Generazione di un Gene-interrotto lo streptococco mutans Strain senza clonaggio genico

L'obiettivo generale di questa procedura è generare ceppi mirati di Streptococcus mutans geneticamente distrutti utilizzando una PCR di fusione in due fasi e l'elettroporazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microbiologia, come ad esempio il funzionamento di un gene di interesse. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non è richiesta alcuna reazione enzimatica diversa dalla PCR e che la preparazione competente delle celle per l'elettroporazione è abbastanza semplice. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla tecnica di distruzione genica dello Streptococcus mutans, può essere applicato anche ad altre specie microbiche come lo Staphylococcus aureus. Generalmente gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché non hanno familiarità con l'efficacia dei primer nidificati per la seconda PCR. A dimostrare la procedura sarà la dottoressa Ayako Okada, un'istruttrice di ricerca del nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, strisciare S.mutans UA159 su un'infusione di cuore cerebrale o su una piastra di agar BHI e incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius in condizioni anaerobiche. Il giorno seguente, usa uno stuzzicadenti sterilizzato per raccogliere una singola colonia e inocularela in cinque millilitri di brodo BHI. Incubare la coltura di S. mutans per una notte a 37 gradi Celsius in condizioni anaerobiche. Quindi, centrifugare la coltura a 2000 volte G per 15 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di PBS. Centrifugare nuovamente a 2000 volte G per 15 minuti. Risospendere il pellet cellulare risultante in 200 microlitri di PBS. Estrarre il DNA genomico dalla sospensione utilizzando un kit di estrazione del DNA genomico basato sul bead-beating. Per prima cosa trasferire la sospensione cellulare in una provetta da due millilitri contenente perle di vetro. Quindi aggiungere 750 microlitri di soluzione di lisi alla sospensione cellulare. Tappare bene i tubi e posizionarli simmetricamente nel supporto del tubo dell'apparecchio di disgregazione del tallone. Lavorare alla massima velocità per cinque minuti. Centrifugare i campioni perlati a 10.000 volte G per un minuto. Trasferire il surnatante in una colonna di centrifuga in una provetta di raccolta da due millilitri e centrifugare a 7000 volte G per un minuto. Aggiungere 1200 microlitri di tampone legante il DNA al filtrato e trasferire 800 microlitri della miscela nella colonna di centrifuga in una provetta di raccolta da due millilitri. Centrifugare a 10.000 volte G per un minuto. Scartare il flusso. Aggiungere 200 microlitri di tampone di prelavaggio alla colonna di centrifuga per lavare la matrice della colonna e centrifugare di 10.000 volte G per un minuto. Scartare il flusso, aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio alla colonna di centrifuga per lavare la matrice della colonna e centrifugare nuovamente. Posizionare ogni colonna di centrifuga in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri e aggiungere 100 microlitri di tampone di eluizione alla matrice della colonna. Centrifugare a 10.000 volte G per 30 secondi per eluire il DNA genomico. Stimare la concentrazione e la purezza del DNA misurando l'assorbanza a 260 nanometri e 280 nanometri utilizzando uno spettrofotometro. La prima PCR viene eseguita utilizzando il genoma wild type di S. mutans e il gene sintetico di resistenza alla streptomicina come modelli PCR. Tre serie di primer sono utilizzate per amplificare, rispettivamente, la regione fiancheggiante a monte del gene della glicosiltransferasi C o gtfC, la regione fiancheggiante a valle del gene gtfC e il gene di resistenza alla spectinomicina. Frazionare ogni prodotto PCR su un gel di agarosio all'1%. La dimensione di ciascun prodotto dalla prima PCR deve essere di circa un KB. Utilizzare un taglierina per bande di gel per asportare le bande corrispondenti e purificare ogni prodotto di DNA amplificato come indicato nel protocollo di testo. Il passo successivo consiste nell'utilizzare i tre frammenti molari approssimativamente uguali come modelli di PCR per eseguire la seconda PCR. Questi frammenti vengono amplificati e uniti utilizzando inneschi appropriati per produrre il costrutto di disgregazione. Poiché il successo di questa procedura dipende dall'amplificazione del costrutto di interruzione mediante seconda PCR, è importante confermare il secondo prodotto PCR mediante elettroforesi. Caricare 1/10 della miscela di reazione PCR su un gel di agarosio allo 0,8% per confermare che l'amplicone generato abbia la dimensione della banda prevista. In questo esempio, i primer nidificati hanno fornito un'amplificazione molto migliore. Trasferire la miscela PCR rimanente in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e aggiungere 55 microlitri di acqua ultrapura per regolare il volume totale a 100 microlitri. Aggiungere 1/10 di volume di acetato di sodio a tre molari pH 5,2, seguito da 2,5 volumi di etanolo al 100% e mescolare. Congelare a meno 80 gradi Celsius per 30 minuti. Centrifugare a 15.000 volte G a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Al termine della centrifugazione, controllare la presenza di pellet sul fondo della provetta. Scartare il surnatante. Lavare il pellet con un millilitro di etanolo al 70% e centrifugare a 15.000 volte G a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Eliminare il surnatante e asciugare il pellet all'aria per circa 30 minuti. Infine, sciogliere il pellet con 10 microlitri di acqua ultrapura. Le cellule S. mutans UA159 competenti sono state precedentemente preparate e conservate come aliquote da 50 microlitri a meno 80 gradi Celsius.Mescolare ogni aliquota da 50 microlitri di cellule competenti ghiacciate con cinque microlitri del costrutto di interruzione. Aggiungere la miscela alle cuvette per elettroporazione con una distanza di 0,2 centimetri tra gli elettrodi. Eseguire l'elettroporazione utilizzando la modalità Staphylococcus aureus dell'apparecchio di elettroporazione. Immediatamente dopo l'elettroporazione, sospendere le cellule in 500 microlitri di brodo BHI e aggiungere 50 microlitri della sospensione alle piastre di agar BHI contenenti spectinomicina. Incubare le piastre per due-sei giorni a 37 anni