Name: Metodi per pH intracellulare Imaging del lignaggio di cellule staminali del follicolo in Live tessuto ovarico di Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Scopri l'imaging del pH intracellulare nelle cellule staminali follicolari di Drosophila in tessuto ovarico vivo. Questo metodo quantitativo consente di studiare la dinamica del pH nelle decisioni cellulari.

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Ringraziamo Bryne Ulmschneider per i contributi per il protocollo e Diane Barber per suggerimenti sul manoscritto. Quest'opera è stata finanziata da un Istituto nazionale di sovvenzione di salute GM116384 a T.G. Nystul e D.L. Barber.

Nota: per misurare pHi del lignaggio di FSC, noi calcolare il rapporto di intensità di fluorescenza di pHluorin a mCherry in FSCs, PFC e le cellule del follicolo in condizioni fisiologiche e convertire i rapporti in valori di pHi con standard curve di calibrazione per ogni cella tipo 7. Primi, live imaging esperimenti sono effettuati per misurare l'intensità di fluorescenza di pHluorin e mCherry in germaria dissecato in un tampone contenente NaHCO 3, che simula condizioni fisiologiche 1 , 7. prossime, standard curve sono generate dalla misura pHluorin e mCherry intensità di fluorescenza in un Na +-libero, K + tampone contenente la Nigericina ionoforo regolato a due valori di pH diversi, 6.5 e 7.5. In presenza di Nigericina, pHi equilibra con il pH del tampone attraverso la membrana plasmatica, causando pHi abbinare il pH extracellulare. Infine, le curve standard vengono utilizzate per convertire pHluorin ai rapporti mCherry ai valori stimati pHi.
 1. pre-Trial: pHi preparazione prima di misurare In Vivo Nota: per misurare pHi in vivo, il transgene mCherry::pHluorin deve essere espresso nel tipo di cella di interesse. Di seguito sono alcuni dei modi comuni per generare transgenici pHluorin mosche del lignaggio di FSC. Generazione di cloni di mCherry::pHluorin è particolarmente utile per identificare FSCs, che si trovano sul bordo anteriore di un clone FSC. Espressione tessuto specifica mCherry::pHluorin è utile per misurare pHi attraverso l'intero tessuto ed è anche più conveniente quando si combinano con l'espressione di un RNAi o transgene.
<ol><li>Voli della generazione di transgenici pHluorin <ol><li>mCherry::pHluorin-etichettati FSC cloni <ol><li>fare mCherry::pHluorin FSC cloni, attraversare UAS-mCherry::pHluorin 1 a un atto-Gal4 flipout o di altro magazzino con un Flp/FRT viscoelastica Gal4.</li>
			<li>Per rendere heatshock cloni inducibili, heatshock F1s adulti per 2 giorni post eclosion in flaconcini vuoti per 1 h a bagnomaria a 37 ° C, quattro volte circa ogni 12 h.</li>
			<li>Per garantire la normale crescita e tassi massimi di oogenesi durante questo periodo, mantenere mosche fornendo lievito fresco bagnato (parti approssimativamente uguali a secco baker &#39; s lievito e acqua) al giorno per almeno 6 giorni dopo l'induzione di clone.</li>
		</ol></li> <li>Espressione tessuto specifica mCherry::pHluorin</li> <li>Cross UAS-mCherry::pHluorin 1 a un follicolo cella driver specifico, y 1 w *; P {GawB} 10930/CyO (Bloomington ID: 7023).</li>
		<li>3 giorni dopo mosche avviato schiusura, raccogliere e metterli in flaconcini contenenti lievito bagnato, per almeno 24 h prima della dissezione.</li>
	</ol></li> <li>Rendendo le soluzioni Nota: è importante preparare i buffer seguenti il giorno dell'esperimento, perché le concentrazioni di pH e soluto nel buffer possono cambiare nel tempo.
	<ol><li>Preparare buffer bicarbonato, Nigericina e dissezione. Aggiungere i componenti nell'ordine elencato per evitare la formazione di precipitati (vedere tabella 1, tabella 2 e tabella 3).</li>
	</ol></li></ol> 2. Trial: Misurazione pHi del lignaggio di FSC Nota: la dissezione, montaggio e dal vivo imaging passaggi per la soluzione tampone del bicarbonato e le due condizioni di buffer Nigericina potrebbe essere necessario essere eseguita due volte: una volta per determinare il microscopio impostazioni e una seconda volta per raccogliere i dati sperimentali. Vedere la sezione 2.2 qui sotto per ulteriori informazioni.
<ol><li>Dissezione e montaggio Nota: per i materiali necessari per eseguire questa operazione fare riferimento alla Figura 1 e Tabella materiali. Per le camere di montaggio stampato 3D, stampante 3D file vengono forniti come supplementare File 1 e 2 File supplementari.
	<ol><li>Dissezione: <ol><li>chambers montaggio Prepare applicando un sottile strato di grasso per vuoto al lato più piatto del 3D stampato camera di montaggio. Collocare quel lato su un vetrino coprioggetti 22 x 40 mM per sigillare il coprioggetto alla camera montaggio.</li>
		</ol></li> <li>Sezionare le ovaie da mosche adulte femminile in 500 µ l di tampone di dissezione (buffer di bicarbonato o Nigericina, tabella 3) <ol><li>anestetizzare 3-4 mosche usando gas di CO 2 e trasferimento vola su un blocchetto di volare irrorato con CO 2 gas.</li>
			<li>Pick up una Mosca anestetizzata con forcipe e posto nel supporto di dissezione.</li>
			<li>Pizzicare il torace della Mosca con una pinza, mentre tirando sulla punta del suo addome, fino a quando le ovaie sono esposti.</li>
			<li>Dopo aver scollegato le ovaie da altri organi, prendono in giro a pezzi il ovarioles utilizzando 22 1/2 aghi di siringhe. Accuratamente separato il muscolo guaina da ovaie e ovarioles individuale separato dal cluster di ovarioles. Una tecnica efficace per isolare la guaina del muscolo è quello di utilizzare una siringa per tenere il cluster di ovarioles posto alla sua estremità anteriore e corsa verso il basso lungo la lunghezza del singolo ovarioles.</li>
			<li>Incubare le ovaie dissecate nei media di dissezione per esattamente 10 min prima di procedere con il passo di montaggio affinché ci sia tempo sufficiente per il pHi di cellule completamente equilibrare con il pH dei media dissezione Nigericina. 
			Nota: Assicurarsi che la guaina del muscolo viene rimosso dall'ovarioles. La guaina del muscolo può attenuare il segnale di fluorescenza, che lo rende difficile identificare singole celle utilizzando Concanavilin-A e può causare ovarioles muoversi spontaneamente durante la formazione immagine live.</li>
		</ol></li> <li>Di montaggio <ol><li>mettere una piccola goccia di media di dissezione sul vetrino coprioggetti all'interno della camera di montaggio.</li>
			<li>Trasferimento separati usando il forcipe ovarioles.</li>
			<li>Separare più tardi chambers di uovo di fase da germaria associato con gli alloggiamenti di uovo fase precedente e cercare di garantire che il germaria dissecata sono collocati al centro della goccia media dissezione.</li>
			<li>Aggiungere due piccole gocce di smalto ai lati opposti di un tondo 12mm vetrino coprioggetto e lasciarlo asciugare per circa 10 s.</li>
			<li>Posto al turno coprioggetto sul drop di file multimediali di dissezione contenenti separati germaria tale che quel lato con smalto rivolto verso il basso e contatta il supporto di dissezione. Premere verso il basso sulle parti del bordo con smalto per unghie per appiattire e garantire la germaria in posizione. Si consiglia di utilizzare il vecchio smalto perché esso strisci meno sopra la superficie del coprivetrino come è stato fissato in luogo.</li>
			<li>Riempire la camera di montaggio con supporto di ulteriori dissezione. Buffer specifico a condizione che non contenga concanavalina-un colorante può essere utilizzato per riempire la camera. 
			Nota: Il tempo totale trascorso da dissezione e montaggio non deve superare i 15 min. Questo è importante per ridurre al minimo gli effetti del danno tissutale e morte cellulare.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Live imaging: Nota: In questo passaggio, prima di raccogliere immagini dalla condizione di bicarbonato e le due condizioni di Nigericina per determinare le impostazioni di microscopio corretto; regolare le impostazioni di microscopio come necessario, e poi raccogliere immagini per i dati sperimentali. Utilizzare un microscopio confocale capace di imaging a 3 canali: GFP (475 eccitazione/509 emissione), mCherry (575 emissione di eccitazione/610) e da' (633 eccitazione/647 emissione). 
	Nota: Le impostazioni del microscopio Set: le intensità di pixel delle immagini raccolte saranno quantificate per determinare le stime di pHi, quindi è importante che i valori di intensità del segnale in ogni set di immagine è né troppo basso né saturo. La gamma di intensità che può essere catturata in un'immagine è definita dalla profondità di bit di immagine. In molti casi, immagini a 8 bit vengono generati per impostazione predefinita, ma si consiglia di acquisire i dati come immagini a 16 bit, che hanno una gamma dinamica più ampia. È importante garantire che la diafonia tra i canali fluorescente è ridotto al minimo, quindi le impostazioni dovrebbero essere regolate in modo che lo spettro di emissione raccolti da ogni fluoroforo non si sovrappongono. Per verificare queste impostazioni, prendere un'immagine di esempio utilizzando lo spettro di eccitazione per GFP e raccogliere nello spettro di emissione per mCherry e viceversa. Se le impostazioni sono state regolate correttamente, non ci dovrebbe essere nessun segnale in entrambi i casi. Impostare le impostazioni di microscopio (cioè, le impostazioni di tensione su una scansione laser confocale, laser potenza e pinhole dimensioni) affinché le intensità di pixel del segnale in tutti gli insiemi di tre immagini sono all'interno della gamma dinamica del file immagine. Per tutti i nostri esperimenti, abbiamo utilizzato un laser luce bianco microscopio confocale con un obiettivo 40x di acquisire immagini a 16 bit in 1.024 × 1.024 formato, mentre abbiamo ottimizzato il guadagno di tensione per ogni esperimento come necessario. Ad esempio, in un esperimento, abbiamo impostato il guadagno di tensione per GFP, mCherry e da' come 37,8% 72.9% e 260%, rispettivamente.
	<ol><li>Immagine ovarioles nel buffer di dissezione Nigericina a pH 6,5 e regolare le impostazioni di tale intensità di pixel delle immagini pHluorin e mCherry sono basse, ma non sotto i limiti di rilevazione della fotocamera.</li>
		<li>Un altro set di ovarioles nel buffer di dissezione Nigericina a pH 7.5 di immagine e regolare le impostazioni in modo che le intensità di pixel delle immagini pHluorin e mCherry sono alti, ma non saturo.</li>
		Ovaie di immagine <li>nella dissezione di bicarbonato nel buffer e garantiscono che le intensità di pixel delle immagini pHluorin e mCherry non sono saturi con le impostazioni scelte. Se i pixel sono saturi, regolare le impostazioni come necessario. 
		Nota: Microscopio impostazione parametri possono differire basato sulla messa a punto esatta microscopio utilizzato e deve essere ottimizzata per ogni esperimento. Dopo aver impostate le impostazioni microscopio, non cambiare per il resto dell'esperimento. Le impostazioni dovrebbero essere coerenti tra controllo e condizioni sperimentali. Nei nostri esperimenti iniziali pHi, abbiamo generato le curve di calibrazione Nigericina punto 2 e 3 e abbiamo trovato alcuna differenza significativa tra pHi calcolata utilizzando entrambi i metodi. Tuttavia, in generale, l'aggiunta di ulteriori punti della curva di calibrazione dovrebbe migliorare l'accuratezza. Si consiglia pertanto, generando curve con un diverso numero di punti per determinare quanti sono necessari per un determinato insieme di condizioni sperimentali.</li>
	</ol></li> <li>Raccolta dei dati: <ol><li>eseguire la dissezione, montaggio e imaging dei campioni nelle condizioni di buffer bicarbonato e Nigericina. Dopo dissezione e montaggio, il tempo massimo trascorso un set di campioni di imaging non deve superare 45 min per garantire che le misure di intensità di fluorescenza sono realizzate in tessuto sano, live.</li>
		<li>Per ogni condizione, acquisizione di immagini per almeno 5 germaria.</li>
	</ol></li></ol> 3. Post-trial: Analisi delle immagini <ol><li>intensità di fluorescenza di misura in FSCs, PFC e le cellule del follicolo <ol><li>sfondo sottrazione: <ol><li>Open non trasformati immagini in FIJI con ogni canale in una finestra separata ( Figura 4).</li>
			<li>Utilizzare lo strumento rettangolo per disegnare un'area di interesse (ROI) nella finestra del canale pHluorin in una parte dell'immagine senza segnale.</li>
			Passo <li>opzionale: impostare il limite inferiore della soglia in modo che i pixel con valori di intensità sotto sfondo sono esclusi e impostare il limite massimo della soglia massima. Quando la soglia è impostata in questo modo, le aree dell'immagine senza segnale sono per lo più blue e il segnale è chiaramente visibile ( Figura 4A).</li>
			<li>Misura l'intensità media di fluorescenza nel ROI. Se la soglia è stata impostata nel passaggio 3, assicuratevi di controllare il &#34; limite di soglia &#34; casella nella finestra di dialogo impostare misure.</li>
			<li>Sottrarre l'intensità di fondo misurata da ogni canale e la fetta dell'immagine utilizzando la funzione Subtract, trovata nel processo &#8594; menu di Math.</li>
			<li>Ripetere passaggi 3.1.1.2-6 per la finestra del canale mCherry tranne che, nel passaggio 3.1.1.2, invece di disegnare un nuovo rettangolo con lo strumento rettangolo, utilizzare la funzione di selezione di ripristino, trovato nella finestra modifica &#8594; menu di selezione, per aggiungere un rettangolo con lo stesso dimensioni e posizione sull'immagine.</li>
		</ol></li> <li>Identificare FSCs, PFC e le cellule del follicolo: <ol><li>identificare il FSCs, PFC e le cellule del follicolo di morfologia e posizione utilizzando la macchiatura della concanavalina-A trovare limiti di cella ( Figura 2).</li>
			<li>FSCs sono sottili celle triangolari situate sul bordo del germarium al confine di regione 2a/2b. Se mCherry::pHluorin è espresso in un clone FSC, FSC può essere identificata anche come la maggior parte delle cella anteriore del clone.</li>
			<li>PFC sono cellule a forma irregolare nella regione 2b, immediatamente adiacente e a valle del FSCs.</li>
			<li>Le cellule del follicolo sono quadrate o colonnare cellule che circondano la ciste delle cellule di germe in regione 3.</li>
		</ol></li> <li>Ottenuto fluorescenza intensità quozienti <ol><li>scegliere una o più sezioni in cui la cella di interesse ha la più alta intensità di fluorescenza nel canale mCherry e assicurarsi che la concanavalina-A colorazione, visto nel canale da', sia nel foc noi all'interno della slice selezionata.</li>
			<li>ROI disegnare intorno ogni FSC e misura l'intensità media di fluorescenza di pHluorin e mCherry in tutte le fette selezionata per misurazioni.</li>
			<li>Dividere l'intensità media di fluorescenza del canale pHluorin dall'intensità media di fluorescenza del canale mCherry per calcolare un rapporto di pHluorin a fluorescenza mCherry.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>PHi derivare valori e generare immagini pseudocolored <ol><li>valori pHi Derive <ol><li>In tutti i casi, la curva di regressione lineare deve essere generata utilizzando ovaie da mosche dello stesso genotipo per entrambi sperimentale e condizioni di controllo. Generare una curva di regressione lineare per ogni tipo di cellula utilizzando i dati da due condizioni di buffer Nigericina ( Figura 3). In Excel, questo può essere fatto tracciare i dati in un grafico e aggiungendo una linea di tendenza lineare. In alternativa, vedere:</li> <li>uso la pendenza e l'intercetta y della curva di regressione lineare calcolate dalle condizioni Nigericina e l'equazione di una retta (y = mx + b) per convertire il pHluorin mCherry rapporto valori calcolati dai campioni nel bicarbonato condizione per valori di pH. In questa equazione, sostituire il modulo di pendenza (l'intercetta y) per b, immettere il valore rapporto per x e risolvere per y.</li>
		</ol></li> <li>Generare un'immagine pseudocolored che riflette i valori di rapporto in FIJI.
		<ol><li>Seguire la procedura descritta sopra per sottrazione di sfondo (passaggio 3.1.1 e Figura 4).</li>
			<li>Divide il canale di pHluorin dal canale mCherry utilizzando la funzione di immagine calcolatrice, trovata nel menu processo. Essere sicuro che il &#34; finestra Crea nuovo &#34; e &#34; risultato a 32 bit (float) &#34; caselle di controllo siano entrambe selezionate. Modificare la tabella di ricerca (LUT), trova nel menu immagine, termico o LUT di scelta. Vedere la Figura 4 per altre opzioni adatte.</li>
			<li>Nella finestra di dialogo Regola luminosità e contrasto (immagine &#8594; regolare &#8594; luminosità/contrasto), fare clic il &#34; Set &#34; pulsante. Set minimo visualizzato valore su 0 e il massimo valore visualizzato in un rapporto che meglio cattura i dati, solitamente 1.0-2.0 ( Figura 5).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+H%2B+efflux+is+sufficient+to+induce+dysplasia+and+necessary+for+viability+with+oncogene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression.</a> eLife. 03270, (2015).</li>
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<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neuro%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in neuro. 24 (5), 251-254 (2001).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, descriviamo un metodo per misurare il pHi di cellule del lignaggio di FSC all'interno del tessuto wildtype. Questo protocollo è stato sviluppato e perfezionato negli ultimi cinque anni, da quando abbiamo iniziato a studiare pHi in tessuto ovarico di Drosophila . Durante quel tempo, il protocollo è stato utilizzato con successo da più ricercatori nel nostro laboratorio e su almeno quattro diversi filatura disc e microscopi a scansione laser. La riproducibilità della nostra osservazione originale, che pHi aum...

Studi recenti hanno rivelato un ruolo per le modifiche a pHi durante cellulari displasia e differenziazione in vivo1,2. Questi studi hanno trovato che pHi è notevolmente coerenti in cellule dello stesso tipo nella stessa fase di differenziazione, ma che cambia come le cellule di transizione da una fase a altra. In alcuni casi, bloccando le modifiche a pHi parzialmente sconvolge la differenziazione, suggerendo che il cambiamento a pHi non è solo una conseguenza di cambiamenti nel destino della cellula ma invece aiuta a promuovere il cambiamento nel destino della cellula, magari attraverso effetti sulla regolamentazione sensibili al pH proteine o reazioni chimiche necessarie per la differenziazione. Gli studi futuri hanno il potenziale per rivelare più comprensione nei molti ruoli diversi di pHi dynamics in vivo. Tuttavia, una delle sfide di studiare pHi durante il differenziamento in vivo è ottenere misurazioni accurate di pHi. A differenza di altre caratteristiche di differenziazione, quali i cambiamenti nella morfologia cellulare e l'espressione genica, pHi è una proprietà chimica labile della cella che non viene mantenuta in cellule che sono stati corretti e permeabilizzate con metodi standard. Inoltre, pHi può non essere stabile in cellule che sono stressate o morente a seguito di manipolazione sperimentale. Pertanto, è importante mantenere le cellule in vivo e sano come possibile durante la misurazione pHi. Diversi coloranti vitali sono disponibili che funzionano bene per misurare il pHi di cellule in cultura3, ma in molti casi essi non sono adatti per in vivo studi perché non penetrano il tessuto profondamente o uniformemente abbastanza per fornire misurazioni accurate .
Per aggirare il problema della penetrazione del colorante scadente, noi ed altri abbiamo usato una sonda codificata geneticamente, mCherry::pHluorin4,5,6,7, che può essere espressa in particolare nella cella tipi di interesse e imaged in tessuto vivo. pHluorin è una variante del GFP con un pKa più alto (~ 7.0 vs ~ 4.0) che si piega più facilmente a pH più alto; così l'intensità di fluorescenza totale emessa da una popolazione di molecole di pHluorin nella cella aumenta con l'aumentare di pHi8. D'importanza, la fluorescenza è lineare nel range di normalità citosolico di valori di pHi. In contrasto, la fluorescenza della mCherry (pKa ~ 4.5) è insensibile ai cambiamenti di pH all'interno della gamma citosolica. Questi due giornalisti sono covalentemente insieme come una singola proteina chimerica, codificata da un telaio di sola lettura aperta, in modo che sempre sono presenti in quantità uguali. Di conseguenza, il rapporto di pHluorin per l'intensità di fluorescenza mCherry fornisce una misura del pHi che è normalizzato per la concentrazione di sonda in ogni cella. I rapporti possono quindi essere convertiti alle stime dei valori di pHi utilizzando una curva standard che viene generata ottenendo il pHluorin ai rapporti mCherry da tessuti che sono stati equilibrati a valori di pH noto.
Qui, descriviamo i metodi per l'utilizzo di mCherry::pHluorin per misurare il pHi del lignaggio FSC epiteliale nell'ovaia di Drosophila . Questo tessuto ben caratterizzato è stato utilizzato per modellare i diversi aspetti della biologia, epiteliale, quali cellule staminali auto-rinnovamento e differenziazione9,10,11, migrazione cellulare collettiva12 , lo sviluppo e la manutenzione del cellulare polarità13,14. L'epitelio del follicolo è prodotto da due FSCs che risiedono al bordo anteriore del tessuto in una struttura denominata il germarium15,16. Queste cellule si dividono regolarmente durante l'età adulta di auto-rinnovarsi e produrre prole, chiamate cellule prefollicle (PFC), che possono immettere nuovamente la nicchia e diventare un FSC o differenziarsi in uno dei tre tipi di cellule del follicolo diversi: polare cellule, cellule di gambo, o cellule del follicolo di corpo principale. Abbiamo indicato precedentemente che nel tessuto wildtype, il pHi aumenta costantemente durante le prime fasi di differenziazione, da un pHi di circa 6.8 in FSCs a 7.0 in PFC, a 7,3 nel follicolo celle2. Bloccando questo aumento di RNAi atterramento di uno scambiatore sodio/protone espressa ubiquitariamente, DNhe2, severamente altera la differenziazione di pFC, considerando che l'aumento di pHi di sovraespressione di DNhe2 provoca una lieve differenziazione in eccesso fenotipo. Questi risultati dimostrano che pHi è mantenuto stabile nel lignaggio FSC precoce e che può essere sperimentalmente aumentata o diminuita in vivo. I metodi descritti qui possono essere utilizzati per misurare pHi in tessuto wildtype o varie forme di tessuti mutante, compreso atterramento di RNAi o sovraespressione utilizzando un Gal4 di interesse e cloni mitotici.

<table><tbody><tr><td>Fly Stocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UAS-mCherry::p Hluorin[1]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>y1 w*; P{GawB}10930/CyO</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>7023</td><td></td></tr><tr><td>Act-Gal4 flipout stock</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>4409</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Chemicals for Buffer preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-3911</td><td></td></tr><tr><td>glucosio</td><td>Mallinckrodt</td><td>4912</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>HCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-9272</td><td></td></tr><tr><td>NMDG+</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-2004</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>7088</td><td>Utilizzare per fare KHPO4 pH 7.4</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP362</td><td>Utilizzare per fare KHPO4 pH 7.4</td></tr><tr><td>Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Coniugato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C21421</td><td>Diluizione 0,25 mg/ml</td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N1495</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Strumenti di dissezione e montaggio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 Dumont Pinze in acciaio inox (misura 5)</td><td>Thermo Fisher Scientific NC9473431</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 aghi per siringa calibro 23 Piastra</td> da dissezione <td>in vetro Sigma Aldrich</td><td>Z192457</td><td></td></tr><tr><td>9 pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-748B</td><td></td></tr><tr><td>Grasso per vuoto</td><td>Dow Corning</td><td>1018817</td><td></td></tr><tr><td>22 vetrini da 40 mM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12545C</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti rotondi, diametro 12 mm, spessore 0,13-0,16 mm</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>26023</td><td></td></tr><tr><td>Camera di montaggio 3D</td> custom <td>manufactured.stl</td><td></td> <td>e .ipt files per stampante 3D inclusi come file supplementari</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Other equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di pH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-620-183A</td><td>Modello: Accumet AB15</td></tr><tr><td>Microscopio di dissezione</td><td>Olympus Corporation</td><td>0H11436</td><td>Modello: Microscopio confocale SZ2-ST</td></tr><tr>Microscopio<td>confocale</td> a scansione laser <td>Leica Biosystems</td><td></td><td>SP5 o SP8 con obiettivo 40& con un'apertura numerica di 1,3</td></tr></tbody></table>

metodi per ph intracellulare imaging del lignaggio di cellule staminali del follicolo in live tessuto ovarico di drosophila

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Variazioni di pH intracellulare (pHi) svolgono i ruoli importanti nella regolazione di molte funzioni cellulari, compreso il metabolismo, proliferazione e differenziazione. In genere, pHi dinamiche sono determinati in cellule coltivate, suscettibili di misurazione e manipolando sperimentalmente pHi. Tuttavia, il recente sviluppo di nuovi strumenti e metodologie ha permesso di studiare pHi dinamica all'interno del tessuto intatto, vivo. Per la ricerca di Drosophila , uno sviluppo importante è stata la generazione di una linea transgenica che trasportano un biosensore pHi, mCherry::pHluorin. Qui, descriviamo un protocollo che usiamo abitualmente per formazione immagine dal vivo della drosofila ovarioles per misurare pHi del lignaggio di cellule staminali (FSC) epiteliali del follicolo in mCherry::pHluorin linee transgeniche wild-type; Tuttavia, i metodi descritti qui possono essere facilmente adattati per altri tessuti, compreso i dischi di ala e dell'epitelio dell'occhio. Descriviamo tecniche per esprimere mCherry::pHluorin del lignaggio di FSC, mantenimento del tessuto ovarico durante il live di imaging e acquisire ed analizzare le immagini per ottenere i valori di pHi.

Qui abbiamo descritto il processo di misurazione pHi nell'epitelio del follicolo, che prevede diversi passaggi. In primo luogo, le ovaie vengono sezionate da mosche del genotipo appropriato utilizzando strumenti per dissezione e montaggio (Figura 1). Le ovarioles sono quindi Imaging utilizzando la microscopia a fluorescenza quantitativa e le immagini vengono analizzati per ottenere misurazioni di pHi. Per ogni immagine, i tipi di cellule di interesse vengono ...

Forniamo un protocollo per l'imaging di pH intracellulare di una stirpe delle cellule staminali epiteliali in vivo tessuto ovarico di Drosophila . Descriviamo i metodi per generare mosche transgenici che esprimono un biosensore pH, mCherry::pHluorin, immagine biosensore usando la formazione immagine di fluorescenza quantitativa, generare curve standard e convertire i valori di intensità di fluorescenza per valori di pH.

Metodi per pH intracellulare Imaging del lignaggio di cellule staminali del follicolo in Live tessuto ovarico di Drosophila

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare il pH intracellulare delle cellule follicolari all'interno del tessuto ovarico vivo espiantato di Drosophila. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave nelle cellule staminali e nella biologia dello sviluppo, come ad esempio come le modifiche al pH intracellulare contribuiscono alle decisioni sui solfati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di quantificare con precisione il pH all'interno di tessuti vivi intatti.Per iniziare l'esperimento, preparare le camere di montaggio applicando un sottile strato di grasso sottovuoto sul lato più piatto di una camera di montaggio stampata in 3D. Posizionare il lato più piatto su un vetrino coprioggetti da 22 x 40 millimetri per sigillare il vetrino coprioggetto alla camera di montaggio. Successivamente, sezionare le ovaie delle mosche adulte femmine in 500 microlitri di tampone di dissezione.Anestetizzare tre o quattro mosche usando gas CO2 e trasferire le mosche su un cuscinetto per mosche. Usa una pinza per selezionare una mosca e posizionarla nel mezzo di dissezione. Pizzica il torace della mosca con un paio di pinze mentre tiri la punta dell'addome fino a quando le ovaie non sono esposte.Imposta un timer per esattamente 10 minuti. Dopo aver staccato le ovaie dagli altri organi, separare gli ovarioli utilizzando aghi da siringa da 22 gauge e mezzo. Utilizzare un ago da siringa per tenere in posizione il gruppo di ovarioli alla sua estremità anteriore e scorrere verso il basso lungo la lunghezza dei singoli ovarioli per separare accuratamente la guaina muscolare dalle ovaie.Incubare le ovaie sezionate in mezzi di dissezione per il resto del tempo sul timer. È importante che le ovaie rimangano nel mezzo di dissezione per esattamente 10 minuti per fornire abbastanza tempo alle cellule. Posizionare una piccola goccia di fluido di dissezione sul vetrino di copertura all'interno della camera di montaggio.Trasferire gli ovarioli separati utilizzando una pinza. Separare le camere delle uova dello stadio successivo dalla germaria associata alle camere delle uova dello stadio precedente e assicurarsi che la germaria sezionata sia posizionata al centro della goccia del terreno di dissezione. Aggiungere due piccole gocce di smalto sui lati opposti di circa 12 millimetri di vetrino coprioggetti e lasciare asciugare all'aria per circa 10 secondi.Posizionare il vetrino coprioggetto rotondo sulla goccia del mezzo di dissezione contenente germaria separata, in modo che il lato con lo smalto sia rivolto verso il basso e tocchi il mezzo di dissezione. Premere sui bordi per appiattire e fissare la germaria in posizione. Riempire la camera di montaggio con ulteriori mezzi di dissezione e passare all'imaging dal vivo.Immagine ovarioli in tampone di dissezione ny a pH 6,5. Regolare le impostazioni in modo che l'intensità dei pixel delle immagini pHluorin e mCherry sia bassa, ma non inferiore ai limiti di rilevamento della telecamera. Quindi, acquisire un'altra serie di ovarioli nel tampone di dissezione nygerion a pH 7,5 e regolare le impostazioni in modo tale che le intensità dei pixel delle immagini pHluorin e mCherry siano elevate ma non sature.Acquisire il tampone di dissezione delle ovaie e del bicarbonato e assicurarsi che le intensità dei pixel delle immagini pHluorin e mCherry non siano sature con le impostazioni scelte. Se i pixel sono saturi, regolare le impostazioni. Dopo aver selezionato le impostazioni di imaging dal vivo appropriate, procedere alla raccolta di immagini di almeno cinque germaria in ciascuna delle condizioni.Sottrai lo sfondo aprendo le immagini non elaborate nelle Fiji con ogni canale in una finestra separata. Usa lo strumento rettangolo per disegnare una regione di interesse o ROI nella finestra del canale pHluorin e una parte dell'immagine senza segnale. Impostate il limite inferiore della soglia in modo che i pixel con valori di intensità inferiori allo sfondo vengano esclusi e impostate il limite superiore della soglia sul valore massimo.Quando la soglia è impostata in questo modo, le aree dell'immagine senza segnale sono per lo più blu e il segnale è chiaramente visibile. Se la soglia è stata impostata, passare alla finestra di dialogo Imposta misure e assicurarsi di selezionare la casella Limite alla soglia. Misura l'intensità media della fluorescenza nel ROI, vai al menu di elaborazione, quindi al menu matematico per sottrarre l'intensità di fondo misurata da ciascun canale e fetta dell'immagine utilizzando la funzione di sottrazione.Ripeti i passaggi per la finestra del canale mCherry ma, usa la funzione di ripristino della selezione invece di disegnare un nuovo rettangolo con lo strumento rettangolo che si trova nel menu di modifica della selezione, per aggiungere un rettangolo con le stesse dimensioni e posizione sull'immagine. Scegliere una o più fette in cui la cellula di interesse ha la massima intensità di fluorescenza nel canale mCherry e assicurarsi che la colorazione della concanavalina A nel canale rosso lontano sia a fuoco all'interno della fetta selezionata. Successivamente, disegna un ROI attorno a ciascuna cellula staminale follicolare o FSC e misura l'intensità media di fluorescenza di pHluorin e mCherry e di tutte le fette scelte per le misurazioni.Infine, dividere l'intensità media di fluorescenza del canale pHluorin per l'intensità media di fluorescenza del canale mCherry, per calcolare un rapporto tra fluorescenza pHluorin e mCherry. Due germari sono stati sottoposti a imaging utilizzando la microscopia quantitativa a fluorescenza con UAS mCherry pHluorin e 10930 gal 4, colorati con concanavalina A e ROI che delinea la cellula staminale del follicolo o FSC o PFC e in ogni immagine è mostrata una cellula follicolare. Il rapporto tra le intensità di fluorescenza nei canali GFP e mCherry viene convertito in valori di pH I, utilizzando una curva standard.Il pH I aumenta con la differenziazione nel lignaggio precoce di FSC, da 6,8 nelle FSC a 7,0 nelle cellule prefollicolari a 7,3 nelle cellule follicolari. I valori di pH I di ciascun tipo di cellula possono essere rappresentati come una micrografia pseudocolorata che mostra le differenze nei rapporti tra pHluorin e mCherry, visualizza queste differenze di colore come definito da una LUT. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di avere tutti i reagenti pronti in anticipo perché molti passaggi di questo protocollo sono sensibili al tempo.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dello sviluppo, per esplorare il ruolo del pH nelle decisioni intracellulari del malano gaster.

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JoVE Journal

Developmental Biology

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