Mappatura del genoma della cromatina accessibile in linfociti T umani primari da ATAC-Seq

L'obiettivo generale di questo metodo ad alto rendimento che utilizza la trasposasi è identificare le regioni della cromatina accessibili nel genoma umano. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi dell'epigenomica, come le posizioni degli elementi regolatori a livello di genoma. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è robusta, relativamente corta e richiede meno materiale di partenza rispetto ad altri metodi di misurazione dell'accessibilità della cromatina come DNase-seq o FAIRE-seq.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul panorama normativo dei linfociti T umani, può essere applicato anche ad altri sistemi come altre cellule primarie umane, cellule tumorali, campioni clinici umani, cellule di altri mammiferi e organismi. Scongelare un'aliquota di un millilitro di 10 milioni di PBMC umani e trasferirla in una provetta da 50 millilitri contenente 10 millilitri di terreno RPMI integrato. Centrifugare le celle a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Successivamente, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 15 millilitri di terreno RPMI integrato. Quindi, trasferire le cellule in un pallone di coltura T-75 e incubarle per una notte con umidificazione. Il giorno successivo, trasferire le cellule galleggianti con una pipetta sterile da 25 millilitri in una provetta da 50 millilitri.

Quindi, contare le cellule viventi utilizzando l'esclusione del blu di tripano. Successivamente, isolare le cellule CD4 positive da 10 milioni di PBMC viventi non aderenti utilizzando una colonna di separazione a microsfere. Una volta isolate le cellule, piastreggiare e attivare le cellule T in condizioni di polarizzazione Th1 e Th2 secondo il protocollo di testo, quindi isolare i loro nuclei.

Per essere, preparare un tampone di lisi fresco e tenerlo fresco su ghiaccio. Inoltre, in preparazione alla reazione di trasposizione, riscaldare un agitatore termico a 37 gradi Celsius. Quindi, caricare mezzo milione di cellule T in microprovette da 1,5 millilitri e farle girare a 500 Gs per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Quindi, lavare le cellule con un millilitro di PBS freddo e ripetere la centrifuga, ma ora sospendere le cellule in un millilitro di tampone di lisi fredda. Mescolare le cellule con un pipettaggio delicato per evitare che i nuclei vengano disturbati troppo. Quindi, prendi rapidamente aliquote da 10 microlitri per osservare la frazione di lisi delle cellule.

Assicurati di mantenere le celle fredde e di lavorare rapidamente. Entro cinque minuti, procedere con la reazione di trasposizione. Per iniziare, trasferire 100.000 nuclei in una microprovetta da 1,5 millilitri e centrifugare il campione a 500 Gs per 10 minuti in una centrifuga fredda.

Quindi, rimuovere delicatamente il surnatante. Quindi, aggiungi i componenti della reazione di trasposizione ai nuclei. Quindi, risospendere i nuclei con un pipettaggio delicato e incubare i nuclei sull'agitatore termico a 500 RMP per 30 minuti per completare la reazione di trasposizione.

Successivamente, eseguire una fase di pulizia del DNA ed eluire i frammenti di DNA in 20 microlitri di Tris cloridrato. Quindi, utilizzare una PCR per effettuare un'amplificazione iniziale delle librerie di sequenziamento ATAC. Successivamente, valutare il numero ottimale di cicli aggiuntivi necessari per l'amplificazione finale mediante PCR quantitativa.

Dai risultati misurati, determinare il numero di cicli necessari per l'amplificazione PCR finale delle librerie di sequenziamento ATAC. Quindi, eseguire l'amplificazione finale. L'impostazione di una dimensione ottimale dei frammenti della libreria di DNA può migliorare il sequenziamento di nuova generazione.

Per prima cosa, riscalda le perle magnetiche a temperatura ambiente e prepara etanolo fresco al 70% in acqua priva di nucleasi. Successivamente, aggiungere acqua priva di nucleasi alle librerie di sequenziamento ATAC fino a un volume di 100 microlitri. Quindi, aggiungere 50 microlitri di perle magnetiche leganti il DNA risospeso.

Pipettare le perle nel DNA almeno 10 volte e attendere cinque minuti. Se gocce di perline rimangono incastrate sulla parete del tubo o sul coperchio, far girare brevemente il tubo. A questo punto, posizionare il campione accanto al magnete per due minuti, quindi trasferire il surnatante in una nuova microprovetta.

Misurare il volume della collezione e aggiungere un volume del 70% di sospensione di perline magnetiche. Mescolate le perline come prima e lasciatele incubare per cinque minuti prima di procedere. Quindi, separare le perline usando il magnete per due minuti e ora scartare il surnatante.

Mentre sei ancora contro il magnete, aggiungi 200 microlitri di etanolo al 70% alle perline. Attendere 30 secondi, quindi scartare l'etanolo e ripetere ancora una volta il lavaggio con etanolo. Termina i lavaggi rimuovendo completamente l'etanolo rimanente e lasciando asciugare le perle all'aria per cinque minuti sul magnete.

Se necessario, far girare brevemente la provetta e aspirare l'eventuale etanolo visibile con una pipetta da 10 microlitri. Ora, rimuovi il tubo dal magnete e aggiungi 22 microlitri di Tris cloridrato. Dopo due minuti, rimettere il tubo nel supporto magnetico e lasciare che la soluzione si liberi.

Quindi, raccogli 20 microlitri di eluato contenente la libreria preparata e conservala a meno 20 gradi Celsius. Questo protocollo produce librerie di sequenziamento ATAC che in genere vanno da tre a 20 nanogrammi per microlitro. Quando vengono eseguiti su un sistema per l'analisi dell'integrità del DNA, hanno un aspetto simile a una scala.

Tra gli altri, un altro importante controllo di qualità è l'arricchimento dei controlli positivi. Rispetto ai controlli negativi, la coppia di primer tre deve essere arricchita di almeno 25 volte e la coppia di primer quattro deve essere arricchita di almeno 75 volte. Dopo 10 milioni di letture iniziali, se il campione supera tutti i parametri cruciali nel file di report FastQC e si ottengono da 1.000 a 2.000 picchi dalla chiamata dei picchi, la libreria può essere sequenziata in modo più approfondito per oltre 30 milioni di letture.

Dalle biblioteche che soddisfano gli standard di qualità, solo dal 6 al 20% delle reads corrisponde al genoma mitocondriale. Le restanti letture uniche corrispondono al genoma umano di riferimento e dal 7 al 12% rientrano nei picchi di sequenziamento ATAC. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare librerie ATAC-seq, inviare e fornire il sequenziamento delle razioni e analizzare i dati ottenuti.

Una volta padroneggiata, la preparazione della libreria ATAC-seq può essere eseguita in uno o due giorni lavorativi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che forse sarà necessario prima ottimizzare alcuni passaggi come il numero di cellule e la composizione del tampone di lisi in una fase di isolamento dei nuclei. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'immunoprecipitazione della cromatina per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quale fattore di trascrizione si lega alle regioni aperte della cromatina nei campioni esaminati?