageno inverso. Aggiungere una concentrazione finale di tampone PCR 1X a entrambe le provette.

Quindi, impostare un programma a cinque cicli per le due provette di reazione PCR separate. Aggiungete un tempo di estensione di sette minuti e mezzo a 72 gradi Celsius alla fine del quinto ciclo. Al termine dei cinque cicli, miscelare le due reazioni PCR separate in un'unica provetta, centrifugare la provetta per circa tre secondi e ripetere altri 20 cicli seguendo le stesse condizioni di PCR.

Successivamente, eseguire 15 microlitri di campione su un gel di agarosio all'1% di DNA a 120 Volt per 40 minuti. Quindi, immergere il gel in acqua contenente 0,5 milligrammi per millilitro di bromuro di etidio e agitarlo a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi, confermare l'amplificazione del modello sotto luce UV a una lunghezza d'onda di 302 nanometri.

Successivamente, aggiungere 0,5 microlitri di enzima di restrizione DPN1 ai restanti 25 microlitri di miscela di reazioni PCR. Incubare la miscela per due ore e mezza a 37 gradi Celsius per digerire il DNA stampo metilato. Quindi, aggiungere circa 5-10 microlitri della miscela digerita a 100 microlitri di cellule di E.coli competenti per shock termico e incubare su ghiaccio per 60 minuti.

Quindi, shock termico della miscela cellula-DNA a 42 gradi Celsius per 45 secondi su un blocco di calore secco. Quindi, incubare immediatamente la miscela su ghiaccio per tre minuti. Quindi, aggiungere 900 microlitri di brodo LB alle cellule e trasferire la sospensione in una provetta sterile da 14 millilitri a fondo tondo.

Incubare a 37 gradi Celsius agitando costantemente a 190 giri/min per 90 minuti. Quindi, distribuire il pellet di cellule centrifugate su piastre di agar integrate con antibiotici. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 16 ore.

Il giorno seguente, inoculare asetticamente una singola colonia dalla piastra in cinque millilitri di terreno LB integrato con antibiotico. Quindi, fai crescere la coltura durante la notte a 37 gradi Celsius con agitazione costante. Trasformare il plasmide mutato del residuo di cisteina in cellule di E.coli mediante trattamento di shock termico, seguito dalla crescita della coltura durante la notte in terreno LB integrato con antibiotici.

Il giorno successivo, distribuire direttamente 150 microlitri di sospensione cellulare su piastre di agar LB integrate con kanamicina e conservare le piastre per l'incubazione notturna a 37 gradi Celsius. Il giorno seguente, trasferire asetticamente una singola colonia in 20 millilitri di LB di terreno in un pallone di Erlenmeyer e lasciarla per l'incubazione notturna a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, trasferire la coltura notturna in una provetta conica da 50 millilitri.

Quindi, pellettare le cellule centrifugando la coltura liquida durante la notte a 2.400 volte G per 15 minuti. Quindi, aggiungere 10 millilitri di terreno minimo M9 al pellet cellulare e quindi sospendere la miscela cellulare in un litro di terreno M9 contenente kanamicina. Continuare a far crescere la coltura liquida M9 a 37 gradi Celsius con agitazione costante a circa 190 giri/min fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge circa 0,6-0,8.

Quindi, aggiungere 200 micromolari di IPTG alla coltura M9 per indurre l'espressione proteica e lasciare che la coltura cresca durante la notte. Il giorno seguente, pellettare le cellule batteriche dalla coltura notturna centrifugando a circa 10.000 volte G a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Utilizzando una pipetta di trasferimento motorizzata da 10 millilitri, omogeneizzare il pellet di cellule batteriche congelate in circa 40 millilitri di tampone di omogeneizzazione.

Quindi, incubare l'omogenato in un forno di ibridazione per 90 minuti con rotazione costante. Centrifugare la miscela a circa 15.000 volte G a otto gradi Celsius per 40 minuti per separare la frazione proteica solubile dal pellet insolubile. Quindi, aggiungere il 50% in volume di liquame di perle di agarosio di acido nitrilotriacetico di nichel al surnatante e incubare per inversione nel forno di ibridazione per 90 minuti a temperatura ambiente.

Successivamente, utilizzare una colonna di purificazione delle proteine a flusso di gravità per raccogliere le perle di agarosio con proteina marcata con esaistidina attaccata al nichel. Infine, lavare tre volte le perle di agarosio raccolte. Eluire le proteine in una serie di frazioni di due millilitri.

Successivamente, confermare la proteina marcata con esaistidina purificata nelle frazioni eluite eseguendo un gel SDS-PAGE colorato con blu Coomassie. Raggruppare le frazioni proteiche eluite in una membrana di dialisi con un cutoff di peso molecolare di 3.500 dalton e incubare in tampone di ripiegamento a quattro gradi Celsius durante la notte con agitazione magnetica. Quindi, aggiungere circa un'unità di trombina per milligrammo di proteina alla proteina raggruppata nella membrana di dialisi e incubare nuovamente per un giorno a quattro gradi Celsius.

Il giorno successivo, rimuovere la proteina dalla sacca per dialisi e concentrarla circa dieci volte utilizzando un concentratore centrifugo di ultrafiltrazione con un cutoff di peso molecolare di 10.000 dalton. Successivamente, diluire nuovamente il concentrato proteico di circa 20 volte in un tampone di ripiegamento privo di cloruro di sodio. Per purificare la proteina, caricarla su una colonna a scambio anionico preimpaccata e bilanciata con lo stesso tampone privo di cloruro di sodio.

Iniziare a eluire le proteine in un gradiente da zero al 60% di un molare di cloruro di sodio contenente tampone di ripiegamento. Trasferire le frazioni proteiche raggruppate in una sacca per dialisi. Condurre una fase di dialisi a quattro gradi Celsius durante la notte per scambiare la proteina nel tampone di ripiegamento sperimentale con la concentrazione molare ottimale di cloruro di sodio.

Innanzitutto, dializzare 1,5 millilitri di circa 60 proteine micromolari in un litro di tampone di modifica per la glicosilazione delle proteine. Dopo 24 ore, a quattro gradi Celsius, trasferire la proteina modificata in una provetta da microcentrifuga e aggiungere glucosio-5-MTS solubilizzato con DMSO a una concentrazione finale di due millimolari. Picchiettare delicatamente la provetta per microcentrifuga ogni 10 minuti mentre si incuba il campione al buio per un'ora a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, eseguire la dialisi a quattro gradi Celsius per re-scambiare la proteina nel tampone sperimentale finale. Misura la massa accurata della proteina utilizzando la spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray. Infine, utilizzare la soluzione NMR per calcolare l'efficienza di modifica e identificare i cambiamenti strutturali dei residui di cys glicosilati nella proteina.

Un DNA stampo amplificato con PCR mutazionale di successo è mostrato in questo gel rappresentativo di agarosio all'1% di DNA. La scala del DNA e una quantità equivalente di DNA stampo che non è stato amplificato dalla PCR vengono utilizzati come controlli nel gel. La banda più in alto con colorazione con bromuro di etidio ad alta intensità mostra il modello amplificato della dimensione desiderata.

Successivamente, la proteina è stata purificata utilizzando una colonna a scambio anionico. Il cromatogramma mostra un profilo di eluizione osservato a 280 nanometri in blu che mostra tre picchi di eluizione contro un gradiente di cloruro di sodio indicato in rosso con concentrazione crescente fino a 0,6 molari. Il pannello inferiore mostra un gel SDS-PAGE colorato blu di Coomassie delle frazioni proteiche.

La glicosilazione dei residui di cisteina è stata determinata mediante spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray. Il cromatogramma mostra le masse della proteina non modificata e modificata prima e dopo la glicosilazione del residuo di cisteina. Per conferma, è stata eseguita la NMR in soluzione che mostra la sovrapposizione spettrale HSQC degli spostamenti chimici dell'ammide specifica del residuo, indicando sia le modifiche che le perturbazioni strutturali della proteina glicosilata.

Una volta padroneggiato, tutte le fasi, dalla mutagenesi alla valutazione NMR, possono essere completate in circa 12 giorni, escludendo il tempo di attesa per la sintesi del primer, il sequenziamento del DNA e i servizi di spettroscopia di massa. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di valutare gli effetti strutturali e biofisici delle mutazioni della cisteina in assenza della modificazione del tiolo come misure di controllo della linea di base. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la stabilità, la struttura secondaria, il legame ionico, le valutazioni dell'interazione proteina-proteina, per rivelare come le proprietà biofisiche delle funzioni proteiche sottostanti siano influenzate dalla glicosilazione.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della segnalazione del calcio per valutare individualmente e cumulativamente i ruoli dell'asparagina 131 e dell'asparagina 171 e della glicosilazione nella molecola di interazione stromale una segnalazione del calcio associata all'ingresso del calcio in negozio.