Name: CLIC4 ノックダウン誘起 HN4 細胞アポトーシスの in Vitro研究にミトコンドリア膜電位の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: 学ぶローダミン123を用いたミトコンドリア膜電位のリアルタイムモニタリング法。CLIC4ノックダウン誘起アポトーシスをHN4細胞で評価し、がん研究におけるミトコンドリア機能解析に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

細胞培養のため氏チャオ牙に感謝致します。この作品は中国の自然科学財団 (81371284 許可第 81570403 号); からの補助金によって支えられました。安徽省の自然科学基金 (許可番号 1408085MH158)。安徽省医科大学の優秀な若手研究者安徽省の大学の優秀な若い才能を支援するプログラム。

1. 細胞培養とトランスフェクション
<ol><li>
細胞培養 注: HN4、各種細胞株、各種14患者から派生しました。<ol>
<li>ダルベッコ HN4 細胞 10% 牛胎児血清と抗生物質 (100 U/mL ペニシリンおよび 100 μ g/mL ストマイ) イーグル培 (DMEM、4.5 G/L グルコース) に変更。5% CO2と 37 ° C でセルを孵化させなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細胞のトランスフェクション
	<ol>
<li>トランスフェクション、前日プレート 5 x 10 の5セル 2 mL/培地 6 ウェル プレートで抗生物質がないのです。</li>
		<li>軽く 100 pmol CLIC4 siRNA または低下した血清中メディアの 250 μ L でスクランブル SiRNA を希釈します。低下した血清中メディアの 250 μ L で 5 μ L リポソーム試薬を希釈しインキュベートする 5 分結合試薬の希釈したリポソームと希釈した siRNA、優しく、ミックス、室温で 20 分間インキュベートします。</li>
		<li>よく細胞と培地を含む各混合物を追加します。ロッキング プレートを行ったり来たりで優しく混ぜます。次の Rh123 ラベル付けの手順に進む前に 24 h のための CO2インキュベーターで 37 ° C でセルを孵化させなさい。トランスフェクション後、正常な成長媒体 4 h で媒体を置き換えます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Rh123 ラベル
注: Rh123 は HN4 セル1で MMP を測定するために利用されました。
<ol><li>CLIC4 siRNA の治療 (セクション 1) 後、次の治療のため 6 ウェル プレートで HN4 セルを使用します。HN4 細胞それぞれの量も 10 倍 coverslips に実験を繰り返して十分であります。</li>
	<li>新しい 12 ウェル プレートの下部に円形 coverslips するのにピンセットを使用します。プレートの番号は、実験的なデザイン (図 1A) に従って設定されます。</li>
	<li>12 ウェル プレート内すべての coverslip の途中 100 μ g/mL ポリリジンの 150 μ L を入れ、2 分、coverslips 外ポリリジンをかけないように注意を払うを待ちます。Pipettor、ポリリジンを徹底的に削除 (図 1B)。</li>
	<li>料理中 HN4 細胞の培養液を削除し、セルをデタッチする 1 mL 0.25% トリプシンを追加します。6 分後、トリプシンを中和するために培地 2 mL を追加します。優しく円形 coverslips 上の 10 の4セル 5 回とシード 2 6 х pipettor による HN4 細胞を混ぜます。5% CO2 (図 1C) 37 ° C の定温器に配置します。</li>
	<li>8 時間培養後 2 µmol/l Rh123 37 ° C で 40 分間 HN4 細胞を孵化させなさい。培地 (図 1D) で Rh123 の均一な配分を確保するため中上下数回を優しく混ぜます。</li>
	<li>準備十分な通常の生理食塩液 (高);ように (でモル/L) 高: 140 塩化ナトリウム、5 5 HEPES、10 グルコース 1 CaCl21 MgCl2KCl pH 7.4)。水お風呂で 37 ° C に予熱します。</li>
	<li>ピンセットを使用して、coverslips を削除し、残りを洗う液体を介して簡単に、coverslips を予熱した NPBS バッファー (図 1E) に配置します。</li>
	<li>500 μ L のステンレス製チャンバーの下部に、coverslips に配置 (材料の表を参照してください) 交換可能な 25 mm ガラス coverslip 底の o リングを用いる場所で密封します。商工会議所 (図 1E) の蓋を締めで解決します。</li>
	<li>450 μ L 組み立て室高バッファーを予熱し、蛍光顕微鏡や共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡 (図 1E) の視野下でお風呂を入れて追加します。</li>
</ol>3. MMP の検出
<ol><li>
一般的な蛍光顕微鏡
	<ol>
<li>製造元の指示に従って蛍光顕微鏡を入れます。 注: 一般的な蛍光顕微鏡で水銀ランプ光ファイバー光源、FITC フィルター Rh123 のセット完了しました (480/40 励起フィルター、505 の LP ダイクロイック ミラー、535/40 排出フィルター) 室温で。20 × 対物は、住セルイメージ投射を行うためだった。</li>
		<li>イメージング システム ソフトウェアを開き、新しい実験 (図 2A) を開始するコマンド バーから「新規」ボタンを選択します。</li>
		<li>視野と白色のセルの場所を見つけるにフォーカスを調整します。</li>
		<li>ライトの電源を切り、白色光を閉じるボタンをプッシュします。コマンド バーから「フォーカス」ボタンをクリックし、「開始焦点」の蛍光に切り替えるを選択します。507 nm 励起と 529 nm ロングパス発光顕微鏡を介して再び細胞の場所を見つける波長 (実験前にセット)。(図 2B) を必要に応じて視野と焦点を再度調整します。</li>
		<li>視野だけ 20 に 30 で区切られた HN4 セルを含むを選択します。各セルの細胞内の蛍光信号の変化が正確に記録されます。</li>
		<li>明確な視野が達成されれば、フォーカス バーから「近い焦点」をクリックします。イメージの 1 つのセットを取得するコマンド バーから「Acq 1」をクリックしてします。コマンド バーから「地域」、測定領域を編集するのには「OK」ボタンをクリックしますします。 注意: リージョンの編集バーから別の地域の図形は研究によって使用できます。</li>
		<li>個々 のセルのさまざまな形状に合わせて、「トレース地域」ツールを選択して円の 1 つのセルの領域としたらダブルクリックします。までのすべてのセルの手順丸 (図 2C) を繰り返します。"Done"をクリックし、保存されている場所を検索する「画像を保存」を選択します。</li>
		<li>クリックして"Zeroclock"とすぐに蛍光強度の変化を監視を開始する f4 キーを押して。リアルタイム記録を一度すべて 5 蛍光強度の変更 5 分 (図 2D) s。</li>
		<li>ベースラインが安定になると、追加の 50 μ L 高 100 ミリ モル/l ATP pipettor 経由で室に 0.5 μ L で混合します。視覚的なフィールド (図 2E) を削除を避けるために商工会議所を触れないように覚えています。 注: 20 分について蛍光画像を記録して、実験を手動操作で終了することができます。時間が 20 分間全体を観察するために日常的に決済される蛍光変化。しかし、プロセス全体の所要 20 分未満、曲線の安定性に影響を及ぼす予期せぬ要因、キャプチャを停止して手動操作が適用されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡
	<ol>
<li>共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡の製造元の指示に従ってを有効にし、バンドルされたソフトウェアを開きます。 注: ここでは、Rh123 は、488 に設定アルゴン レーザーによる興奮をしていた nm、出力される信号は、TD488/543/633 フィルターのアプリケーションを介して 545-700 nm の範囲にわたって記録されました。</li>
		<li>63 X を選択するには、「取得」メニューの下で「客観的」をクリックして/1.4 オイル対物レンズ。標本を観察し、光のフィールドの下で明確な視野を見つけます。</li>
		<li>蛍光モードに切り替え、顕微鏡を介して暗闇の下のセルの場所を見つけるために正しい蛍光フィルターを選択する「TL/IL」ボタンを押します。観測が終わったら、供試体を保護するために「シャッター」を押してください。</li>
		<li>「取得」メニューの下適切な PMT チャンネルを調整し、「達成」(図 3A) 解決された光パスをアクティブにするをクリックします。「設定」メニューをクリックしてし、必要なレーザー種類を決定する「レーザー」を選択します。このプロトコル (図 3B) には「アルゴン」をお勧めします。</li>
		<li>"Live"のリアルタイム画像を取得し、視覚的なフィールドにのみ 20 に 30 で区切られた HN4 セルが含まれているかどうかを確認するをクリックします。各セルの細胞内の蛍光信号の変化が正確に記録されます。</li>
		<li>アクイジション ・ モードで「獲得」メニュー (図 3C) の下で「取得」サブメニューで「xyt」を選択します。それぞれ、時間間隔と期間、5 s と 20 分を設定してください。「適用」をクリックして"すべてのパラメーターが決済されます。</li>
		<li>「数量」メニューの下には、サークルの各セルの記録領域に「ポリラインを描画」ツールを使用します。「行プロフィール」を選択し、観測を実施する「開始」を選択します。5 分 (図 3D ~ E) の蛍光強度のリアルタイムの変更を記録します。</li>
		<li>ベースラインが安定になると、追加の 50 μ L 高 100 ミリ モル/l ATP pipettor 経由で室に 0.5 μ L で混合します。視覚的なフィールドの削除を避けるために商工会議所を触れないように覚えています。 注: 20 分について蛍光画像を記録する実験が完了し.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 統計解析
<ol><li>
一般的な蛍光顕微鏡
	<ol>
<li>日常的に次のオペレーターのマニュアル蛍光顕微鏡を入れます。イメージング システム ソフトウェアを開き、保存されている実験を開くにコマンド バーから「開く」ボタンを選択します。「コマンド バー」から「地域」、測定領域編集するには「OK」ボタンをクリックします。</li>
		<li>「トレース領域」ツールを選択して円の 1 つのセルの領域としたらダブルクリックします。手順を繰り返して、すべてのセルが囲まれています。「完了」をクリックし、選択、"F4: 前方"蛍光強度を示すトレースを取得します。</li>
		<li>完了すると、グラフの右下隅にある下矢印ボタン、「グラフ データの表示」(図 2F) をクリックします。[OK] を 2 回クリックし、データ処理ソフトウェアのインターフェイスを開くには、「ログ データ」ボタンを選択します。「ログ データ」をもう一度クリックし、スプレッドシートに表示される蛍光強度のリアルタイム変動の記録を見つけます。 注: 各セルの MMP の変更された蛍光 ATP または TG (F1/F0) のアプリケーションの前に強度基準の比率として表示されます。各蛍光強度データ 20-30 セルの平均であった。Rh123 のデータは、平均 ± SE 2 グループから結果でテストした独立の両側t検定とP値として表示 < 0.05 は、統計的有意性として考慮されました。統計解析ソフトウェアは、この実験の統計分析に適用されました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡
	<ol>
<li>共焦点レーザー顕微鏡をオンにし、製造元の指示に従って、バンドルされたソフトウェアにログインします。</li>
		<li>記録された実験を開くには「火」を選択します。</li>
		<li>「数量」メニューの下の「プロファイル スタック」ツールを選択し、「チャンネル ・ ロワによって並べ替えグラフ」から「オールインワン」を選択</li>
		<li>観察のため円のセル領域に「多角形描画」ツールを使用します。</li>
		<li>「グラフ」メニューを選択して、マウス右ボタンをクリックしてし"excel にエクスポート"を選択蛍光強度の値をスプレッドシートに追加します。以下の分析は、通常の蛍光顕微鏡 (図 3F) と一致。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Chen, J., Liao, W., Gao, W., Huang, J., Gao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+hypoxia+protects+cerebral+mitochondrial+function+from+calcium+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurol+Belg%22%5BJournal%5D)">Intermittent hypoxia protects cerebral mitochondrial function from calcium overload.</a> Acta Neurol Belg. 113, 507-513 (2013).</li>
<li>Gogol, P., Trzcińska, M., Bryła, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility%2C+mitochondrial+membrane+potential+and+ATP+content+of+rabbit+spermatozoa+stored+in+extender+supplemented+with+GnRH+analogue+%5Bdes-Gly10%2C+D-Ala6%5D-LH-RH+ethylamide%5BTitle%5D)+AND+%22Pol+J+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Motility, mitochondrial membrane potential and ATP content of rabbit spermatozoa stored in extender supplemented with GnRH analogue [des-Gly10, D-Ala6]-LH-RH ethylamide.</a> Pol J Vet Sci. 17, (2014).</li>
<li>Machiels, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+management+of+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Prime+Rep%22%5BJournal%5D)">Advances in the management of squamous cell carcinoma of the head and neck.</a> F1000Prime Rep. 6, 44(2014).</li>
<li>Behera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+therapy+with+taxane+versus+non-taxane+containing+regimens+in+locally+advanced+squamous+cell+carcinomas+of+the+head+and+neck+%28SCCHN%29%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncol%22%5BJournal%5D)">Concurrent therapy with taxane versus non-taxane containing regimens in locally advanced squamous cell carcinomas of the head and neck (SCCHN): a systematic review.</a> Oral Oncol. 50, 888-894 (2014).</li>
<li>Pancari, P., Mehra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+therapy+for+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Oncology+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Systemic therapy for squamous cell carcinoma of the head and neck.</a> Surgical Oncology Clinics of North America. 24, 437-454 (2015).</li>
<li>Peretti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+channels+in+cancer%3A+Focus+on+chloride+intracellular+channel+1+and+4+%28CLIC1+AND+CLIC4%29+proteins+in+tumor+development+and+as+novel+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Chloride channels in cancer: Focus on chloride intracellular channel 1 and 4 (CLIC1 AND CLIC4) proteins in tumor development and as novel therapeutic targets.</a> Biochim Biophys Acta. 1848, 2523-2531 (2015).</li>
<li>Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F., Zdebik, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+and+physiological+function+of+chloride+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular structure and physiological function of chloride channels.</a> Physiol Rev. 82, 503-568 (2002).</li>
<li>Ponnalagu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+supporting+characterization+of+CLIC1%2C+CLIC4%2C+CLIC5+and+DmCLIC+antibodies+and+localization+of+CLICs+in+endoplasmic+reticulum+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Data+Brief%22%5BJournal%5D)">Data supporting characterization of CLIC1, CLIC4, CLIC5 and DmCLIC antibodies and localization of CLICs in endoplasmic reticulum of cardiomyocytes.</a> Data Brief. 7, 1038-1044 (2016).</li>
<li>Fernandez-Salas, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mtCLIC%2FCLIC4%2C+an+Organellular+Chloride+Channel+Protein%2C+Is+Increased+by+DNA+Damage+and+Participates+in+the+Apoptotic+Response+to+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">mtCLIC/CLIC4, an Organellular Chloride Channel Protein, Is Increased by DNA Damage and Participates in the Apoptotic Response to p53.</a> Mol Cell Biol. 22, 3610-3620 (2002).</li>
<li>Suh, K. S., Mutoh, M., Gerdes, M., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIC4%2C+an+intracellular+chloride+channel+protein%2C+is+a+novel+molecular+target+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Derm+Symp+P%22%5BJournal%5D)">CLIC4, an intracellular chloride channel protein, is a novel molecular target for cancer therapy.</a> J Invest Derm Symp P. 10, 105-109 (2005).</li>
<li>Zhong, J., Kong, X., Zhang, H., Yu, C., Xu, Y., Kang, J., Yu, H., Yi, H., Yang, X., Sun, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+CLIC4+Enhances+Autophagy+and+Triggers+Mitochondrial+and+ER+Stress-Induced+Apoptosis+in+Human+Glioma+U251+Cells+under+Starvation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Inhibition of CLIC4 Enhances Autophagy and Triggers Mitochondrial and ER Stress-Induced Apoptosis in Human Glioma U251 Cells under Starvation.</a> PloS one. 7, 39378(2012).</li>
<li>Ponnalagu, D., Singh, H. Anion Channels of Mitochondria. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPonnalagu%2C+D+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22">Handbook of Experimental Pharmacology</a>. , (2016).</li>
<li>Leanza, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+ion+channels+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular ion channels and cancer.</a> Front Physiol. 4, 227(2013).</li>
<li>Kim, S. Y., Chu, K. C., Lee, H. R., Lee, K. S., Carey, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+nine+new+head+and+neck+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oto-Laryngologica%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of nine new head and neck cancer cell lines.</a> Acta Oto-Laryngologica. 117, 775-784 (1997).</li>
<li>Jia, L., Liu, W., Guan, L., Lu, M., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Calcium-Activated+Chloride+Channel+ANO1%2FTMEM16A+Suppresses+Tumor+Growth+and+Invasion+in+Human+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Calcium-Activated Chloride Channel ANO1/TMEM16A Suppresses Tumor Growth and Invasion in Human Lung Cancer.</a> PloS one. 10, 0136584(2015).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+CLIC4%2FmtCLIC+enhances+hydrogen+peroxide-induced+apoptosis+in+C6+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Suppression of CLIC4/mtCLIC enhances hydrogen peroxide-induced apoptosis in C6 glioma cells.</a> Oncol Rep. 29, 1483-1491 (2013).</li>
<li>Zhu, W., Wang, X., Zhou, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C2-ceramide+induces+cell+death+and+protective+autophagy+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">C2-ceramide induces cell death and protective autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells.</a> Int J Mol Sci. 15, 3336-3355 (2014).</li>
<li>McFarland, R., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neurological+perspective+on+mitochondrial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">A neurological perspective on mitochondrial disease.</a> Lancet Neurol. 9, 829-840 (2010).</li>
<li>Alston, C. L., Rocha, M. C., Lax, N. Z., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+and+pathology+of+mitochondrial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">The genetics and pathology of mitochondrial disease.</a> J Pathol. 241, 236-250 (2017).</li>
<li>Zhang, W., Wang, X., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+induces+mitochondria-mediated+AIF+and+to+a+lesser+extent+caspase-9-dependent+apoptosis+in+human+lung+adenocarcinoma+ASTC-a-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Resveratrol induces mitochondria-mediated AIF and to a lesser extent caspase-9-dependent apoptosis in human lung adenocarcinoma ASTC-a-1 cells.</a> Mol Cell Biochem. 354, 29-37 (2011).</li>
<li>Bernardi, P., Rasola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+cell+death%3A+the+mitochondrial+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Calcium and cell death: the mitochondrial connection.</a> Subcell Biochem. 45, 481-506 (2007).</li>
<li>Perveen, S., Yang, J. S., Ha, T. J., Yoon, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanidin-3-glucoside+Inhibits+ATP-induced+Intracellular+Free+Ca%282%2B%29+Concentration%2C+ROS+Formation+and+Mitochondrial+Depolarization+in+PC12+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Cyanidin-3-glucoside Inhibits ATP-induced Intracellular Free Ca(2+) Concentration, ROS Formation and Mitochondrial Depolarization in PC12 Cells.</a> Korean J Physiol Pharmacol. 18, 297-305 (2014).</li>
<li>Paddock, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+practices+of+laser+scanning+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Principles and practices of laser scanning confocal microscopy.</a> Mol Biotechnol. 16, 127-149 (2000).</li>
<li>Paddock, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+boldly+glow...+applications+of+laser+scanning+confocal+microscopy+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays+%3A+news+and+reviews+in+molecular%2C+cellular+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">To boldly glow... applications of laser scanning confocal microscopy in developmental biology.</a> BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 16, 357-365 (1994).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

Cl−チャネルの内部環境の止血に欠かせない細胞増殖およびアポトーシス15,16で重要な役割を果たすとされています。したがって、さまざまな癌17より治療的なアプローチを見つけるための大きい必要性と意義はイオン チャネル標的介入とアポトーシスの関係を理解すること。ミトコンドリアは、セルの通常の生物学的状態を維持し、その機能は高度の膜透過性と膜電位に関連します。ミトコンドリア異常を感音性難聴、小脳失調症、認知症を含む神経学的症状、心血管疾患、ミオパチーに貢献する癌から離れて蓄積 neuropathological 調査に記載しています。、およびてんかん18,19。これらはすべてミトコンドリア絞った介入する臨床治療を改善するために研究に拍車をかけた。Rh123、ミトコンドリアをターゲットとした蛍光色素は、MMP を検出する普遍的な蛍光色素をプロ...

Rh123 は、膜電位を指標として機能するカチオン性蛍光色素です。Rh123 は、細胞膜を貫通し、1膜内外の電位差によってミトコンドリアのマトリックスを入力が可能です。アポトーシスは、ミトコンドリア膜の完全性の損傷に します。ミトコンドリア透過性遷移ポア (MPTP) が開き、mmp に関しては、ミトコンドリアの外に Rh123 のリリースで、結果の崩壊に 。最後に、蛍光顕微鏡下で強い緑色蛍光シグナルが検出されます。MMP と昇格した膜の透過性の減少が細胞アポトーシス2の初期の兆候であることをも記載されています。したがって、Rh123 は、MMP の変化の検出と細胞のアポトーシスの発生に適用可能性があります。
世界の第 6 最も一般的な癌、頭頸部癌が人の健康3大幅に劣化します。多くのアプローチは、近年開発された、頭頸部扁平上皮癌 (各種) を患っている患者のための治療の治療成績はまだ理想的ではない4。新しい治療法を探る各種5の処理を改善できます。多数の生物学的プロセスを含むイオン チャネルは、さまざまな癌6の開発に重要な役割を表示します。Cl-チャンネルの一部または全部の参加は高メタアナライシス アクティブな移行、増殖、侵襲性の率が高いなどのさまざまなプロパティに関与しています。この点を踏まえて、CLIC、新規なタンパク質ファミリーを治療標的癌治療6、7のための有望なクラスとして記載されています。最近の研究が明らかにした CLIC1、CLIC4、CLIC5 など CLIC の家族のメンバーを心臓のミトコンドリアにローカライズ、活性酸素種 (ROS) レベルは、CLIC5 で誘導されるミトコンドリアにある Clの機能的役割を示す-アポトーシス応答8チャンネル。CLIC4、CLIC の家族 (として知られている mtCLIC、P64H1、および RS43) の 1 つのメンバーは、がん細胞とヒトのミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体を含む細胞レベル下の場所でアポトーシス制御プロパティの最も広く研究されています。ケラチノ サイト7,9,10。CLIC4 の発現は、腫瘍壊死因子-α (TNF-α)、P53 と外部からの刺激によって規制されていた。過剰発現および CLIC4 のカスケードはカスパーゼの活性化とチトクローム C11,のリリース Bcl 2 家族の不均衡を伴うミトコンドリア経路を中心にアポトーシス反応を誘発します。12,13。 したがって、MMP 測定が CLIC4 関連アポトーシスを探索することが重要で、Rh123 は理想的な蛍光インジケーターとして機能します。
本研究では、HN4 細胞における CLIC4 ノックダウンによるアポトーシス誘導を研究する MMP の検出のための詳しいプロトコルについて説明します。Rh123 は、MMP の変化を観察する蛍光プローブとして使用されます。一般的な蛍光顕微鏡、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡下で MMP のリアルタイム変動を解決可能性があります。利点および共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡詳細、アプリケーションの制限について説明し、また他の方法と比較します。このプロトコルは、他のアポトーシス関連の研究にも適用できます。

<table><tbody><tr><td>HNSCC細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3241</td><td></td></tr><tr><td>Polylysine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P4981</td><td></td></tr><tr><td>Specific siRNA for human CLIC4</td><td>Biomics</td><td>NM_013943</td><td>(アクセッション番号、NM_013943;cDNA配列に対応する 5-GCTGAAGGAGGACAAAGA-3)およびスクランブルsiRNA(5 ACGCGAACGCGGGAAUUU-3)を設計し、Biomics Company</td></tr><tr><td>から入手しましたリポフェクタミン2000トランスフェクション試薬&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>L3000-015</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 還元型血清培地、GlutaMAX</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>51985-042</td><td></td></tr><tr><td>ローダミン 123、フルオロピュア グレーデ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R22420</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ'smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose)</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin</td><td>Gibco</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA Solution</td><td>Beyotime</td><td>C0201</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic, 100X</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td>LEICA.SP5-DMI6000-DIC</td><td></td></tr><tr><td>ニコン エクリプス TE300 倒立顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>メタフラワー, v7.5.0.0</td><td>ユニバーサルイメージングコーポレーション</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ライカアプリケーションスイート, v2.6.0.7266</td><td>ライカ マイクロシステムズ GmbH</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft office Excel 2007</td><td>マイクロソフト</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>シグマプロット 12.5</td><td>Systat ソフトウェア</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor Cell Chamber</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A7816</td><td></td></tr></tbody></table>

clic4 ノックダウン誘起 hn4 細胞アポトーシスの in vitro研究にミトコンドリア膜電位の検出

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

ミトコンドリア膜電位 (MMP, ΔΨm) の枯渇は、アポトーシスのカスケードの最も早いイベントと見なされます。それは先に核のアポトーシス特性、chromatin の凝縮、DNA の破損なども発生します。一度 MMP 崩壊、細胞のアポトーシスは不可逆的に開始されます。脂溶性のカチオン染料のシリーズ細胞膜を通過し、ミトコンドリアのマトリックス内の集計、や MMP の変化を評価するための蛍光マーカーとして役立ちます。Cl-細胞内チャネル (CLIC) 家族の 6 人のメンバーの 1 つとして CLIC4 はミトコンドリア経路を中心に細胞アポトーシス プロセスに参加します。ローダミン 123 (Rh123) CLIC4 ノックダウンで誘導されるアポトーシスを学ぶ私たちの蛍光変動の監視を通じて MMP を測定する詳細なプロトコルについて述べる。利点および共焦点レーザー走査と詳しくは、通常の蛍光顕微鏡のアプリケーションの制限について説明し、また他の方法と比較します。

本研究では、Rh123 は MMP を検出に適用されました。当初、HN4 細胞以下の蛍光染色実験培養。6 ウェル プレート (図 1A) の下部にピンセット使用された円形 coverslips。Coverslips が 5 分ポリリジンでコーティングした、pipettor (図 1B) 経由でのポリリジンの削除されます。その後、HN4 細胞トリプシン, 6 ウェル プレートの底に置かれた coverslips にシード.次に、Rh123 の適切な量を追加され、混合よく (図 1C D)。予熱した高洗浄後、coverslip の視聴室に組み立てられました。高の適切な量は、以下の実験 (図 1E) を追加さ...

ローダミン 123 ミトコンドリア膜電位 (MMP) を識別し、CLIC4 ノックダウン誘起 HN4 細胞アポトーシスの生体外の研究の適用のための詳しいプロトコルをご紹介します。一般的な蛍光顕微鏡、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡下で MMP のリアルタイム変更が記録されました。

CLIC4 ノックダウン誘起 HN4 細胞アポトーシスの in Vitro研究にミトコンドリア膜電位の検出

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

この方法は、アポトーシスやミトコンドリアの機能障害の理解など、細胞生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、研究者が単一細胞内のrhodamine-123を介してミトコンドリア膜電位のリアルタイムモニタリングを簡単かつ適切に実施できることです。テキストプロトコルに記載されているように、頭頸部細胞扁平上皮癌からHN4細胞株を培養します。トランスフェクションの1日前に、抗生物質を含まない培養培地のウェルあたり2ミリリットルの50万個の細胞を6ウェルプレートにプレートします。100ピコモルのCLIC4低分子干渉RNAまたはスクランブルされた低分子干渉RNAを、250マイクロリットルの還元血清培地で穏やかに希釈します。次に、5マイクロリットルのリポソーム試薬を250マイクロリットルの還元血清培地で希釈し、5分間インキュベートします。希釈した低分子干渉RNAを希釈したリポソーム試薬と組み合わせ、穏やかに混合します。培地中の細胞を含む各ウェルに混合物を加えます。プレートを前後に揺らして優しく混ぜます。細胞を37°CでCO2インキュベーターでインキュベートします。トランスフェクションの4時間後に培地を正常な増殖培地と交換してください。さらに20時間細胞をインキュベートし続けてから、rhodamine-123標識手順に進みます。6ウェルプレートでHN4細胞のCLIC4低分子干渉RNA処理を行った後、ピンセットを使用して、新しい12ウェルプレートの底に円形のカバースリップを貼り付けます。12ウェルプレート内の各カバーガラスの中央に1ミリリットルあたり100マイクログラムのポリリジンを150マイクロリットルピペットで取り付けます。2分後、ピペッターでポリリジンを完全に除去します。次に、皿の中のHN4細胞の培地を取り出し、0.25%トリプシンを1ミリリットル加えて細胞を剥離します。6分後、トリプシンを中和するために2ミリリットルの培地を追加します。HN4細胞をピペッターで5回穏やかに混合し、円形のカバースリップに細胞を播種します。細胞を摂氏37度のインキュベーターに5%CO2で置きます。8時間のインキュベーション後、rhodamine-123のリットルあたり2マイクロモルを追加し、培地を数回上下に穏やかに混合して、培地に均一に分布するようにします。HN4細胞を摂氏37度で40分間インキュベートします。ピンセットを使用してカバースリップを取り外し、予熱したNPSSバッファーに短時間移して残りの液体を洗い流します。カバースリップを500マイクロリットルのステンレス製チャンバーの底に置き、交換可能な25mmガラスカバースリップの底部をOリングで所定の位置に密封します。チャンバーの蓋を締めて、カバースリップを所定の位置に固定します。組み立てたチャンバーに450マイクロリットルの予熱したNPSSバッファーを追加します。次に、蛍光顕微鏡または共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡の視野の下に浴を置きます。製造元の指示に従って蛍光顕微鏡の電源を入れます。イメージングシステムソフトウェアを開き、コマンドバーから新しいボタンを選択して、新しい実験を開始します。視野と焦点を調整して、白色光の中のセルの位置を見つけます。次に、ライトをオフにし、ボタンを押して白色ライトを閉じます。コマンドバーのフォーカスボタンをクリックし、フォーカスの開始を選択して蛍光をオンにします。顕微鏡で、励起波長507ナノメートル、ロングパス発光波長529ナノメートルの細胞の位置を再度探します。視野を調整し、必要に応じて再度焦点を合わせます。20〜30個の分離されたHN4セルのみを含む視野を選択します。クリアな視野が達成されたら、フォーカスバーからクローズフォーカスをクリックします。次に、コマンド バーから [取得] をクリックして、1 セットの画像を取得します。次に、コマンドバーから領域をクリックし、[OK]ボタンをクリックして測定領域を編集します。個々のセルのさまざまな形状に合わせるには、トレース領域ツールを選択します。1 つのセルの領域を丸で囲み、終了したらダブルクリックします。すべてのセルが丸で囲まれるまで、この手順を繰り返します。[完了]をクリックし、[画像を保存]を選択して、保存した場所を見つけます。ゼロクロックをクリックし、F4をすばやく押して、蛍光強度の変化の監視を開始します。蛍光強度のリアルタイム変化を5秒ごとに5分間記録します。ベースラインが安定したら、50マイクロリットルのNPSSと0.5マイクロリットルの100ミリモル/リットルATPを混合してピペッターでチャンバーに加えます。製造元の指示に従って共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡の電源を入れ、付属のソフトウェアを開きます。取得メニューの下の対物レンズをクリックして、63X 1.4 開口数式オイル対物レンズを選択します。標本を観察し、光野の下に明確な視野を見つけます。光選択ボタンを押して蛍光モードに切り替え、正しい蛍光フィルターを選択して、顕微鏡で暗闇下での細胞の位置を見つけます。観察が終了したら、シャッターを押して試料を保護します。取得メニューで、適切なPMTチャネルを調整し、[達成]をクリックして、セトリングされた光路をアクティブにします。設定メニューをクリックし、レーザーを選択して必要なレーザータイプを決定します。ライブをクリックしてリアルタイムの画像を取得し、視野に分離されたHN4細胞が20〜30個しか含まれていないことを確認します。次に、取得メニューの下の取得サブメニューで、取得モードでXYTを選択します。時間間隔を 5 秒、期間を 20 分に設定します。すべてのパラメータが確定したら、[適用]をクリックします。[定量化] メニューで、ポリラインの描画ツールを使用して、各セルの記録領域を円で囲みます。ライン プロファイルを選択し、[開始] を選択して観測を行います。蛍光強度のリアルタイム変化を5分間記録します。ベースラインが安定したら、ATP1リットルあたり100ミリモルの0.5マイクロリットルと混合した50マイクロリットルのNPSSをピペッターを介してチャンバーに加えます。一般的な蛍光顕微鏡を使用して統計解析を行うには、イメージングシステムソフトウェアを開き、コマンドバーから開くボタンを選択して、保存した実験を開きます。コマンド バーから領域をクリックし、[OK] ボタンをクリックして測定領域を編集します。トレース領域ツールを選択します。1 つのセルの領域を丸で囲み、完了したらダブルクリックします。すべてのセルが丸で囲まれるまで、この手順を繰り返します。「完了」をクリックし、「F4 進む」ボタンを選択して、蛍光強度を示すトレースを取得します。終了したら、グラフの右下隅にある下矢印ボタンをクリックし、[グラフデータの表示]をクリックします。[OK]を2回クリックし、[ログデータ]ボタンを選択して、データ処理ソフトウェアのインターフェイスを開きます。次に、ログデータを再度クリックすると、スプレッドシートに表示される蛍光強度のリアルタイム変動の記録が検索されます。ここに示されているのは、一般的な蛍光顕微鏡法で解決された、さまざまな介入下でのHN4細胞におけるATP誘発性ミトコンドリア脱分極の変化を示す代表的な結果です。ミトコンドリア膜の脱分極はATP治療後に急速に増加し、両群とも徐々に正常レベルまで回復しました。代表的な微量のローダミン-123蛍光強度は、対照群と比較して、CLIC4低分子干渉RNAのMMP処理がミトコンドリアの脱分極を促進したことを示しています。代表的なヒストグラムはさらに、CLIC4のノックダウンが対照群と比較してミトコンドリアの脱分極を促進することを明らかにしました。ここでは、代表的な共焦点レーザー走査型顕微鏡の結果は、異なる介入下でのHN4細胞におけるミトコンドリア脱分極のATP誘発性変化も示しています。ミトコンドリア膜の脱分極は、ATP治療後に急速に増加し、両群とも徐々に正常レベルに回復します。ロダミン-123の蛍光強度の代表的な微量性は、CLIC4低分子干渉RNAのMMP処理が対照群と比較してミトコンドリアの脱分極を促進したことを示しています。同様に、代表的なヒストグラムは、CLIC4のノックダウンが対照群と比較してミトコンドリアの脱分極を促進することをさらに明らかにしました。このビデオをご覧いただければ、rhodamine-123を使用して、通常の蛍光顕微鏡と共焦点レーザー走査型顕微鏡の両方でミトコンドリア膜電位のリアルタイムモニタリングを行う方法について理解を深めることができます。このローダミン-123を用いた顕微鏡法は、一度習得すれば、適切に実施されれば、1つのサンプルに対して20分以内に行うことができます。この手順を試行する際は、スキャンプロセスを待つ間、注入中にチャンバーに接触しないように注意することが重要です。この手順に続いて、ウェスタンブロットやフローサイトメトリーなどの他の方法を実行して、アポトーシスや壊死が発生したかどうかなどのさらなる質問に答えることができます。その開発後、この技術は、生科学の分野の研究者がミトコンドリアの機能障害を探求し、さまざまな生細胞における細胞アポトーシスの確固たる証拠を見つけるための道を開きました。rhodamine-123での作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは常に手袋やフェイスマスクの着用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

detection-mitochondria-membrane-potential-to-study-clic4-knockdown

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このプロトコルは、蛍光イメージングによるミトコンドリアのカルシウムフラックスのリアルタイム測定のための方法を説明します。方法は、選択的にミトコンドリアで発現する循環permutated YFPベースのデュアル励起レシオメトリックカルシウムセンサー（レシオメトリックpericam -...

遺伝的にコードされたカルシウムのセンサを用いたアポトーシス時のミトコンドリア内カルシウム濃度の動的変更の監視

監視劈開カスパーゼ-3活性およびカリウム誘発性膜の脱分極に続いてライブセルイメージングとCleaveable蛍光色素基質を用いて不死化オリゴデンドログリア細胞のアポトーシス

呼吸と酸化的リン酸化により、細胞生存率に関連するミトコンドリア機能に対するプロテインキナーゼC（PKC）アイソザイムの活性化の効果を説明する。アプローチは、選択的に初代細胞培養や細胞のミトコンドリアの機能とエネルギー状態を決定するために種々のアッセイにおけるPKCアイソザイムを過剰発現するアデノウイルスの手法を適応します。...

腎細胞内のミトコンドリアの機能と細胞生存率の評価を過剰発現するプロテインキナーゼCアイソザイム

E4orf4誘導細胞死へのACFのクロマチンリモデリング因子の寄与を測定した。プロトコルはドキシサイクリン治療がACFユニットAcf1とSNF2hの条件付きノックダウンを誘導し、誘導細胞株でE4orf4誘導される細胞死を測定するためのDAPIアッセイを使用した細胞クローンの選択が含まれています。...

遺伝子発現とE4orf4誘発細胞死にノックダウン効果の測定のための条件付きノックダウン細胞株の作製

マルチプレックスアッセイは、基本的な細胞メカニズムのための有益な情報を提供し、試薬および不必要な反復実験の無駄をなくすことができます。我々は、パルミチン酸との酸化的チャレンジ後のin vitroモデルの視床下部での細胞生存率を決定するために、蛍光及び発光に基づく方法を用いて、ここに多重化カスパーゼ3/7活性アッセイを記載する。...

視床下部細胞モデルでアポトーシスを決定するために、カスパーゼの多重化アッセイの使用

ここで説明するフローサイトメトリーによりげっ歯類組織分析から単離されたミトコンドリアの免疫標識によってミトコンドリア外膜タンパク質を検出および定量するための方法である。この方法は、ミトコンドリア亜​​集団の機能的側面を評価するために拡張することができる。...

単離されたミトコンドリアのフローサイトメトリーによる外膜タンパク質の免疫検出

アナスタシスという用語は、死にかけている細胞が細胞の自殺プロセスを後期段階で逆転させ、自分自身を修復し、最終的に生き残る現象を指します。ここでは、アナスタシスを受ける細胞を検出および追跡するためのプロトコルを示します。...

トラッキングアナスタシス、アポトーシスを逆に細胞生存現象のための戦略

サンプル間のミトコンドリア膜電位の比較は、細胞の状態に関する貴重な情報をもたらします。ミトコンドリアを単離し、蛍光を使用して阻害剤およびアンカプラーに対する反応を評価するための詳細な手順について説明します。このプロトコルの方法と有用性は、細胞培養と細胞ストレスの動物モデルの使用によって説明されています。...

培養細胞およびマウス組織から単離とミトコンドリアの機能解析

Mitophagy、クリア破損しているミトコンドリアのプロセスはミトコンドリアの恒常性と健康維持のため必要です。この記事は最新の mitophagy...

In VitroとIn Vivo検出、ひと細胞、線虫、マウス Mitophagy の

肝細胞におけるミトコンドリア機能に対する環境有機塩素農薬(OP)の影響を理解することは、代謝障害を引き起こすOMPのメカニズムを探求する上で重要である。本論文では、肝ミトコンドリア機能の検出方法について詳しく説明する。...

有機塩素系農薬に曝露した肝細胞におけるミトコンドリア機能の検出実験プロトコル

子宮頸がん細胞の増殖とシスプラチン感受性における FAM83Aの役割を検証するためのFAM83A のノックダウン

学ぶローダミン123を用いたミトコンドリア膜電位のリアルタイムモニタリング法。CLIC4ノックダウン誘起アポトーシスをHN4細胞で評価し、がん研究におけるミトコンドリア機能解析に貢献します。

CLIC4 ノックダウン誘起 HN4 細胞アポトーシスの in Vitro研究にミトコンドリア膜電位の検出

さらに動画を探す