Name: Generazione di un Gene-interrotto lo streptococco mutans Strain senza clonaggio genico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Scopri un metodo rapido ed economico per generare ceppi di Streptococcus mutans con geni interrotti mediante PCR di fusione in due passaggi ed elettroporazione. Questa tecnica semplificata accelera la ricerca genetica in microbiologia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato dalla società Giappone per la promozione della scienza [Grant numeri 16 K 15860 a T.M. e 15 K 15777 di N.H.].

1. primer Design <ol><li>preparare primer per fusione di 2-step PCR e verifica della rottura del gene. 
	Nota: La tabella 1 Mostra le sequenze dell'iniettore utilizzate nel presente protocollo. la figura 1 Mostra un'illustrazione schematica del metodo PCR 2-passo fusione utilizzato per generare S. mutans Δ gtfC.
	<ol><li>Primer design per la sostituzione dell'area di destinazione del genoma con la spectinomicina-resistenza gene (spc r) 7. Questo protocollo sostituisce l'intera regione di codificazione del gene di gtfC con spc r.</li>
		<li>Sono 15 basi complementari alle estremità superiore e inferiore del spc r al 5 &#39; regioni di up-reverse e giù-forward primer, rispettivamente. Analogamente, includere 15 basi complementari all'estremità inferiore delle regioni fiancheggianti a Monte del gtfC e l'estremità superiore delle regioni fiancheggianti a valle di gtfC al 5 &#39; regioni del spc r-avanti e spc r -reverse primer, rispettivamente ( Figura 1A). 
		Nota: Sequenze di up-reverse, giù-avanti, spc r - forward e spc r - reverse primer vengono determinate automaticamente a seconda del sito di incorporazione del costrutto rottura.</li>
		<li>Design i up-forward e giù-reverse primer comporta &#62; 1-kb a Monte e a valle delle regioni fiancheggianti del gene gtfC, rispettivamente. Impostare la temperatura di fusione (T m) di up-avanti e giù-reverse primer secondo la temperatura di fusione di up-reverse e giù-forward primer, rispettivamente ( Figura 1A). 
		Nota: Fare riferimento alla seguente formula per determinare T m: T m (° C) = 2 (* NA + * NT) + 4 (* NC + * NG) - 5, dove * N rappresenta il numero di nucleotidi di primer con l'identità specificata (A, T, C o G).</li>
		<li>Disegnare primers nidificati (N_up-forward e reverse-N_up) per la 2 nd PCR ( Figura 1B). 
		Nota: Anche se la coppia di primer ultraperiferiche (up-forward e giù-reverse) può essere usata come primer per la 2 nd PCR, primer nidificati (N_up-forward e reverse N_up) sono stati progettati in questo protocollo. Primer nidificati sono frequentemente richiesti per la 2 nd PCR, come dettagliato nei Risultati rappresentante.</li>
		<li>Primer design specifici per spc r. Gli iniettori sono utilizzati per PCR della Colonia alla schermata per rottura gtfC.</li>
		Rottura di <li>primer design per la verifica di gtfC. 
		Nota: I prodotti della PCR amplificati usando questi iniettori straddle al confine tra gtfC o spc r e a Monte o a valle delle regioni fiancheggianti del gtfC. I set di primer &#39; gtfC up-forward e gtfC up-reverse &#39; e &#39; gtfC giù-avanti e gtfC giù-reverse &#39; sono specifici per gtfC, e &#39; gtfC up-forward e spc r 2 -inverso &#39; e &#39; spc r 2-forward e gtfC giù-reverse &#39; sono specifici per spc r.</li>
	</ol></li></ol> 2. Estrazione del DNA genomico da S. mutans s <ol><li>stock Streak mutan S. UA159 su una piastra di agar di cervello cuore infusione (BHI). Incubare la piastra durante la notte a 37 ° C in anaerobiosi.</li>
	<li>Pick up una singola Colonia utilizzando uno stuzzicadenti sterilizzato e inoculare esso in 5 mL di brodo BHI. Incubare la coltura della S. mutan durante la notte a 37 ° C in anaerobiosi.</li>
	<li>Centrifugare la coltura delle cellule batteriche per 15 min 2.000 × g. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di tampone fosfato salino (PBS).</li>
	<li>Centrifuga per 15 min a 2.000 × g. Risospendere il pellet cellulare in 200 µ l di PBS.</li>
	<li>Estrarre il DNA genomico dalla sospensione utilizzando un kit di estrazione tallone-pestaggio-base genomic del DNA secondo le istruzioni fornite dal produttore.
	<ol><li>Trasferimento la sospensione ad un campione di 2,0 mL tubo contenente microsfere di vetro (inclusi nel kit). Aggiungere 750 µ l di soluzione di lisi (incluso nel kit) per la sospensione cellulare.</li>
		<li>Richiudere ermeticamente e posizionare i tubi simmetricamente in supporto del tubo dell'apparato di rottura della perla-pestaggio. Processo alla velocità massima per 5 min. Centrifugare il branello-battuti i campioni per 1 min 10.000 × g. trasferire il surnatante al filtro spin (incluso nel kit) in una provetta da 2,0 mL e centrifugare per 1 min 7.000 × g .</li>
		<li>Aggiungere 1.200 µ l di DNA binding buffer (incluso nel kit) per il filtrato. Trasferire 800 µ l della miscela per la colonna di spin (inclusa nel kit), un tubo di raccolta di 2,0 mL e centrifugare per 1 min 10.000 × g.</li>
		<li>Scartare il flusso continuo, aggiungere 200 µ l di tampone pre-lavaggio (incluso nel kit) nella colonna di spin per lavare la matrice di colonna e centrifugare per 1 min a 10.000 × g. gettare il flusso continuo, aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio (incluso nel kit) alla rotazione colonna di lavare la matrice colonna e centrifugare per 1 min a 10.000 × g.</li>
		<li>Collocare la colonna di spin in un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL e aggiungere 100 µ l di tampone di eluizione (incluso nel kit) alla matrice colonna.</li>
		<li>Centrifuga per 30 s a 10.000 × g per eluire il DNA genomic. Stimare la concentrazione del DNA e la purezza misurando l'assorbanza a 260 nm e 280 nmusing uno spettrofotometro e confermare che il rapporto di 280 A 260 /A è superiore a 1,8.</li>
	</ol></li></ol> 3. L'amplificazione di PCR <ol><li>eseguire la 1 st PCR usando il genoma di s WT S. mutan e il gene sintetico spc r come modelli PCR (Vedi tabella 1). Amplificare la regione di fiancheggiamento a Monte del gene gtfC, la regione di fiancheggiamento a valle del gene gtfC e il gene di spc r utilizzando i tre insiemi degli iniettori descritti sopra ( Figura 1A), come per Tabella 2 e tabella 3. 
	Nota: Gli iniettori PCR, reagenti e cicli di amplificazione sono riassunti nella tabella 1, tabella 2 e tabella 3, rispettivamente.</li>
	<li>Frazionare ogni prodotto PCR su un gel di agarosio 1% ed asportare le bande corrispondenti usando una fresa di banda gel.</li>
	<li>Purificare ogni prodotto amplificato di DNA dai gel utilizzando un kit di estrazione spin gel a base di membrana di silice e colonna -.
	<ol><li>Trasferimento le fette del gel per una microcentrifuga pulita provetta e mescolano con 500 µ l di binding buffer (incluso nel kit). Incubare la miscela a 55 ° C per 15 minuti, finché le fette del gel sono completamente dissolte.</li>
		<li>Sistemare la colonna di spin (inclusa nel kit) in una provetta di raccolta (inclusa nel kit), caricare il campione sulla colonna di spin e centrifugare per 30 s a 11.000 × g. Scartare il flusso continuo, aggiungere il 600 µ l di tampone di lavaggio (incluso nel kit) alla colonna Spin per lavare la membrana di silice e centrifugare per 30 s a 11.000 × g.</li>
		<li>Eliminare il flusso continuo e centrifugare per 2 min 11.000 × g per asciugare la membrana di silice.</li>
		<li>Posto nella colonna di selezione in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL, aggiungere 50 µ l tampone di eluizione (incluso nel kit) e incubare a temperatura ambiente per 2 min.</li>
		<li>Centrifugare per 2 min 11.000 × g per eluire il DNA amplificato. Stimare la concentrazione del DNA e la purezza misurando l'assorbanza a 260 nm e 280 nmusing uno spettrofotometro e confermare che il rapporto di 280 A 260 /A è superiore a 1,8.</li>
	</ol></li> <li>Eseguire la 2 nd PCR di fusione 2-step PCR utilizzando i tre frammenti circa equimolari come modelli PCR, secondo tabella 2 tabella 3. 
	Nota: Questi frammenti sono stati amplificati e impiombata utilizzando i primers nidificati &#39; N_up-forward e reverse-N_down &#39; o gli iniettori ultraperiferiche &#39; up-forward e giù-reverse &#39; ( Figura 1B). Gli iniettori di PCR, reagenti e cicli di amplificazione sono riassunti nella tabella 1, tabella 2 e tabella 3, rispettivamente.</li>
	<li>Caricare un decimo della miscela di reazione PCR (5 µ l) su un gel di agarosio 0.8% e confrontare la dimensione di banda amplificato con la dimensione di banda prevista per confermare la generazione del amplicon appropriato ( Figura 1).</li>
	<li>Concentrare il prodotto PCR finale restante mediante precipitazione dell'etanolo senza purificazione.
	<ol><li>Aggiungere 55 µ l di ultra-puro dell'acqua alla miscela PCR rimanente per regolare il volume totale a 100 µL.Add un volume di un decimo di 3M sodio acetato (10 µ l), pH 5.2, seguita da 2,5 volumi di etanolo al 100% (250 µ l). Mescolare e congelare per 30 min a -80 ° C.</li>
		<li>Centrifugare per 20 min 15.000 × g a 4 ° C, controllare il precipitato sul fondo della provetta e scartare il surnatante. Lavare la pallina con 1 mL di etanolo al 70%, centrifugare per 5 min 15.000 × g a 4 ° C e scartare il surnatante. Asciugare il pellet per circa 30 min e si dissolvono con 10 µ l di acqua ultra-pura.</li>
	</ol></li></ol> 4. Preparazione di cellule competenti e trasformazione cellulare <ol><li>stock Streak mutan S. s UA159 su una piastra di agar BHI. Incubare la piastra durante la notte a 37 ° C in anaerobiosi.</li>
	<li>Pick up una singola Colonia utilizzando uno stuzzicadenti sterilizzato e inoculare esso in 5 mL di brodo BHI. Incubare la coltura della S. mutan durante la notte a 37 ° C in anaerobiosi.</li>
	<li>Trasferire 2 mL della cultura s s. mutan a 50 mL di brodo BHI e incubare per 6-8 h a 37 ° C per densità ottica a 600 nm (OD 600) di 0.2-0.4 in condizioni anaerobiche.</li>
	<li>Centrifugare le cellule per 15 min a 2.000 × g a 4 ° C, scartare il surnatante e lavare le cellule due volte con 40 mL di acqua ghiacciata, seguita da 40 mL di glicerolo al 10%. 
	Nota: Sostanze residue influire sulle successiva elettroporazione.</li>
	<li>Aspirare il supernatante accuratamente con una pipetta Pasteur come si riduce l'aderenza del pellet cellulare in glicerolo al 10%. Risospendere le cellule in 1 mL di glicerolo al 10% fresco, dispensare 50 µ l della sospensione in ciascuna provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e conservare a-80 ° C fino a poco prima dell'uso.</li>
	<li>Mescolare l'aliquota di 50 µ l di cellule competenti ghiacciate con 5 µ l del costrutto di rottura sopra descritto al punto 3. Aggiungere la miscela di cuvette di elettroporazione (con una distanza di 0,2 cm tra gli elettrodi). Impiegare la modalità di Staphylococcus aureus (1.8 kV, Ω 600, 10 µF, 1 impulso) dell'apparato di elettroporazione per electroporate.</li>
	<li>Sospendere le cellule in 500 µ l di brodo BHI immediatamente dopo l'elettroporazione e aggiungere 50 µ l della sospensione di piastre di agar BHI contenenti spectinomicina. 
	Nota: Incubazione Extra tempo dopo elettroporazione non è necessaria. Tuttavia, incubazione per 1-2 h dopo l'elettroporazione può migliorare l'efficienza di trasformazione.</li>
	<li>Incubare la piastra per 2-6 giorni a 37 ° C in anaerobiosi. 
	Nota: S. mutans Δ gtfB è costruito come descritto sopra. L'intera regione di codificazione del gene di gtfB viene sostituito con l'eritromicina resistenza gene 8 in S. mutans Δ gtfB. Ogni sforzo di S. mutans è coltivato in brodo BHI a 37 ° C in anaerobiosi.</li>
</ol> 5. Verifica della rottura del Gene e deposito <ol><li>Pick casuale colonie e inoculare loro nella miscela PCR per eseguire PCR secondo la tabella 2 e tabella 3 della Colonia. Gli iniettori di PCR, reagenti e cicli di amplificazione sono riassunti nella tabella 1, tabella 2 e tabella 3, rispettivamente.</li>
	<li>Caricare la miscela di reazione PCR su un gel di agarosio all'1% per confermare la spc r-banda specifica DNA.</li>
	<li>Scegliere la Colonia positiva utilizzando uno stuzzicadenti sterilizzato e sottocultura cellule in 10 mL di spectinomicina-contenente BHI brodo per 2 giorni a 37 ° C in anaerobiosi.</li>
	<li>Verificare la generazione di S. mutans Δ gtfC.
	<ol><li>Dividere in parti uguali la sospensione cellulare. Estrazione del DNA genomico dalle cellule sopra descritte (passi 2.3. a 2.5.5.). Eseguire PCR con DNA genomico come il modello PCR, utilizzando primers per la verifica di gtfC rottura (tabella 1) secondo la tabella 2 e tabella 3. 
		Nota: Il primer PCR, reagenti e cicli di amplificazione sono riassunti nella tabella 1, tabella 2 e tabella 3, rispettivamente.</li>
		<li>La miscela PCR su un gel di agarosio al 2% di carico e confrontare la dimensione di banda amplificato con la dimensione di banda prevista per confermare la generazione del amplicon appropriato .</li>
		<li>Centrifugare la sospensione delle cellule rimanenti per 15 min a 2.000 × g a 4 ° C. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di PBS.</li>
		<li>Centrifuga per 15 min a 2.000 × g a 4 ° C. Risospendere la cella a pellet in 1,5 mL di brodo BHI contenente 25% glicerolo e conservare a-80 ° Cor -20 ° C.</li>
	</ol></li></ol> 6. L'analisi fenotipica <ol><li>striscia ogni S. mutan ceppo s su una piastra di agar BHI. Incubare la piastra durante la notte a 37 ° C in anaerobiosi.</li>
	<li>Pick up una singola Colonia utilizzando uno stuzzicadenti sterilizzato e inoculare esso in 2 mL di brodo BHI con o senza un antibiotico appropriato. Incubare per una notte a 37 ° C in anaerobiosi.</li>
	<li>Inoculare 20 µ l della sospensione di cultura durante la notte in 2 mL di brodo BHI contenente 1% o 5% di saccarosio senza antibiotici in una provetta di vetro; cultura le cellule con la provetta in posizione inclinata durante la notte a 37 ° C in anaerobiosi.</li>
	<li>Vortex il vetro provette per 10 s e decantare sospensioni di cultura. Lavare le provette tre volte con acqua distillata. Aggiungere 1 mL di 0,25% Coomassie brilliant blue (CBB) a macchiare il biofilm sulle pareti della provetta e poi incubare per 1 min.</li>
	<li>Decantare la soluzione colorante, lavare le provette tre volte con acqua distillata e asciugare le provette.</li>
	<li>Valutare la densità e la estensione del CBB macchiato-biofilm visivamente per determinare la capacità di formare biofilm in un'analisi fenotipica.</li>
</ol>

<ol><li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes%3A+gene+splicing+by+overlap+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li>
<li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+splicing+by+overlap+extension%3A+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li>
<li>Kuwayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-mediated+generation+of+a+gene+disruption+construct+without+the+use+of+DNA+ligase+and+plasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors.</a> Nucleic Acids Res. 30 (2), E2(2002).</li>
<li>Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digalactosyldiacylglycerol+is+required+for+stabilization+of+the+oxygen-evolving+complex+in+photosystem+II%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II.</a> Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).</li>
<li>Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+a+Streptococcus+mutans+glucosyltransferase+gene+coding+for+insoluble+glucan+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis.</a> Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).</li>
<li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutans+gtfC+gene%2C+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li>
<li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD%289%29+determinant+from+Enterococcus+faecalis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li>
<li>Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cloning+vector+able+to+replicate+in+Escherichia+coli+and+Streptococcus+sanguis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis.</a> Gene. 19 (3), 345-353 (1982).</li>
<li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).</li>
<li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).</li>
<li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci%3A+application+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li>
<li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> J Vis Exp. (69), (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Nel presente protocollo, i primers per la 1st PCR devono essere progettati per amplificare circa 1 kb a Monte e a valle delle regioni fiancheggianti del regione di destinazione nel genoma. Tali sequenze fiancheggianti lungo sono necessari per migliorare l'efficienza di ricombinazione omologa.
Le sequenze dei primer (up-reverse, giù-avanti, spcr-avanti e spcr-inversa) in questo protocollo sono stati automaticamente determinati basato sul sito d...

Analisi di funzione del gene in genere implica un confronto fenotipico tra un ceppo selvaggio-tipo e un ceppo in cui è stato interrotto un particolare gene di interesse. Questa tecnica di rottura del gene è stata utilizzata per analisi di funzione del gene in una vasta gamma di taxa, dai batteri ai mammiferi. Un costrutto di rottura del gene è necessario per la generazione del ceppo gene-interrotto; Questo costrutto di acido desossiribonucleico (DNA) consiste del gene marcatore di resistenza agli antibiotici fuso a Monte e a valle delle regioni fiancheggianti del gene target ed è incorporato il genoma tramite ricombinazione omologa. Il ceppo di gene-interrotto può essere isolato utilizzando terreni selettivi che contengono l'antibiotico. Il metodo convenzionale utilizzato per la costruzione del ceppo gene-interrotto richiede operazioni complesse, quali l'amplificazione del gene target da reazione a catena della polimerasi (PCR), legatura del gene in un plasmide adatto, digestione con restrizione enzimi e religation per inserire il gene marcatore di resistenza agli antibiotici. Questo processo è che richiede tempo, prendendo diversi giorni a diverse settimane, a seconda dell'esito di ogni passo. Inoltre, il design dei costrutti di rottura è dipenda sui siti degli enzimi di limitazione del gene target. Per risolvere questi problemi, sono stati segnalati basati su PCR del DNA metodi d'impionbatura2 1,per la progettazione di gene-perturbato mutanti di Dictyostelium discoideum3 e Synechocystis SP. PCC68034 . Nello studio presente, è stato sviluppato un metodo per generare un ceppo streptococcico gene-interrotto in maniera relativamente rapida, facile e poco costoso, che utilizza un metodo basato su PCR modificato (designato fusione 2-step PCR) per la costruzione della perturbazione costrutto ed elettroporazione per trasformazione genetica.
La fusione di 2-step che PCR richiede DNA genomic, gene marcatore di resistenza agli antibiotici come un modello PCR e quattro coppie di opportunamente progettato gli iniettori del oligonucleotide. Nella prima fase (1st PCR), una regione di accompagnamento 1 kb a Monte del gene target, una regione di fiancheggiamento 1 kb a valle della destinazione gene e gene marcatore di resistenza agli antibiotici sono amplificati mediante PCR. Regioni 5' sia il primer reverse e il primer in avanti, per l'amplificazione della a Monte e a valle delle regioni, fiancheggianti rispettivamente, includono 15 basi complementari fino agli estremi confini del gene marcatore. 5' regioni di sia forward e reverse primer per l'amplificazione del gene marcatore Analogamente includono 15 basi complementari all'estremità inferiore della regione di fiancheggiamento a Monte del gene dell'obiettivo e l'estremità superiore della regione di fiancheggiamento a valle del gene target, rispettivamente. Di conseguenza, i tre frammenti amplificati contengono regioni sovrapposte di coppia 30-base presso il sito di fusione. Nella seconda fase (2nd PCR), PCR viene eseguita con gli iniettori PCR annidati utilizzando i tre frammenti amplificati da 1st PCR come modelli. Le regioni complementari dei modelli sono inoltre collegate tra loro tramite la 2nd PCR. Infine, il costrutto per ricombinazione omologa è stato introdotto al ceppo selvaggio-tipo di elettroporazione. Successo del gene può essere verificato mediante PCR utilizzando primers specifici. Anche se il costrutto di rottura è amplificato utilizzando ad alta fedeltà della polimerasi del DNA, ulteriori reazioni enzimatiche, come la legatura del DNA o digestione del DNA, non sono necessari per generare il costrutto. Inoltre, una regione eliminata o conservata sul genoma può essere scelti in modo flessibile secondo il disegno dell'iniettore.
Nel presente lavoro, l'eliminazione di intera regione di codificazione del gene gtfC , che codifica glucosiltransferasi in Streptococcus mutans, è stata eseguita per illustrare il metodo di rottura rapida, facile gene in una specie streptococciche. Inoltre, un gtfB-ceppo interrotta è stato generato nello stesso modo. Il glucosyltransferases codificati da sia gtfC e gtfB contribuiscono a cariogeni biofilm dentale sviluppo5,6. Le abilità che formano biofilm del selvaggio-tipo di ceppo (S. mutans WT), gtfC-interrotto ceppo (S. mutans ΔgtfC) e gtfB-ceppo perturbato (S. mutans ΔgtfB) sono stati valutati per analisi fenotipiche comparative. Questo protocollo si estende l'applicazione di un metodo in due fasi per rottura del gene ad un'altre specie e può essere modificato per gli studi di funzione del gene in una gamma più ampia di taxa.

<table><tbody><tr><td>Streptococus mutans</td><td>Ceppo stock in laboratorio.</td><td></td><td>Ceppo wild-type (ceppo UA159)</td></tr><tr><td>Kit di estrazione del DNA genomico</td><td>Zymo Research</td><td>D6005</td><td></td></tr><tr><td>Apparato di interruzione del bead-beating</td><td>Taitec</td><td>GM-01</td><td></td></tr><tr><td>Geni sintetici</td><td>Eurofins Genomica Gene</td><td>di</td><td>resistenza alla spectinomicina e all'eritromicina</td>ordinato</tr><tr><td>su misura Termociclatore</td><td>Astec</td><td>PC-708</td><td></td></tr><tr><td>Primer PCR</td><td>Eurofins Genomics</td><td>35 basi di lunghezza</td><td>della</td></tr><tr><td>DNA polimerasi</td><td>Takara</td><td>R045A</td> Kit di estrazione su gel della <td>DNA polimerasi ad alta fedeltà</td></tr><tr><td></td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-91202</td><td>Estrazione del DNA dal gel di agarosio</td></tr><tr><td>Taglierina per bande di gel</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-830</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>Beckman Coulter</td><td>DU 800</td><td></td></tr><tr><td>Elettroporatore</td><td>Bio-rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetta per elettroporazione</td><td>Bio-rad</td><td>1652086</td><td>0,2 cm di spazio</td></tr><tr><td>Anaeropack</td><td>Mitsubishi Gas Chemical</td><td>A-03</td><td>Sistema di coltura anaerobica</td></tr><tr><td>Brodo per infusione di cuore cerebrale</td><td>Becton, Dickinson</td><td>237500</td><td>Terreno di coltura batterica</td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Wako</td><td>195-11531</td><td>Antibiotici</td></tr><tr><td>Eritromicina</td><td>Wako</td><td>057-07151</td><td>Antibiotici</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td>Per lo sviluppo di biofilm</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>Per colorazione di biofilm</td></tr></tbody></table>

generazione di un gene-interrotto lo streptococco mutans strain senza clonaggio genico

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Metodi tipici per la delucidazione della funzione di un gene particolare coinvolgono analisi comparative fenotipiche del ceppo selvaggio-tipo e un ceppo in cui è stato interrotto il gene di interesse. Un costrutto di DNA di rottura del gene contenente un gene marcatore di resistenza agli antibiotici adatti è utile per la generazione di ceppi gene-interrotto nei batteri. Tuttavia, metodi di costruzione tradizionali, che richiedono passaggi clonazione genica, coinvolgono protocolli lunghi e complessi. Qui, un metodo relativamente facile, rapido e conveniente per rottura del gene mirati in Streptococcus mutans è descritto. Il metodo utilizza una reazione a catena della polimerasi (PCR) per generare il costrutto di rottura e l'elettroporazione per trasformazione genetica fusione 2-step. Questo metodo non richiede una reazione enzimatica, diverso da PCR e inoltre offre una maggiore flessibilità in termini di design del costrutto rottura. L'occupazione dell'elettroporazione facilita la preparazione di cellule competenti e migliora l'efficienza di trasformazione. Il presente metodo può essere adattato per la generazione di ceppi gene-interrotto di varie specie.

La figura 2 Mostra che la dimensione di ciascun prodotto dal 1st PCR, come osservato su gel di agarosio all'1%, era in buon accordo con la dimensione prevista di circa 1 kb. La figura 3 Mostra l'analisi di elettroforesi del gel dei prodotti della 2nd PCR. La figura 4 Mostra S. mutans colonie trasformate con il costrutto di rottura e un'analisi di elettroforesi del gel d...

Descriviamo un metodo facile, rapido e relativamente poco costoso per la generazione di gene-interrotto lo streptococco mutans ceppi; Questa tecnica può essere adattata per la generazione di ceppi gene-interrotto di varie specie.

Generazione di un Gene-interrotto lo streptococco mutans Strain senza clonaggio genico

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare ceppi mirati di Streptococcus mutans geneticamente distrutti utilizzando una PCR di fusione in due fasi e l'elettroporazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microbiologia, come ad esempio il funzionamento di un gene di interesse. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non è richiesta alcuna reazione enzimatica diversa dalla PCR e che la preparazione competente delle celle per l'elettroporazione è abbastanza semplice. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla tecnica di distruzione genica dello Streptococcus mutans, può essere applicato anche ad altre specie microbiche come lo Staphylococcus aureus. Generalmente gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché non hanno familiarità con l'efficacia dei primer nidificati per la seconda PCR. A dimostrare la procedura sarà la dottoressa Ayako Okada, un'istruttrice di ricerca del nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, strisciare S.mutans UA159 su un'infusione di cuore cerebrale o su una piastra di agar BHI e incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius in condizioni anaerobiche. Il giorno seguente, usa uno stuzzicadenti sterilizzato per raccogliere una singola colonia e inocularela in cinque millilitri di brodo BHI. Incubare la coltura di S. mutans per una notte a 37 gradi Celsius in condizioni anaerobiche. Quindi, centrifugare la coltura a 2000 volte G per 15 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di PBS. Centrifugare nuovamente a 2000 volte G per 15 minuti. Risospendere il pellet cellulare risultante in 200 microlitri di PBS. Estrarre il DNA genomico dalla sospensione utilizzando un kit di estrazione del DNA genomico basato sul bead-beating. Per prima cosa trasferire la sospensione cellulare in una provetta da due millilitri contenente perle di vetro. Quindi aggiungere 750 microlitri di soluzione di lisi alla sospensione cellulare. Tappare bene i tubi e posizionarli simmetricamente nel supporto del tubo dell'apparecchio di disgregazione del tallone. Lavorare alla massima velocità per cinque minuti. Centrifugare i campioni perlati a 10.000 volte G per un minuto. Trasferire il surnatante in una colonna di centrifuga in una provetta di raccolta da due millilitri e centrifugare a 7000 volte G per un minuto. Aggiungere 1200 microlitri di tampone legante il DNA al filtrato e trasferire 800 microlitri della miscela nella colonna di centrifuga in una provetta di raccolta da due millilitri. Centrifugare a 10.000 volte G per un minuto. Scartare il flusso. Aggiungere 200 microlitri di tampone di prelavaggio alla colonna di centrifuga per lavare la matrice della colonna e centrifugare di 10.000 volte G per un minuto. Scartare il flusso, aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio alla colonna di centrifuga per lavare la matrice della colonna e centrifugare nuovamente. Posizionare ogni colonna di centrifuga in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri e aggiungere 100 microlitri di tampone di eluizione alla matrice della colonna. Centrifugare a 10.000 volte G per 30 secondi per eluire il DNA genomico. Stimare la concentrazione e la purezza del DNA misurando l'assorbanza a 260 nanometri e 280 nanometri utilizzando uno spettrofotometro. La prima PCR viene eseguita utilizzando il genoma wild type di S. mutans e il gene sintetico di resistenza alla streptomicina come modelli PCR. Tre serie di primer sono utilizzate per amplificare, rispettivamente, la regione fiancheggiante a monte del gene della glicosiltransferasi C o gtfC, la regione fiancheggiante a valle del gene gtfC e il gene di resistenza alla spectinomicina. Frazionare ogni prodotto PCR su un gel di agarosio all'1%. La dimensione di ciascun prodotto dalla prima PCR deve essere di circa un KB. Utilizzare un taglierina per bande di gel per asportare le bande corrispondenti e purificare ogni prodotto di DNA amplificato come indicato nel protocollo di testo. Il passo successivo consiste nell'utilizzare i tre frammenti molari approssimativamente uguali come modelli di PCR per eseguire la seconda PCR. Questi frammenti vengono amplificati e uniti utilizzando inneschi appropriati per produrre il costrutto di disgregazione. Poiché il successo di questa procedura dipende dall'amplificazione del costrutto di interruzione mediante seconda PCR, è importante confermare il secondo prodotto PCR mediante elettroforesi. Caricare 1/10 della miscela di reazione PCR su un gel di agarosio allo 0,8% per confermare che l'amplicone generato abbia la dimensione della banda prevista. In questo esempio, i primer nidificati hanno fornito un'amplificazione molto migliore. Trasferire la miscela PCR rimanente in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e aggiungere 55 microlitri di acqua ultrapura per regolare il volume totale a 100 microlitri. Aggiungere 1/10 di volume di acetato di sodio a tre molari pH 5,2, seguito da 2,5 volumi di etanolo al 100% e mescolare. Congelare a meno 80 gradi Celsius per 30 minuti. Centrifugare a 15.000 volte G a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Al termine della centrifugazione, controllare la presenza di pellet sul fondo della provetta. Scartare il surnatante. Lavare il pellet con un millilitro di etanolo al 70% e centrifugare a 15.000 volte G a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Eliminare il surnatante e asciugare il pellet all'aria per circa 30 minuti. Infine, sciogliere il pellet con 10 microlitri di acqua ultrapura. Le cellule S. mutans UA159 competenti sono state precedentemente preparate e conservate come aliquote da 50 microlitri a meno 80 gradi Celsius.Mescolare ogni aliquota da 50 microlitri di cellule competenti ghiacciate con cinque microlitri del costrutto di interruzione. Aggiungere la miscela alle cuvette per elettroporazione con una distanza di 0,2 centimetri tra gli elettrodi. Eseguire l'elettroporazione utilizzando la modalità Staphylococcus aureus dell'apparecchio di elettroporazione. Immediatamente dopo l'elettroporazione, sospendere le cellule in 500 microlitri di brodo BHI e aggiungere 50 microlitri della sospensione alle piastre di agar BHI contenenti spectinomicina. Incubare le piastre per due-sei giorni a 37 anni

generation-gene-disrupted-streptococcus-mutans-strain-without-gene

Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Sistematiche e su larga scala di sintesi genetica (gene-gene o epistasi) schermi di interazione può essere utilizzato per esplorare la ridondanza genetica e via di cross-talk. Qui, descriviamo un high-throughput quantitativa sintetica genetica tecnologia di retinatura array, definito eSGA che abbiamo sviluppato per chiarire i rapporti epistatiche ed esplorare reti di interazione genetici...

Mappatura batteriche reti funzionali e sulle vie di<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizzando matrici sintetiche genetiche

Un efficiente genoma unico metodo di mutazione del gene è stata stabilita...

Genome-wide gene delezioni in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Da Throughput PCR ad alta

Fonte: Lea-Smith, D. J., et al. Generazione di mutanti marcati e privi di marcatori in specie cianobatteriche modello. J. Vis. Exp. (2016)Il video mostra un metodo per generare mutanti marcati con antibiotici nei cianobatteri. Il protocollo inizia con la coltura dei cianobatteri, seguita dalle fasi di centrifugazione e lavaggio che preservano i pili superficiali. Viene quindi introdotto un plasmide che trasporta un gene di resistenza agli antibiotici affiancato da sequenze omologhe. Durante...

Generazione di mutanti marcati con antibiotici nei cianobatteri tramite ricombinazione omologa

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the phage-mediated transfer of donor DNA carrying an excisable antibiotic resistance cassette into Escherichia coli. The integrated cassette replaces the target gene via homologous recombination, resulting in a stable gene deletion.

Generating Gene Deletions in E. coli via Phage-Mediated Transfer of an Excisable Antibiotic Cassette

Enterobacter sp. YSU cresce in glucosio sali minima quantità di terreno. Auxotrofi sono generati trasformandola con transposome che si inserisce in modo casuale nel genoma dell'ospite. Mutanti si trovano di replicazione delle piastre da medie complesso terreno minimo. Geni interrotti sono identificati da salvataggio e sequenziamento del gene.

Generazione di Enterobacter Sp. YSU auxotrofi Utilizzando Transposon Mutagenesi

L'introduzione di molteplici alterazioni genomiche nei cianobatteri è uno strumento essenziale nello sviluppo di ceppi per scopi industriali e di ricerca di base. Descriviamo un sistema per la generazione di mutanti non marcati nella specie cianobatterica modello Synechocystis sp. PCC6803 e mutanti marcati in Synechococcus sp. PCC7002.

Generazione di marcato e markerless Mutanti nel modello di cianobatteri Specie

Qui presentiamo un protocollo per l'uso di pre-esistente antibiotico resistenza-cassette eliminazione costrutti come base per la fabbricazione di mutanti di delezione in altri ceppi di Escherichia coli . Tali mutazioni di omissione possono essere mobilitati e inseriti il locus corrispondente di un ceppo destinatario mediante trasduzione del batteriofago P1.

Produzione di delezioni del Gene in Escherichia coli di trasduzione P1 con cassette di resistenza agli antibiotici soggetti ad accisa

Descritto qui è un metodo semplice per la purificazione di un prodotto genetico in Streptococcus mutans. Questa tecnica può essere vantaggiosa nella purificazione delle proteine, in particolare le proteine della membrana e le proteine ad alta massa molecolare, e può essere utilizzata con varie altre specie batteriche.

Purificazione di una proteina di massa molecolare elevata in Streptococcus mutans

Qui, descriviamo un protocollo semplice e riproducibile del modello murino di infezione per valutare l'attenuazione dei ceppi geneticamente modificati di Pseudomonas aeruginosa rispetto alla Escherichia coli approvata dalla FDA (Food and Drug Administration) degli Stati Uniti per applicazioni commerciali.

Generazione di mutanti di eliminazione genica in-frame in Pseudomonas aeruginosa e test per l'attenuazione della virulenza in un semplice modello di infezione del mouse

Descritto qui è un metodo per la delezione genica mirata e senza marcatori nella chlamydia trachomatis utilizzando la mutagenesi di scambio letale delle cassette scambiate, FLAEM.

Markerless Gene Deletion di Mamicino Scambio Allelicas in Chlamydia trachomatis

Qui, descriviamo la costruzione di mutanti nulli di Aeromonas in specifiche glicosiltransferasi o regioni contenenti glicosiltransferasi, i saggi di motilità e la purificazione dei flagelli eseguiti per stabilire il coinvolgimento e la funzione dei loro enzimi codificati nella biosintesi di un glicano, nonché il ruolo di questo glicano nella patogenesi batterica.

Generazione di mutanti nulli per chiarire il ruolo delle glicosiltransferasi batteriche nella motilità batterica

Scopri un metodo rapido ed economico per generare ceppi di Streptococcus mutans con geni interrotti mediante PCR di fusione in due passaggi ed elettroporazione. Questa tecnica semplificata accelera la ricerca genetica in microbiologia.

Generazione di un Gene-interrotto lo streptococco mutans Strain senza clonaggio genico

Esplora altri video