Rilevamento del potenziale di membrana di mitocondri per studiare CLIC4 HN4 Knockdown-indotta delle cellule apoptosi In Vitro

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo citobiologico, inclusa la comprensione dell'apoptosi e della disfunzione dei mitocondri. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i ricercatori possono condurre facilmente e correttamente il monitoraggio in tempo reale del potenziale di membrana dei mitocondri tramite rodamina-123 all'interno di una singola cellula. Coltura di una linea cellulare HN4 da carcinoma squamoso a cellule della testa e del collo come descritto nel protocollo di testo.

Un giorno prima della trasfezione, piastra 0,5 milioni di cellule in due millilitri per pozzetto di terreno di coltura senza antibiotici in piastre a sei pozzetti. Diluire delicatamente 100 picomoli di CLIC4 small interfering RNA o small interferenceing RNA scramble in 250 microlitri di sieroma ridotto. Quindi diluire cinque microlitri di reagente liposomico in 250 microlitri di terreno di sieroterapia ridotto e incubare per cinque minuti.

Combinare il piccolo RNA interferente diluito con il reagente liposomico diluito e mescolare delicatamente. Aggiungere il composto a ciascun pozzetto contenente le celle in terreno. Mescolare delicatamente facendo oscillare il piatto avanti e indietro.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore a CO2. Sostituire il terreno con un normale terreno di coltura quattro ore dopo la trasfezione. Continuare a incubare le cellule per altre 20 ore prima di procedere con la procedura di marcatura della rodamina-123.

Dopo il trattamento con CLIC4 di piccole cellule HN4 a RNA interferente in piastre a sei pozzetti, utilizzare una pinzetta per applicare vetrini circolari sul fondo delle nuove piastre a 12 pozzetti. Pipettare 150 microlitri di polilisina da 100 microgrammi per millilitro al centro di ogni vetrino coprioggetti all'interno delle piastre a 12 pozzetti. Dopo due minuti, rimuovere accuratamente la polilisina con il pipettatore.

Quindi, rimuovere il terreno di coltura delle cellule HN4 all'interno della piastra e aggiungere un millilitro di tripsina allo 0,25% per staccare le cellule. Dopo sei minuti, aggiungere due millilitri di terreno di coltura per neutralizzare la tripsina. Mescolare delicatamente le cellule HN4 con il pipettatore cinque volte e seminare le cellule su vetrini circolari.

Mettere le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2. Dopo otto ore di incubazione, aggiungere due micromoli per litro di rodamina-123 e mescolare delicatamente il terreno su e giù più volte per garantire una distribuzione uniforme nel terreno. Incubare le cellule HN4 per 40 minuti a 37 gradi Celsius.

Utilizzare una pinzetta per rimuovere i vetrini coprioggetti e trasferirli brevemente nel tampone NPSS preriscaldato per lavare via il liquido rimanente. Posizionare i vetrini coprioggetti sul fondo della camera in acciaio inossidabile da 500 microlitri con un fondo coprioggetti in vetro da 25 millimetri sostituibile sigillato in posizione da un O-ring. Fissare i vetrini coprioggetti in posizione serrando il coperchio sulla camera.

Aggiungere 450 microlitri di tampone NPSS preriscaldato alla camera assemblata. Quindi posizionare il bagno sotto il campo visivo del microscopio a fluorescenza a fluorescenza o del microscopio a fluorescenza a scansione laser confocale. Accendere il microscopio a fluorescenza seguendo le istruzioni del produttore.

Aprire il software del sistema di imaging e selezionare il pulsante Nuovo dalla barra dei comandi per iniziare un nuovo esperimento. Regola il campo visivo e la messa a fuoco per trovare la posizione delle celle nella luce bianca. Quindi spegnere la luce e premere il pulsante per chiudere la luce bianca.

Fare clic sul pulsante di messa a fuoco dalla barra dei comandi e selezionare avvia messa a fuoco per attivare la fluorescenza. Trova di nuovo la posizione delle cellule tramite il microscopio con un'eccitazione di 507 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione passa-lungo di 529 nanometri. Regola il campo visivo e metti a fuoco di nuovo, se necessario.

Selezionare un campo visivo contenente solo 20-30 celle HN4 separate. Una volta ottenuto un campo visivo chiaro, fare clic su Messa a fuoco ravvicinata dalla barra di messa a fuoco. Quindi fare clic su acquisiscine uno dalla barra dei comandi per acquisire un set di immagini.

Quindi, fai clic su regioni dalla barra dei comandi e fai clic sul pulsante OK per modificare le regioni di misurazione. Per adattarlo alle diverse forme delle singole celle, selezionare lo strumento Traccia regione. Cerchia la regione di una singola cella e fai doppio clic al termine.

Ripetere la procedura fino a quando tutte le celle sono cerchiate. Fare clic su Fine e selezionare Salva immagini per trovare la posizione salvata. Fare clic su zero clock e premere rapidamente F4 per iniziare a monitorare la variazione dell'intensità della fluorescenza.

Registra la variazione in tempo reale dell'intensità della fluorescenza una volta ogni cinque secondi per cinque minuti. Quando la linea di base diventa stabile, aggiungere 50 microlitri di NPSS miscelati con 0,5 microlitri di ATP a 100 millimoli per litro nella camera tramite pipettatore. Accendere il microscopio a fluorescenza a scansione laser confocale seguendo le istruzioni del produttore e aprire il software in dotazione.

Fare clic su obiettivo nel menu di acquisizione per selezionare l'obiettivo a olio ad apertura numerica 63X 1.4. Osservare il campione e trovare un campo visivo chiaro sotto il campo luminoso. Premere il pulsante di selezione della luce per passare alla modalità di fluorescenza e selezionare i filtri di fluorescenza corretti per trovare la posizione della cellula al buio tramite il microscopio.

Spingere l'otturatore per proteggere il campione al termine dell'osservazione. Nel menu di acquisizione, regolare il canale PMT adatto e fare clic su Ottieni per attivare il percorso ottico impostato. Fare clic sul menu di configurazione e scegliere laser per determinare il tipo di laser richiesto.

Fare clic in tempo reale per ottenere immagini in tempo reale e assicurarsi che il campo visivo contenga solo 20-30 cellule HN4 separate. Quindi, selezionare XYT nella modalità di acquisizione nel sottomenu di acquisizione nel menu di acquisizione. Impostare cinque secondi per l'intervallo di tempo e 20 minuti per la durata.

Fare clic su Applica quando tutti i parametri sono stati regolati. Nel menu di quantificazione, utilizzare lo strumento disegna polilinea per cerchiare l'area di registrazione di ciascuna cella. Selezionare il profilo della linea e scegliere Inizia a condurre l'osservazione.

Registra la variazione in tempo reale dell'intensità della fluorescenza per cinque minuti. Quando la linea di base diventa stabile, aggiungere 50 microlitri di NPSS miscelati con 0,5 microlitri di 100 millimoli per litro di ATP alla camera tramite un pipettatore. Per eseguire analisi statistiche utilizzando un comune microscopio a fluorescenza, aprire il software del sistema di imaging e selezionare il pulsante Apri dalla barra dei comandi per aprire un esperimento salvato.

Fare clic su regioni nella barra dei comandi e fare clic sul pulsante OK per modificare le regioni di misurazione. Selezionare lo strumento Traccia regione. Cerchia la regione di una singola cella e fai doppio clic al termine.

Ripetere la procedura fino a quando tutte le celle sono state cerchiate. Fare clic su Fine e selezionare il pulsante F4 in avanti per ottenere una traccia che mostra l'intensità della fluorescenza. Una volta terminato, fai clic sul pulsante freccia giù situato nell'angolo in basso a destra del grafico e fai clic su mostra dati grafico.

Fare clic due volte su OK e scegliere il pulsante dei dati di registro per aprire l'interfaccia del software di elaborazione dati. Quindi fare nuovamente clic su dati di registro per trovare i record di fluttuazione in tempo reale dell'intensità di fluorescenza visualizzati sul foglio di calcolo. Qui sono mostrati i risultati rappresentativi che mostrano i cambiamenti indotti dall'ATP della depolarizzazione mitocondriale nella cellula HN4 sotto diversi interventi, risolti dalla microscopia a fluorescenza comune.

La depolarizzazione della membrana mitocondriale è aumentata rapidamente dopo il trattamento con ATP e ha gradualmente recuperato al livello normale in entrambi i gruppi. Tracce rappresentative dell'intensità fluorescente della rodamina-123 dimostrano che il trattamento MMP del piccolo RNA interferente CLIC4 ha potenziato la depolarizzazione mitocondriale rispetto al gruppo di controllo. Un istogramma rappresentativo ha inoltre rivelato che il knockdown di CLIC4 ha migliorato la depolarizzazione mitocondriale rispetto al gruppo di controllo.

Qui, i risultati rappresentativi della microscopia laser a scansione laser mostrano anche cambiamenti indotti da ATP della depolarizzazione mitocondriale nella cellula HN4 sotto diversi interventi. La depolarizzazione della membrana mitocondriale aumenta rapidamente dopo il trattamento con ATP e recupera gradualmente al livello normale in entrambi i gruppi. Tracce rappresentative dell'intensità fluorescente della rodamina-123 dimostrano che il trattamento MMP dell'RNA interferente piccolo CLIC4 ha migliorato la depolarizzazione mitocondriale rispetto al gruppo di controllo.

Allo stesso modo, l'istogramma rappresentativo ha ulteriormente rivelato che il knockdown di CLIC4 ha migliorato la depolarizzazione mitocondriale rispetto al gruppo di controllo. Dopo aver visto questo video, avrai una migliore comprensione di come utilizzare la rodamina-123 per condurre il monitoraggio in tempo reale del potenziale della membrana mitocondriale sia con la normale microscopia a fluorescenza che con la microscopia a scansione laser confocale. Una volta padroneggiata, questa tecnica di microscopia con rodamina-123 può essere eseguita in meno di 20 minuti per un campione se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di non entrare in contatto con la camera durante l'iniezione in attesa del processo di scansione. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il Western Blot e la citometria a flusso per rispondere a ulteriori domande, come se si sia verificata apoptosi o necrosi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della scienza dal vivo per esplorare la disfunzione mitocondriale e trovare prove solide dell'apoptosi cellulare in varie cellule viventi.

Non dimenticare che lavorare con la rodamina-123 può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti e maschere per il viso.