Name: Mappatura del genoma della cromatina accessibile in linfociti T umani primari da ATAC-Seq (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Scopri il protocollo ATAC-seq per mappare la cromatina accessibile nei linfociti T umani primari. Questo metodo robusto richiede poco materiale di partenza e permette di identificare elementi regolatori a livello genomico.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è sostenuto dalla Fondazione di scienza di Israele (grant 748/14), Marie Curie integrazione concedere (CIG) - 7 ° PQ-persone-20013-CIG-618763 e programma del Planning e Budgeting Comitato e The Israel Science Foundation CORE concedere n. 41/11.

tutte le procedure sono state approvate dal comitato di revisione istituzionale dell'Università di Bar Ilan e il protocollo segue linee guida fornite dal comitato che approva gli esperimenti.
 1. purificazione di ingenuo CD4 + cellule umane e polarizzazione di cellule Th2 e T Helper 1 (Th1) Nota: Qui descriviamo la procedura a partire da cellule mononucleari del sangue periferico umano congelato (PBMCs). Il primo passo consiste nell'isolare le cellule CD4 + utilizzando microsfere e colonne che di solito dare noi più del 95% delle cellule di CD4 +. Tuttavia, questo passaggio può variare secondo il protocollo preferito in ogni laboratorio. Il protocollo per l'attivazione delle cellule T e la polarizzazione è stato modificato da Jenner et al. (2009) 18. isolamento di CD4 + cellule da 10 milioni PBMCs dà luogo a 4 milioni di cellule CD4 +. Sono diviso in due boccette e cresciuti sotto Th1 e di polarizzazione Th2 condizioni ottenendo 3 milioni cellule Th1 e Th2 in appena una settimana.
 Nota: raffreddare la centrifuga a 4 ° C prima di iniziare.
<ol><li>Scongelare 1 mL di PBMCs umano (10 7 cellule) in una provetta da 50 mL contenente 10 mL di medium RPMI supplementato con 1% di penicillina-streptomicina, 2 mM L-Glutammina e siero bovino fetale inattivati 10%. Centrifugare a 500 g per 5 min, rimuovere il supernatante e risospendere le cellule con una pipetta sterile 25 mL in 15 mL di medium RPMI completato. Trasferire le cellule (con una pipetta sterile 25 mL) in un pallone di cultura T75.</li>
	<li>Lasciare le celle durante la notte in un incubatore (37 ° C, 5% CO 2).</li>
	<li>Trasferire le cellule galleggiante con una pipetta sterile da 25 mL per tubo da 50 mL. Determinare il numero di cell e attuabilità di esclusione del blu di trypan.</li>
	<li>Isolare CD4 + cellule da 10 milioni vivono antiaderente PBMCs di selezione positiva utilizzando microsfere di CD4 + e colonne secondo il produttore &#39; consigli s (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature) con i seguenti modifiche: 10 7 PBMCs sono etichettati con 30 µ l di microsfere di CD4 in 120 µ l di 0,5% BSA in PBS.</li>
	<li>Per attivare le cellule T CD4 + per 72 h rhIL-2 (10 ng/mL), associato a piastra anti-CD3 (5 µ g/mL) e solubile anti-CD28 (2 µ g/mL). Per polarizzazione Th1, aggiungere rhIL-12 (20 ng/mL) e anti-IL-4 (10 µ g/mL). Per polarizzazione Th2, aggiungere rhIL-4 (40 ng/mL) e anti-IFN-γ (10 µ g/mL).</li>
	<li>Le cellule della coltura per ulteriori 7 giorni in presenza di rhIL-2 (10 ng/mL) e le stesse citochine polarizzante (rhIL-12 per Th1 e rhIL-4 per Th2).</li>
</ol> 2. Isolamento di nuclei Nota: ATAC-seq viene eseguita con i nuclei intatti. Lysis buffer contenente 0,05% nonylphenyl polietilenglicole (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature) è stato calibrato per isolare nuclei da cellule umane primarie di Th1 e Th2. Si consiglia di calibrare questo passaggio con i reagenti di laboratorio e le cellule. Un eccesso di cellule intatte da detersivo insufficiente diminuisce l'efficienza della reazione di trasposizione. Efficienza di lisi delle cellule è determinata dal numero dei nuclei (cellule positive del blu di trypan) rispetto al numero totale delle cellule. 
Nota: Preparare il tampone di lisi (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 millimetri di NaCl, 3 mM MgCl 2). Raffreddare una centrifuga con rotore a battente-benna a 4 ° C. cubettatura le cellule in una centrifuga di swing-secchio invece di una centrifuga ad angolo fisso riduce la perdita di nuclei e delle cellule. Per evitare i nuclei o perdita delle cellule, Pipettare attentamente quando scartare il surnatante.
<ol><li>Aggiungi fresco nonylphenyl polietilenglicole (a una concentrazione finale di 0.05%) e inibitori della proteasi (a una concentrazione finale di 1 x) per il buffer di lisi freddo immediatamente prima dell'uso: 100x. Mantenere il buffer su Ice.</li>
	<li>Cellule di T totali per determinarne la quantità e la redditività mediante metodo del blu di trypan. Vitalità che è inferiore al 90% di risultati superiore non specifico digestione.</li>
	<li>Trasferimento 0,5 x 10 6 T cellule (Th1 o Th2) per microprovette da 1,5 mL. Rotazione verso il basso a 500 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di freddo tampone fosfato salino (PBS) soluzione. Rotazione verso il basso a 500 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone di lisi freddo (contenente nonylphenyl polietilene glicole e inibitori della proteasi). Tenere il tubo sul ghiaccio. Pipetta delicatamente per evitare di interrompere i nuclei.</li>
	<li>Rapidamente prendere 10 µ l e contare le celle con un contatore di cellule automatizzato mentre nella microprovetta con le cellule lisate è il ghiaccio. Questo passaggio non deve superare i cinque minuti per evitare di danneggiare i nuclei. Almeno l'80% delle cellule dovrebbe essere lisati.</li>
	<li>Continua immediatamente con la reazione di trasposizione. Mantenere i nuclei preparati sul ghiaccio.</li>
</ol> 3. Reazione di trasposizione Nota: In questo passaggio, nuclei isolati sono incubati con procariotiche Tn5 transposase (TDE1) caricato con adattatori per il sequenziamento NGS. Tn5 iperattivo, contemporaneamente, frammenti di DNA e lega adattatori in regioni accessibili del genoma (processo tagmentation). Il rapporto tra nuclei e Tn5 transposase è critico per la scissione preferenziale alla cromatina accessibile. Questo protocollo è calibrato per 100.000 nuclei in un volume di reazione 100 μL. Tuttavia, la reazione può essere ridimensionata.
<ol><li>Set temperatura in uno shaker termale a 37 ° C.</li>
	<li>Trasferire 100.000 nuclei ad una microprovetta 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifuga a 500 x g per 10 min a 4 ° C e delicatamente rimuovere il supernatante.</li>
	<li>Aggiungere i componenti di reazione di trasposizione dei nuclei come specificato nella tabella 1.</li>
	<li>Risospendere pipettando delicato.</li>
	<li>Incubare la reazione di trasposizione in uno shaker termale a 37 ° C per 30 min con lieve agitazione (500 giri/min). 
	Nota: Pulizia del DNA viene eseguita da fase solida reversibile immobilizzazione perline 19 (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature) o colonne di purificazione di PCR. Al termine della pulizia, eluire i frammenti di DNA in 20 µ l di 10 mM Tris-HCl, pH 8. Evitare di EDTA in tampone di eluizione.</li>
</ol> 4. Arricchimento di PCR delle librerie ATAC-seq Nota: questo passaggio si rivolge per amplificare i frammenti di ATAC-seq libreria cioè DNA con adattatori inseriti. Per consentire la miscelazione di diverse librerie di ATAC-seq nella stessa corsia di sequenziamento di nuova generazione (&#34; multiplexing &#34;) uso meno Primer 1 (Ad1_noMx) 1 per tutti i campioni, e una diversa indicizzati (codice a barre) 2 Primer (Ad 2.1-2.24) 1 per ogni campione. Le sequenze dell'iniettore sono fornite nell' completati Tabella di materiali/attrezzature.
<ol><li>L'amplificazione di PCR iniziale Nota: la concentrazione di lavoro di Primer 1 (Ad1_noMx) e 2 Primer è 25 µM. Tutti i primer sono diluiti da originale stock di 100 µM a 25 µM. In tutte le reazioni di PCR, utilizzare Primer 1 (Ad1_noMx) e solo uno dei 2 Primer indicizzata.
	<ol><li>Aggiungere i componenti della reazione PCR come specificato nella tabella 2 in una provetta sterile da PCR.</li>
		<li>Posto PCR tubo in un termociclatore ed eseguire l'amplificazione di PCR utilizzando i ciclismo condizioni dettagliate nella tabella 3.</li>
	</ol></li> <li>Valutazione del numero di cicli di amplificazione aggiuntiva Nota: il numero di ulteriori cicli di PCR dovrebbe produrre sufficienti quantità di libreria frammenti fo un successo sequenziamento di nuova generazione esegue, mentre ridotti al minimo per evitare GC e taglia bias 20. La determinazione del numero di cicli PCR (N) richiesti per l'amplificazione del frammento biblioteca ottimale avviene mediante PCR quantitativa (qPCR).
	<ol><li>Diluire 1 Primer (Ad1_noMx) e 2 (usato per l'amplificazione iniziale Biblioteca) da 25 µM a 6.25 µM.</li>
		<li>Aggiungere i componenti a tubi ottici di PCR o un piatto, come indicato nella tabella 4.</li>
		<li>Posto in un ciclo come specificato nella tabella 5 e strumento di qPCR.</li>
		<li>Per stimare il numero di cicli di amplificazione aggiuntiva (N), tracciare il numero di cicli sull'asse x e relativa fluorescenza (RFU) sull'asse y.</li>
		<li>Il numero di amplificazione ulteriore cicli (N) è 1/3 del numero di cicli in cui la reazione di qPCR raggiunto il plateau. Figura 2 fornisce esempi per tre librerie di ATAC-seq che raggiungessero plateau a ~ 2.350 unità relativa fluorescenza, RFU (linea verde spessa). Il numero di cicli PCR in cui un terzo dell'importo massimo (783 RFU, segnato sull'asse y) è amplificato corrisponde a 8 cicli per due delle librerie (curve di amplificazione rosso e blu) e 9 cicli PCR per la libreria terza (rosa).</li>
	</ol></li> <li>L'amplificazione di PCR finale <ol><li>amplificare il restante 45 µ l della reazione PCR. Inserire un tubo PCR contenente la reazione di amplificazione dal punto 4.1.2 in un termociclatore. Eseguire il programma PCR descritto nella tabella 6. Utilizzare il numero di determinati in precedenza (punto 4.2.5) di cicli di amplificazione (N).</li>
	</ol></li></ol> 5. Taglia selezione delle biblioteche di ATAC-Seq Nota: nella nostra esperienza, selezione della dimensione di amplificato ATAC-seq librerie migliora risultati di sequenziamento di nuova generazione perché Elimina frammenti di libreria ad alto peso molecolare dalla finale ATAC-seq biblioteca. 
Nota: Lasciare i branelli magnetici a temperatura ambiente 30 min prima dell'uso. 
Preparare fresco etanolo al 70% in acqua priva di nucleasi.
<ol><li>Risospendere i branelli magnetici mescolando.</li>
	<li>Aggiungere acqua priva di nucleasi per le librerie di ATAC-seq (ottenute al punto 4.3.1.) e portare fino a 100 µ l.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l (0.5 x) di sedimento biglie magnetiche di legame al DNA a 100 µ l di amplificato librerie. Mescolare pipettando su e giù almeno 10 volte. Incubare i campioni per 5 min a temperatura ambiente. Se necessario, ruota velocemente giù le microprovette.</li>
	<li>Inserire il tubo su un appropriato supporto magnetico per 2 min separare i branelli magnetici dal surnatante. Dopo 2 minuti, trasferire il surnatante ad una nuova microprovetta.</li>
	<li>Misurare il volume del surnatante pipettando e aggiungere 0,7 x di biglie magnetiche. Mix pipettando su e giù almeno 10 volte.</li>
	<li>Incubare 5 min a temperatura ambiente. Posto su un supporto magnetico per 2 min.</li>
	<li>Dopo il 2 min di incubazione, scartare il surnatante. Aggiungere 200 µ l preparata etanolo al 70% per lavare le perle mentre i tubi sono su supporto magnetico.</li>
	<li>Tenere il conetti sul magnete per 30 s e poi scartare l'etanolo. Ripetere il passaggio 5.7.for due lavaggi di etanolo finale.</li>
	<li>Rimuovere completamente le rimanenti etanolo e lasciare che asciugare all'aria le perline per 5 min mentre il tubo è sul magnete. Se necessario, girare brevemente nella microprovetta. Rimuovere le tracce di etanolo con una punta di pipetta p10.</li>
	<li>Rimuovere la provetta dal magnete e 22 µ l di 10 mM Tris-HCl, pH 8. Non eluire le librerie di ATAC-seq in tampone contenente EDTA.</li>
	<li>Incubare la provetta per 2 min a temperatura ambiente e poi mettete sul supporto magnetico.</li>
	<li>Quando la soluzione è limpida, trasferire una nuova microprovette sterili 20 µ l di librerie eluite.</li>
	<li>Store la dimensione selezionata ATAC-seq librerie a -20 ° C.</li>
</ol> 6. Analisi della qualità delle librerie ATAC-Seq <ol><li>convalida della qualità dell'ATAC-seq librerie di Real-Time PCR Nota: è importante valutare il rapporto segnale-rumore delle librerie ATAC-seq prima della prossima generazione sequenziamento. Questo viene fatto determinando la relativa quantità di frammenti di DNA da loci accessibile e inaccessibili mediante PCR quantitativa (qPCR). I loci inaccessibili (controllo negativo, chr1:48, 137, 860-48,137,934 e chr1:193, 093, 748-193,093,827) sono amplificati da coppie di primer 1 e 2. I loci accessibili (controllo positivo, chr19:30, 336, 166-30,336,253 e chr19:11546154-11546237) sono amplificati da coppie di primer 3 e 4. Loci positivi e negativi sono stati definiti dai profili di accessibilità (DHS-seq) cromatina delle cellule CD4 + umane (ENCODE adesioni ENCSR000EQE ed ENCSR000EQG). Negativo iniettore 1 si trova in una grande regione intergenica heterochromatic (230 kb da TRADB2 e 88 kb da FOXD2). Regione di controllo negativo 2 è all'interno del primo introne del gene CDC73. A valle del gene di Cyclin E (CCNE1) mentre la coppia di primer positivo 4 positivo coppia di primer 3 è all'interno di una regione aperta della cromatina è centrato all'interno il promotore della proteina chinasi C substrato 80K-H (PRKCSH). D'importanza, questi loci di controllo mostrano un modello simile di accessibilità in altri tipi di cellule umane del progetto ENCODE 3, suggerendo che possono essere applicate per monitorare ATAC-seq librerie da un ampio spettro di tipi della cellula umana. Primer efficienza e specificità di tutte le coppie di primer è stata verificata da qPCR su una diluizione seriale di DNA genomic (da cellule umane Th) e un'analisi della curva di fusione dei prodotti amplificati ottenuti.
	<ol><li>Isolare DNA genomico utilizzando un disponibili in commercio kit (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature).</li>
		<li>Diluire l'ATAC-seq amplificato libreria 01:10 (1 µ l libreria + 9 µ l di acqua priva di nucleasi) e DNA genomico a ~ 5 ng / µ l.</li>
		<li>Preparare la miscela di reazione (tabella 7) per ogni coppia di primer di controllo positivi e negativi, tenendo conto che le reazioni vengono eseguite in triplice copia.</li>
		<li>Incubare in termociclatore qPCR secondo il protocollo consigliato dal fornitore di mix master qPCR.</li>
		<li>Analizzare i risultati in qPCR strumento &#39; software s (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature). Scegliere il DNA genomico come un campione di controllo. I valori ottenuti rappresentano un arricchimento delle regioni accessibili (amplificati di primer di controllo positivo). Un esempio è illustrato nella tabella 8. 
		Nota: Stima della libreria di media dimensione e concentrazione: la distribuzione delle dimensioni dei frammenti del DNA dalle librerie di ATAC-seq è determinata dai sistemi automatizzati elettroforesi ad alta sensibilità secondo il produttore &#39; s istruzioni. Si consiglia di misurare la concentrazione del campione su un fluorometro utilizzando kit di dsDNA ad alta sensibilità e almeno 2 µ l di ciascun campione di DNA. 
		Nota: Sequenziamento di nuova generazione - prima del funzionamento in multiplex le librerie, calcolare la molarità di ciascuna libreria di ATAC-seq utilizzando la formula: (ng / µ l x 10 6) / (660 x libreria media frammento lunghezza). Obiettivo per &#62; 30 milioni letture di ciascuna libreria di ATAC-seq per valutare la cromatina aperta regioni di campioni umani. Se si desidera determinare se la libreria è abbastanza buona per il sequenziamento NGS, inizialmente obiettivo per letture 10 milioni (5% della corsia di sequenziamento a strumento di sequenziamento del DNA in modalità di esecuzione rapida). Tenete a mente che per dedurre nucleosoma posizionamento, accoppiato-fine sequenziamento è necessaria 1.</li>
	</ol></li></ol> 7. Analisi dei risultati di sequenziamento Next-Generation ottenuti <ol><li>dedurre la qualità del sequenziamento legge controllando i file FastQC, separatamente per ogni libreria.</li>
	<li>Allineare le letture al genoma umano riferimento (Assemblea hg19) utilizzando Bowtie 21 software in ambiente Unix/Linux. Il comando è &#39; bowtie -m 1 - q -S genoma directory reads.fastq output_aligned.sam &#39;. Directory di genoma sta per la cartella dove sono memorizzati gli indici di genoma di Bowtie. Il parametro -m 1 è per non permettere che l'allineamento di letture per più di un locus nel genoma, - q è per il file di input che deve essere nel formato fastq -S è per l'output in formato SAM.</li>
	<li>Rimuovere duplicate letture utilizzando SAMtools 22 rmdup opzione in ambiente Unix/Linux. I comandi sono &#39; samtools Mostra output_aligned.sam -b -S | samtools ordinare -o-output_aligned &#62; output_aligned.bam &#39;, samtools rmdup -s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam &#39;. Il primo comando, Visualizza, cambia il formato di SAM in formato BAM che viene quindi ordinata. L'opzione di rmdup è quindi applicato il file ordinato di BAM. Opzionalmente si possono regolare le letture per il sito di inserzione del trasposone, come descritto nell'originale carta di ATAC-seq 1. Questa operazione viene eseguita utilizzando BEDtools i comandi 23 in ambiente Unix/Linux. I comandi sono &#39; bamToBed -i output_aligned _rmdup.bam &#62; output_aligned _rmdup.bed &#39;, &#39; shiftBed -i genoma di output_aligned _rmdup.bed -p 4 - m-5 - g &#62; output_aligned _rmdup_adjusted.bed &#39;. Il primo comando, bamTobed, cambia il formato BAM in formato letto, che può quindi essere utilizzato per il comando di shiftBed. Il file di genoma è un file delimitato da tabulazioni che contiene la lunghezza di ciascun cromosoma nel genoma. Di solito viene aggiunto il file nella directory BEDtools.</li>
	<li>Eseguire chiamate di picco mediante analisi basata su modello di ChIP-seq (MACS2) 24 software nell'ambiente di Unix/Linux sul file letto spostato con i seguenti parametri: - nomodel - extsize 75-- spostamento -30. Questi parametri vengono utilizzati per regolare le letture, in modo che il sito di inserzione del trasposone è al centro di ogni lettura di sequenziamento.</li>
</ol>

<ol><li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin%2C+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+A+method+for+assaying+chromatin+accessibility+genome-wide%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide.</a> Curr Protoc Mol Biol. , 21.29.1-21.29.9 (2015).</li>
<li>Thurman, R. E., Rynes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+accessible+chromatin+landscape+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The accessible chromatin landscape of the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).</li>
<li>Song, L., Crawford, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNase-seq%3A+a+high-resolution+technique+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+from+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells.</a> Cold Spring Harb Protoc. (2), (2010).</li>
<li>Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+formaldehyde-assisted+isolation+of+regulatory+elements+%28FAIRE%29+to+isolate+active+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA.</a> Nat Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).</li>
<li>Cui, K., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Approaches+to+Determining+Nucleosome+Occupancy+in+Metazoans+Using+MNase-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Approaches to Determining Nucleosome Occupancy in Metazoans Using MNase-Seq.</a> Methods Mol Biol. 833, 413-419 (2012).</li>
<li>Qu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individuality+and+Variation+of+Personal+Regulomes+in+Primary+Human+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Individuality and Variation of Personal Regulomes in Primary Human T Cells.</a> Cell Syst. 1 (1), 51-61 (2015).</li>
<li>Scharer, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq+on+biobanked+specimens+defines+a+unique+chromatin+accessibility+structure+in+na%C3%AFve+SLE+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq on biobanked specimens defines a unique chromatin accessibility structure in naïve SLE B cells.</a> Sci Rep. 6, 27030(2016).</li>
<li>Sebé-Pedrós, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dynamic+Regulatory+Genome+of+Capsaspora+and+the+Origin+of+Animal+Multicellularity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Dynamic Regulatory Genome of Capsaspora and the Origin of Animal Multicellularity.</a> Cell. 165 (5), 1224-1237 (2016).</li>
<li>Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+ATAC-seq+with+nuclei+sorting+for+discovery+of+cis-regulatory+regions+in+plant+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes.</a> Nucleic Acids Res. 45 (6), e41(2016).</li>
<li>Davie, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Transcription+Factors+and+Regulatory+Regions+Driving+In+Vivo+Tumor+Development+by+ATAC-seq+and+FAIRE-seq+Open+Chromatin+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genet%22%5BJournal%5D)">Discovery of Transcription Factors and Regulatory Regions Driving In Vivo Tumor Development by ATAC-seq and FAIRE-seq Open Chromatin Profiling.</a> PLOS Genet. 11 (2), (2015).</li>
<li>Villar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+Evolution+across+20+Mammalian+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancer Evolution across 20 Mammalian Species.</a> Cell. 160 (3), 554-566 (2015).</li>
<li>Lara-Astiaso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+state+dynamics+during+blood+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin state dynamics during blood formation.</a> Science. 345 (6199), 943-949 (2014).</li>
<li>Prescott, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+Divergence+and+cis-Regulatory+Evolution+in+the+Human+and+Chimp+Neural+Crest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancer Divergence and cis-Regulatory Evolution in the Human and Chimp Neural Crest.</a> Cell. 163 (1), 68-83 (2015).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+accessible+chromatin+in+mammalian+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos.</a> Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).</li>
<li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li>
<li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nat Genet. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li>
<li>Jenner, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factors+T-bet+and+GATA-3+control+alternative+pathways+of+T-cell+differentiation+through+a+shared+set+of+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">The transcription factors T-bet and GATA-3 control alternative pathways of T-cell differentiation through a shared set of target genes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 17876-17881 (2009).</li>
<li>DeAngelis, M. M., Wang, D. G., Hawkins, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+reversible+immobilization+for+the+isolation+of+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products.</a> Nucleic Acids Res. 23 (22), 4742-4743 (1995).</li>
<li>Aird, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+and+minimizing+PCR+amplification+bias+in+Illumina+sequencing+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries.</a> Genome Biol. 12 (2), R18(2011).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25(2009).</li>
<li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/gb-2008-9-9-r137">Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Meyer, C. A., Shirley Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+and+mitigating+bias+in+next-generation+sequencing+methods+for+chromatin+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology.</a> Nat Rev Genet. 15 (11), 709-721 (2014).</li>
<li>He, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refined+DNase-seq+protocol+and+data+analysis+reveals+intrinsic+bias+in+transcription+factor+footprint+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Refined DNase-seq protocol and data analysis reveals intrinsic bias in transcription factor footprint identification.</a> Nat Methods. 11 (1), 73-78 (2013).</li>
<li>Madrigal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+Accounting+for+Sequence-Specific+Bias+in+Genome-Wide+Chromatin+Accessibility+Experiments%3A+Recent+Advances+and+Contradictions%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">On Accounting for Sequence-Specific Bias in Genome-Wide Chromatin Accessibility Experiments: Recent Advances and Contradictions.</a> Front Bioeng Biotechnol. 3, 1-4 (2015).</li>
<li>Qin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChiLin%3A+a+comprehensive+ChIP-seq+and+DNase-seq+quality+control+and+analysis+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ChiLin: a comprehensive ChIP-seq and DNase-seq quality control and analysis pipeline.</a> BMC Bioinformatics. 17 (1), (2016).</li>
<li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ATAC-seq+approach+reveals+lineage-specific+reinforcement+of+the+open+chromatin+landscape+via+cooperation+between+BAF+and+p63%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel ATAC-seq approach reveals lineage-specific reinforcement of the open chromatin landscape via cooperation between BAF and p63.</a> Genome Biol. 16 (1), 284(2015).</li>
<li>Maurano, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+localization+of+common+disease-associated+variation+in+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA.</a> Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo di ATAC-seq descritto qui è stato impiegato con successo per l'analisi della cromatina accessibile in cellule primarie (umano Th1, Th2 cellule e cellule di B) così come le linee di cellule in coltura (cellule di cancro al seno umane MCF10A e U261 le cellule di glioblastoma). L'applicazione di ATAC-seq per altri tipi di cellule può richiedere alcune ottimizzazione dei protocolli, soprattutto nel passaggio lisi. Se la concentrazione del detergente non ionico è troppo alto, potrebbe trattarsi di una percentual...

ATAC-seq1,2 è un metodo affidabile che consente l'identificazione di regioni di cromatina aperta regolamentare3 e posizionamento nucleosoma. Questa informazione viene applicata per dedurre la posizione, identità e attività di fattori di trascrizione. Sensibilità del metodo di misurazione quantitativa delle variazioni nella struttura cromatinica permette lo studio dell'attività dei fattori della cromatina, compreso remodelers della cromatina e modificatori, come pure l'attività trascrizionale di RNA polimerasi II1. Così ATAC-seq fornisce un approccio potente e imparziale per decifrare i meccanismi che governano la regolazione trascrizionale in qualsiasi tipo di cellula di interesse. Descriviamo l'adattamento di ATAC-seq per cellule umane primarie di Th1 e Th2.
ATAC-seq, iperattivo Tn5 transposase caricato con adattatori per frammentazione del DNA di sequenziamento di nuova generazione (NGS) coppie con la codifica del DNA con adattatori (cioè, il processo di "tagmentation")1. In seguito l'amplificazione di PCR, le librerie di DNA risultante sono pronte per il sequenziamento di nuova generazione (Figura 1). Il tagmentation preferenziale della cromatina accessibile viene rilevato dall'analisi dell'arricchimento locale di letture di sequenziamento ATAC-seq.
La breve procedura sperimentale e requisito per meno materiale di partenza, rispetto al altri metodi per misurare l'accessibilità della cromatina e posizionamento nucleosomal dnasi-seq4, FAIRE-seq5e MNase-seq6, ha promosso l'uso di ATAC-seq in più sistemi biologici tra cui cellule primarie umane1,7 e campioni clinici8, così come organismi unicellulari9, piante10, mosche della frutta11 e vari mammiferi12.
L'identità della trascrizione, fattori che sono associati ai loci accessibile possono essere scoperta dalla analizzando l'arricchimento dei loro motivi di sequenza di associazione o combinando ATAC-seq con immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) seguita da (sequenziamento del DNA di alto-rendimento ChIP-seq). Questo approccio ha permesso l'identificazione di fattori di trascrizione lineage-specifici importanti per l'ematopoiesi in mouse13. La natura imparziale e globale di ATAC-seq permette di studiare la regolazione genica negli organismi per i quali i reagenti come gli anticorpi per l'analisi di ChIP non sono disponibili. Ad esempio, variazioni di evolutive in cis-regioni regolarici sono state identificate attraverso lo studio di cellule neurali craniche della cresta da esseri umani e scimpanzé14, variazioni inerenti allo sviluppo di elementi regolatori durante primo mouse l'embriogenesi15, cambia nel panorama normativo durante un ciclo di vita di unicellulari owzarzaki c.9e l'evoluzione dei promotori e rinforzatori attraverso 20 mammifero specie12.
ATAC-seq è stato strumentale per misurare l'accessibilità della cromatina in singole cellule, così rivelando variabilità all'interno di popolazioni di cellule, che solitamente sfugge genoma studi7,16. Inoltre, ATAC-seq può essere utilizzato per studiare i cambiamenti che si verificano in condizioni di malattia, in cui i campioni sono rari nelle regioni regolatrici del DNA. Ad esempio, ATAC-seq può essere utilizzato per studiare i cambiamenti nel panorama normativo durante l'insorgenza della leucemia mieloide acuta (AML)17 o Ras-driven oncogenesi11.

<table><tbody><tr><td>Provette da 50 mL</td><td>Lumitron</td><td>LUM-CFT011500-P</td><td>Può provenire da altri fornitori.</td></tr><tr><td>Microtubi</td><td>Axygen Inc</td><td>MCT-175-C</td><td>Può provenire da altri fornitori.</td></tr><tr><td>Pipette sierologiche da 25 ml Corning</td><td>Costar</td><td>4489</td><td>Può provenire da altri fornitori.</td></tr><tr><td>Pallone per coltura tissutale</td><td>Lumitron</td><td>LUM-TCF-012-250-P</td><td>Può provenire da altri fornitori.</td></tr><tr><td>Contatore di cellule automatizzato Countes</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740952.5</td><td></td></tr><tr><td>Cellule mononucleate del sangue periferico&nbsp;( PBMC)</td><td>ATCC&</td><td>nbsp; PCS&timido; 800&timido; 011</td><td>Può provenire da altri fornitori.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Biological Industries</td><td>01-103-1A</td><td>Può provenire da altri fornitori.</td></tr><tr><td>Soluzione di L-Glutammina (200 mM)</td><td>Biological Industries</td><td>03-020-1B</td><td>Può provenire da altri fornitori.</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Industrie Biologiche</td><td>03-031-1B</td><td>Può provenire da altri fornitori.</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS),&nbsp; Industrie</td><td>biologiche</td> di grado europeo <td>inattivato al calore 04-127-1</td><td>Può provenire da altri fornitori.</td></tr><tr><td>Microsfere MACS CD4, umano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td></td></tr><tr><td>Colonne MACS MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD4 FITC</td><td>Biogems</td><td>06121-50</td><td></td></tr><tr><td>Controllo dell'isotipo IgG1 di topo FITC</td><td>Biogems</td><td>44212-50</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD3 (OKT3)</td><td>Tonbo biosciences</td><td>40-0037</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD28 SAFIRE Biogems purificato</td><td></td><td>10311-25</td><td></td></tr><tr><td>IL2 umano ricombinante</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>IL4 umano ricombinante</td><td>Peprotech</td><td>200-04</td><td></td></tr><tr><td>IL12 umano ricombinante p70</td><td>Peprotech</td><td>200-12</td><td></td></tr><tr><td>In vivo pronto anti-umano IL-4 (MP4-25D2)</td><td>Tonbo</td><td>40-7048</td><td></td></tr><tr><td>LEAF&nbsp; IFN purificato anti-umano-&gamma;</td><td>BioLegend</td><td>506513</td><td></td></tr><tr><td>NaCl, grado analitico</td><td>Carlo Erba</td><td>479687</td><td>Può provenire da altri fornitori.</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio, esaidrato, grado di biologia molecolare</td><td>Calbiochem</td><td>442611</td><td>Può provenire da altri fornitori.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MP Biomedicals</td><td>800682</td><td>Può provenire da altri fornitori.</td></tr><tr><td>Tris, ultra puro, puro al 99,9%</td><td>MP Biomedicals</td><td>819620</td><td>Può provenire da altri fornitori.</td></tr><tr><td>Alternativa NP-40 (Nonylphenyl Polyethylene Glycol)</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td>Può provenire da altri fornitori.</td></tr><tr><td>Inibitori della proteasi</td><td>Sigma</td><td>P2714</td><td>questo inibitore della proteasi coctail è una polvere. Per preparare 100 x soluzione diluire in 1 mL di acqua di biologia molecolare.</td></tr><tr><td>Perline magnetiche di immobilizzazione inversa in fase solida: Perline AMPure XP Kit di</td> purificazione PCR <td>Beckman</td><td>63881</td><td></td></tr><tr><td></td><td>HyLabs</td><td>EX-GP200</td><td>Può provenire da altri fornitori.</td></tr><tr><td>Kit di preparazione della libreria di DNA Nextera (trasposasi TDE1 e tampone TD)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1030</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0541</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0543</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; CFX Connect PCR in tempo reale&nbsp; Rilevamento&nbsp; Sistema</td><td>Bio-rad</td><td>185-5200</td><td>Può provenire da altri fornitori.</td></tr><tr><td>Software CFX Manager</td><td>Bio-rad</td><td>1845000</td><td></td></tr><tr><td>master mix per qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-rad</td><td>172-5124</td><td>Può provenire da altri fornitori.</td></tr><tr><td>Fluorimetro Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Kit di analisi Qubit dsDNA HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Magnete per provette eppendorf</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Può provenire da altri fornitori.</td></tr><tr><td>Centrifuga di raffreddamento a secchiello oscillante con i secchi per provette falcon da 15 mL e provette eppendorf</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004527</td><td>Potrebbe provenire da altri fornitori. È importante che abbia secchi per le provette Eppendorf.</td></tr><tr><td>Thermo-shaker</td><td>MRC</td><td></td><td>Può provenire da altri fornitori.</td></tr><tr><td>ScreenTape D1000 ad alta sensibilità</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>Reagenti D1000 ad alta sensibilità</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>Sistema TapeStation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td>Piattaforma basata su nastro per elettroforesi</td></tr><tr><td>Kit DNA ad alta sensibilità</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>Reagente per analisi TapeStation</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> ad alta sensibilità <tr><td>Nome e sequenza del primer</td> Ad1_noMX <td>azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad1-noMx: 5'-P5 sequenza-trasposasi sequenza-3'Ad2.1_TAAGGCGA</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.1_expected sequenza indice leggere: 5'-P7 sequenza-[sequenza indice]-trasposasi sequenza-3'Ad2.2_CGTACTAG</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.2_expected sequenza indice leggere: 5'-P7 sequenza-[sequenza indice]-trasposasi sequenza-3'</td></tr><tr><td>Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.3_expected sequenza indice read: 5'-P7 sequenza-[sequenza indice]-trasposasi sequenza-3'Ad2.4_TCCTGAGC</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td><td>Ad2.4_expected sequenza indice read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposasi sequence-3'Ad2.5_GGACTCCT</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.5_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposasi sequence-3'Ad2.6_TAGGCATG</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.6_expected sequenza indice leggere: 5'-P7 sequenza-[sequenza indice]-trasposasi sequenza-3'Ad2.7_CTCTCTAC</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.7_expected sequenza indice leggere: 5'-P7 sequenza-[sequenza indice]-trasposasi sequenza-3'</td></tr><tr><td>Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.8_expected sequenza indice read: 5'-P7 sequenza-[sequenza indice]-trasposasi sequenza-3'Ad2.9_GCTACGCT</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td><td>Ad2.9_expected sequenza indice read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposasi sequence-3'Ad2.10_CGAGGCTG</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG GCTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.10_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposasi sequence-3'Ad2.11_AAGAGGCA</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.11_expected sequenza indice read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposasi sequence-3'Ad2.12_GTAGAGGA</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.12_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'</td></tr><tr><td>Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.13_expected sequenza indice read: 5'-P7 sequenza-[sequenza indice]-trasposasi sequenza-3'Ad2.14_ACCACTGT</td></tr><tr><td>: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td><td>Ad2.14_expected sequenza indice read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposasi sequence-3'Ad2.15_TGGATCTG</td></tr><tr><td>: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.15_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposasi sequence-3'Ad2.16_CCGTTTGT</td></tr><tr><td>: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.16_expected sequenza indice leggere: 5'-P7 sequenza-[sequenza indice]-trasposasi sequenza-3'</td></tr><tr><td>&nbsp; Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.17_expected sequenza indice leggere: 5'-P7 sequenza-[sequenza indice]-trasposasi sequenza-3'</td></tr><tr><td>&nbsp; Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.18_expected sequenza di indice read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transsposase sequence-3'Ad2.19_AGGTTGGG</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td><td>Ad2.19_expected sequenza indice legge: 5'-P7 sequenza-[sequenza indice]-trasposasi sequenza-3'</td></tr><tr><td>&nbsp; Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.20_expected sequenza indice read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposasi sequence-3'</td></tr><tr><td>&nbsp; Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.21_expected sequenza indice read: 5'-P7 sequenza-[sequenza indice]-trasposasi sequenza-3'Ad2.22_TGGTCACA</td></tr><tr><td>: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td><td>Ad2.22_expected sequenza indice read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposasi sequence-3'Ad2.23_TTGACCCT</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.23_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'Ad2.24_CCACTCCT</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.24_expected sequenza indice read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'F1</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mappatura del genoma della cromatina accessibile in linfociti t umani primari da atac-seq

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Dosaggio per cromatina Transposase-accessibile con sequenziamento ad alta produttività (ATAC-seq) è un metodo utilizzato per l'identificazione di regioni aperte (accessibile) della cromatina. Queste regioni rappresentano elementi di DNA regolatori (ad es., promotori, enhancers, locus control regioni, Isolatori) a cui trascrizione si legano fattori. Il paesaggio di cromatina accessibile la mappatura è un approccio potente per scoprire elementi regolatori attivi in tutto il genoma. Questa informazione serve come un approccio imparziale per scoprire la rete di fattori di trascrizione pertinenti e meccanismi della struttura della cromatina che governano programmi di espressione genica. ATAC-seq è un'alternativa robusta e sensibile alla dnasi analisi di ipersensibilità accoppiato con formaldeide-assistita isolamento di elementi regolatori (FAIRE-seq) per l'analisi del genoma della cromatina e sequenziamento di nuova generazione (DNasi-seq) accessibilità e per il sequenziamento di micrococcal siti sensibili nucleasi (MNase-seq) per determinare il posizionamento nucleosoma. Vi presentiamo un dettagliato protocollo di ATAC-seq ottimizzato per cellule umane primarie immuni cioè CD4 + linfociti (T helper 1 (Th1) e cellule Th2). Questo protocollo completo inizia con la raccolta delle cellule, quindi descrive la procedura molecolare di cromatina tagmentation, preparazione del campione per il sequenziamento di nuova generazione e include anche metodi e considerazioni per l'analisi computazionali utilizzati per interpretare i risultati. Inoltre, per risparmiare tempo e denaro, abbiamo introdotto misure di controllo di qualità per valutare la libreria ATAC-seq prima del sequenziamento. Importante, i principi esposti nel presente protocollo consentono il suo adattamento ad altre cellule primarie umane immuni e non immuni e linee cellulari. Queste linee guida sarà anche utile per i laboratori che non sono abili con metodi di sequenziamento di nuova generazione.

Il risultato finale di questo protocollo è una libreria di ATAC-seq di in genere 3-20 ng / µ l. Quando eseguito su un sistema per l'analisi dell'integrità del DNA (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature), essi mostrano la scala-come l'apparenza2 (Figura 3A). La dimensione media dei frammenti del DNA è in genere ~ 450-530 bp.
Controllo di qualità adeguata del...

Analisi per Transposase-accessibile della cromatina accoppiato con sequenziamento ad alta produttività (ATAC-seq) è un metodo di genoma per scoprire accessibile della cromatina. Questo è un protocollo di ATAC-seq passo dopo passo, da molecolari all'analisi computazionale del finale, ottimizzato per i linfociti umani (Th1/Th2). Questo protocollo può essere adottato da ricercatori senza precedente esperienza nei metodi di sequenziamento di nuova generazione.

Mappatura del genoma della cromatina accessibile in linfociti T umani primari da ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

L'obiettivo generale di questo metodo ad alto rendimento che utilizza la trasposasi è identificare le regioni della cromatina accessibili nel genoma umano. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi dell'epigenomica, come le posizioni degli elementi regolatori a livello di genoma. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è robusta, relativamente corta e richiede meno materiale di partenza rispetto ad altri metodi di misurazione dell'accessibilità della cromatina come DNase-seq o FAIRE-seq.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul panorama normativo dei linfociti T umani, può essere applicato anche ad altri sistemi come altre cellule primarie umane, cellule tumorali, campioni clinici umani, cellule di altri mammiferi e organismi. Scongelare un'aliquota di un millilitro di 10 milioni di PBMC umani e trasferirla in una provetta da 50 millilitri contenente 10 millilitri di terreno RPMI integrato. Centrifugare le celle a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Successivamente, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 15 millilitri di terreno RPMI integrato. Quindi, trasferire le cellule in un pallone di coltura T-75 e incubar

mapping-genome-wide-accessible-chromatin-primary-human-t-lymphocytes

Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

La combinazione di immunoprecipitazione della cromatina e sequenziamento ultra-high-throughput (ChIP-seq) in grado di identificare e mappare le interazioni proteina-DNA in una determinata linea di tessuti o cellule. Delineato è come generare un modello di chip per la successiva sequenza di alta qualità, utilizzando l'esperienza con il fattore di trascrizione TCF7L2 come esempio.

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina Template DNA di alta qualità per high-throughput sequencing (ChIP-Seq)

Descriviamo un protocollo passo-passo per la cromatina tandem immunoprecipitazione sequenziamento (tChIP-Seq) che permette l'analisi di modifica dell'istone di genoma di cellula-tipo-specifico.

TChIP-Seq: Cellula-tipo-specifico Epigenome profilatura

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire un test per transposase-accessibile della cromatina (ATAC-seq) la sequenziazione su linfociti CD4 + umani. Il protocollo è stato modificato per ridurre al minimo la contaminazione letture di DNA mitocondriale dal 50% al 3% attraverso l'introduzione di un nuovo buffer di lisi.

ATAC-seq analisi con DNA mitocondriale bassa contaminazione da primaria umana CD4 + linfociti T

Qui, gli autori mostrano l'utilità di MULTI-seq per la fenotipizzazione e il successivo accoppiato scRNA-seq e scATAC-seq nel caratterizzare i profili di accessibilità trascrittomica e cromatina nella retina.

Analisi multiplexata dell'espressione genica retinica e dell'accessibilità alla cromatina utilizzando scRNA-Seq e scATAC-Seq

ATAC-seq è un metodo di sequenziamento del DNA che utilizza la trasposasi mutante iperattiva, Tn5, per mappare i cambiamenti nell'accessibilità della cromatina mediati da fattori di trascrizione. ATAC-seq consente la scoperta dei meccanismi molecolari alla base delle alterazioni fenotipiche nelle cellule tumorali. Questo protocollo delinea le procedure di ottimizzazione per ATAC-seq nei tipi di cellule epiteliali, comprese le cellule tumorali.

Ottimizzazione ATAC-Seq per la ricerca sull'epigenetica del cancro

Presentiamo un protocollo per il dosaggio della cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alto rendimento (ATAC-seq) specificamente sugli adipociti utilizzando la selezione del nucleo con tessuti adiposi isolati da topi reporter transgenici con marcatura a fluorescenza nucleare.

ATAC-seq adipocita-specifico con tessuti adiposi mediante selezione del nucleo attivato dalla fluorescenza

Qui, presentiamo un protocollo che descrive la preparazione dei nuclei cellulari. Dopo la microdissezione e la dissociazione enzimatica del tessuto cardiaco in singole cellule, le cellule progenitrici sono state congelate, seguite dall'isolamento di cellule vitali pure, che sono state utilizzate per il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo e dal test a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi con analisi di sequenziamento ad alto rendimento.

Isolamento di nuclei da cellule progenitrici cardiache di topo per il profilo dell'epigenoma e dell'espressione genica a risoluzione di singole cellule

Questo manoscritto delinea un protocollo per la preparazione di una libreria ATAC-seq di neutrofili da midollo osseo murino, con l'obiettivo di garantire una vitalità ottimale dei neutrofili e un'elevata qualità della libreria. Offre istruzioni dettagliate sulla preparazione del BMC, lo smistamento immunomagnetico e la costruzione di librerie, fungendo da guida preziosa, soprattutto per i neofiti dello studio dei neutrofili.

Libreria ATAC-Seq Preparazione di neutrofili derivati dal midollo osseo murino

Qui presentiamo un protocollo ATAC-seq rapido e semplice da implementare nel verme intero Caenorhabditis elegans a stadio L4 utilizzando solo 30 μL di pellet di verme.

Profilazione dell'accessibilità della cromatina in larve intere di Caenorhabditis elegans L4

Descriviamo qui un approccio relativamente veloce e semplice per mappare i tempi di replicazione dei mammiferi a livello di genoma, dall'isolamento cellulare all'analisi di base dei risultati del sequenziamento. Verrà fornita una mappa genomica di un programma di replicazione rappresentativo seguendo il protocollo.

Determinazione genoma a livello di timing di replicazione del DNA dei mammiferi da contenuti di misura

Scopri il protocollo ATAC-seq per mappare la cromatina accessibile nei linfociti T umani primari. Questo metodo robusto richiede poco materiale di partenza e permette di identificare elementi regolatori a livello genomico.

Mappatura del genoma della cromatina accessibile in linfociti T umani primari da ATAC-Seq

Esplora altri video