Name: In Vitro Fagocitosi di residui del Myelin dai macrofagi derivate da midollo osseo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Scopri come valutare la fagocitosi dei residui di mielina da parte dei macrofagi derivati dal midollo osseo murino. Questo metodo efficiente e conveniente permette di studiare le risposte immunitarie nel campo del neurotrauma.

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Gli autori vorrei ringraziare Glenn Sanger-Hodgson, Media Specialist presso la FSU College of Medicine per tutta la sua opera nella produzione di video, l'editing e Voice-over.
Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (R01GM100474 e R01GM072611).

I metodi descritti qui e nella sezione 2 sono stati approvati dalla Florida State University istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) e segue le linee guida stabilite in Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, 8° edizione . Tutti gli animali utilizzati in questo in questo protocollo sono di casa in una struttura di animali di laboratorio dedicato fino all'utilizzo. Nessuna sperimentazione in vivo è stato eseguito prima del sacrificio. Numero di animali era basate su necessità sperimentali utilizzando media delle celle e collezioni di mielina come guida al fine di ridurre al minimo l'utilizzo.
Nota: Questo protocollo descrive la generazione dei macrofagi derivate da midollo osseo (BMDMs) (sezione 1), la preparazione dei residui del myelin fluorescente contrassegnati di cervello-derivato (sezione 2), la procedura generale per l'analisi di fagocitosi di detriti della mielina (sezione 3), e la procedura generale per l'analisi di accumulazione di mielina detriti del lipido (sezione 4). Preparazione dei reagenti, cella raccolta e manipolazione, raccolta di mielina ed etichettatura e performance test dovrebbe essere completati in una flusso d'aria laminare di biosicurezza.
1. generazione dei macrofagi primari derivanti dal midollo osseo
<ol>
	<li>Preparazione del terreno di coltura completa del macrofago (cm) Nota: generazione del macrofago dal midollo osseo richiede l'uso del fattore distimolazione del macrofago (M-CSF). Questa preparazione utilizza i L929 dei fibroblasti murini condizionato media come fonte di M-CSF.<ol>
		<li>Generare i media di fibroblasti murini condizionato L929 dalle cellule di coltura in piastre da 145 mm con 50 mL di alto glucosio (4500 mg/L L-glucosio) Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) completati con siero di vitello nato nuovo 5% (NCS) e penicillina/streptomicina per 7 giorni.</li>
		<li>Raccogliere media da culture in provette centrifuga a fondo conico da 50 mL e centrifugare per 30 minuti a 3500 x g, 4 ° C.</li>
		<li>Filtrare i surnatanti attraverso un filtro per siringa 0,2 µm in una nuova provetta conica 50 mL. Media condizionati possa essere memorizzati a-80 ° C fino a 6 mesi.</li>
		<li>Ad alto glucosio DMEM, aggiungere 5% vol/vol NCS, 15% vol/vol L929 dei fibroblasti murini condizionata DMEM e 1% penicillina/streptomicina. Media può essere memorizzato a 4 ° C per 2-3 mesi. Calda a 37 ° C prima dell'uso.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Raccolta di cellule del midollo osseo primario e induzione del macrofago 
	Nota: Utilizzando questo protocollo un mouse genererà circa 20 milioni derivanti dal midollo osseo macrofagi (BMDMs).<ol>
		<li>Eutanasia il numero desiderato di 8-10 settimana vecchi topi utilizzando le linee guida standard CO2 asfissia seguiti da dislocazione cervicale.</li>
		<li>Sterilizzare l'animale utilizzando 70% etanolo (vol/vol): H2O, saturando la pelliccia.</li>
		<li>Fare un piccolo taglio nell'addome e attentamente tirare indietro la pelle per rivelare il tessuto sottostante. Fare attenzione a non forare la cavità peritoneale.</li>
		<li>Rimuovere entrambi i piedini posteriori a partire dell'anca e termina alla caviglia. Posto il tessuto raccolto in una capsula Petri 100 mm contenenti fosfato sterile 5-10 mL tampone salino (PBS) completato con 1% penicillina/streptomicina. 
		Nota: Quando l'elaborazione di diversi animali assicuratevi di mantenere i piatti sul ghiaccio per limitare la degradazione del tessuto.</li>
		<li>Togliere l'osso usando un bisturi muscolare e del tessuto connettivo. Solo il femore e la tibia sono utilizzati per la raccolta delle cellule, può essere scartato il perone.</li>
		<li>Esporre la cavità del midollo delle ossa raccolte tagliando una piccola sezione da ogni estremità con un bisturi.</li>
		<li>Utilizzando un ago 25g, sciacquare la cavità del midollo con 59cm in una provetta conica per centrifuga da 50 mL. Le ossa apparirà bianche una volta che essi sono state svuotate sufficientemente.</li>
		<li>Una volta ultimata la raccolta, agitare aspira con un ago da 18g per 30-90 s generare una sospensione unicellulare. 
		Nota: Un passaggio di lisi opzionale di globuli rossi (RBC) può essere eseguita a questo punto. Recentemente è stato suggerito che il contenuto intracellulare del ferro può influenzare gli effetti di residui del myelin sopra del macrofago polarizzazione16. Per ulteriori informazioni per quanto riguarda l'inclusione di un passo di lisi RBC fare Trouplin et al. 17.</li>
		<li>Filtrare la sospensione attraverso un colino di sterile cella 70 µm in una nuova provetta conica 50 mL.</li>
		<li>Seme raccolto cellule uniformemente in piastre di coltura cellulare 145 mm contenente mL 15-20 cm. Utilizzare circa tre piastre di coltura per topo sacrificato. Incubare le colture a 37 ° C, 5% CO2.</li>
		<li>Dopo 72 ore lavare le piastre una volta con PBS sterile per rimuovere le cellule non-aderenti, quindi aggiungere 15-20mL 59cm fresco. Incubare le colture per altri 4 giorni a 37 ° C, 5% CO2. Dopo 7 giorni di cultura totale, le cellule di midollo osseo ematopoietico inizialmente isolate sarà maturo BMDMs (Figura 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. generazione di residui del Myelin fluorescente contrassegnati cervello-derivato
Nota: Tutti i reagenti possono essere conservati a 4 ° C fino a 1 mese.
<ol>
	<li>Preparazione dei reagenti di raccolta detriti mielina
	<ol>
		<li>Preparare Tris· Soluzione tampone di cl.<ol>
			<li>A 800mL di acqua distillata deionizzata H2O (ddiH2O), aggiungere 20 mL di 1 M Tris· CL, pH 7,45 (concentrazione finale di 20 mM) e 20 mL di 100 mM Na2EDTA (concentrazione finale di 2 mM).</li>
			<li>Regolare il pH a 7,45. Regolare il volume a 1000 mL con ddiH2O. filtro soluzione attraverso un'unità di filtrazione 0,2 µm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Preparare la soluzione di saccarosio 1m.<ol>
			<li>A 100 mL di Tris· CL soluzione tampone, aggiungere 68,46 g di saccarosio. Regolare il volume a 200 mL con Tris· Soluzione tampone di cl. Filtrare la soluzione attraverso un'unità di filtrazione di 0,2 µm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Preparare 200 mL di soluzione di saccarosio 0,32 M diluendo la soluzione di 1m con il Tris· CL 0.83:0.16 di soluzione tampone (vol/vol).</li>
		<li>Preparare 150 mL di soluzione di saccarosio 0,83 M diluendo la soluzione di 1m con il Tris· CL 0.83:0.16 di soluzione tampone (vol/vol).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Raccolta di residui del myelin greggio cervello-derivato 
	Nota: Il metodo di prelievo descritto qui è per l'isolamento dei residui del myelin grezza.<ol>
		<li>Eutanasia, topi di 10-12 8-10 settimane di età utilizzando direttive standard di CO2 asfissia seguite da dislocazione cervicale.</li>
		<li>Sezionare i cervelli e metterli in un piatto di 100 mm contenente 10 mL di soluzione di saccarosio 0,32 M.</li></ol></li></ol>Tenere il piatto sul ghiaccio.
		<li>Usando le forbici chirurgiche sterili tagliare i cervelli in pezzi di circa 5 mm3 dimensioni.</li>
		<li>Trasferire il tessuto di una provetta conica per centrifuga da 50 mL e aggiungere circa 30 mL di soluzione di saccarosio 0,32 M.</li>
		<li>Omogeneizzare con un omogeneizzatore rotativo manuale sterile, finché non si ottiene una soluzione liscia.</li>
		<li>Diluire l'omogeneizzato cervelli ad un volume finale di 90 mL con una soluzione di saccarosio 0,32 M.</li>
		<li>A sei tubi di 38,5-mL con pareti sottili in polipropilene ultracentrifuga, aggiungere 20 mL di soluzione di saccarosio 0,83 M.</li>
		<li>Delicatamente aggiungere la soluzione di omogeneizzato cervello alla parte superiore della soluzione di saccarosio 0,83 M, facendo attenzione a non per mescolare i due strati.</li>
		<li>Equilibrio di ciascuna provetta con la soluzione di saccarosio 0,32 M.</li>
		<li>Centrifuga a 100.000 x g per 45 min a 4° C, utilizzando un appropriato preraffreddata rotore ultracentrifuga. Impostato sui valori minimi per ridurre la perdita di mielina detriti rotore accelerazione e decelerazione.</li>
		<li>Raccogliere i residui del myelin dall'interfaccia delle due densità di saccarosio. 
		Nota: detriti dovrebbero apparire come una banda bianca verso il centro del tubo.</li>
		<li>Combinare i residui del myelin grezzo in una provetta conica per centrifuga da 50 mL e regolare il volume a circa 35 mL utilizzando Tris· Soluzione tampone di cl.</li>
		<li>Omogeneizzare i residui del myelin grezzo con un omogeneizzatore rotativo manuale sterile per 30-60 s.</li>
		<li>Dividere equamente la sospensione tra 6 tubi di ultracentrifuga pulito ed equilibrio con un volume adeguato di Tris· Soluzione tampone di cl.</li>
		<li>Centrifuga a 100.000 x g per 45 min a 4° C, utilizzando un appropriato preraffreddata rotore ultracentrifuga. Impostato sui valori massimi rotore accelerazione e decelerazione.</li>
		<li>Come solido bianco pellet sarà ora visibile, eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 10-15 mL di Tris· Soluzione tampone di cl.</li>
		<li>Dividere equamente la sospensione tra 2 tubi ultracentrifuga pulito ed equilibrio con un volume adeguato di Tris· Soluzione tampone di cl.</li>
		<li>Centrifugare nuovamente a 100.000 x g per 45 min a 4 ° C, utilizzando un appropriato preraffreddata rotore ultracentrifuga. Impostato sui valori massimi rotore accelerazione e decelerazione.</li>
		<li>Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 5-6 mL di PBS sterile e dividere la sospensione tra un numero adeguato di tubi micro-centrifuga pre-pesati 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifuga a 22.000 x g per 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Scartare il surnatante e determinare il peso delle palline di detriti di mielina.</li>
		<li>Risospendere il pellet in PBS a una concentrazione finale di 100 mg/mL. 
		Nota: dieci-dodici cervelli è abbastanza per produrre 10-15ml di residui del myelin 100 mg/mL. Residui del myelin possono essere conservare a-80 ° C per 6 mesi.</li>
	
	
	<li>Contrassegno fluorescente di mielina detriti
	<ol>
		<li>Preparare la soluzione di 50 µM carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) immediatamente prima dell'uso.<ol>
			<li>Utilizzando PBS sterile, diluire una soluzione di riserva di 5 mM di CFSE preparati con 100% dimetilsolfossido (DMSO) a una concentrazione finale di lavoro di 50 µM.</li>
			<li>Filtrare la soluzione attraverso un filtro per siringa 0,2 µm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Scongelare la quantità desiderata di residui del myelin 100 mg/mL e risospendere con un ago sterile 29 g. 
		Nota: i residui del myelin di congelamento provoca l'abbandonano la soluzione che richiede risospensione prima dell'uso.</li>
		<li>Trasferire i residui del myelin a una micro-centrifuga pre-pesati 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifuga a 14.800 x g per 10 min a 4° C. Scartare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere i residui del myelin in 200 µ l di soluzione di CFSE per 100 residui del myelin µ l pellettati.</li>
		<li>Incubare per 30 min a temperatura ambiente (TA) al riparo dalla luce.</li>
		<li>Centrifuga a 14.800 x g per 10 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere il pellet in 600-800 µ l di tampone di lavaggio (0,2 µm filtro sterilizzato glicina 100mm in PBS).</li>
		<li>Centrifuga a 14.800 x g per 10 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 2.3.8-2.3.9 altre due volte.</li>
		<li>Dopo il lavaggio finale, determinare il peso del pellet di detriti di mielina e risospendere a 100 mg/mL con PBS sterile. Nota: Residui del myelin con etichetta possono essere conservare a-80 ° C fino a 6 mesi.</li>
	</ol>
	</li>

3. mielina detriti test di fagocitosi
Nota: Di seguito è riportato il metodo di base per l'osservazione di fagocitosi di residui del myelin fluorescente contrassegnati. Aggiunta di altri trattamenti e condizioni sperimentali dovrà essere ottimizzata dallo sperimentatore.
<ol>
	<li>Preparazione delle piastre di trattamento
	<ol>
		<li>Per ogni piastra 145mm, raccogliere BMDMs maturo in una provetta conica per centrifuga 15 mL con 5-6 mL di acido etilendiamminotetracetico 10mm (ed) in soluzione tampone fosfato di Dulbecco (dPBS) (pH 7.4). 
		Nota: Non utilizzare tripsina in quanto può alterare lo stato di attivazione delle cellule18.</li>
		<li>Aggiungere un volume uguale di 59cm pre-riscaldato a ciascuna provetta di cellule prelevate.</li>
		<li>Centrifugare a 180 x g per 8 min 20 ° C. Scartare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere le cellule in 59cm e conteggio.</li>
		<li>A ciascun pozzetto di una piastra di coltura cellulare 24 pozzetti, aggiungere 1 x 105 cellule in 1 mL di 59cm.</li>
		<li>Incubare a 37 ° C, 5% CO2 per 24 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analisi e trattamento di detriti di mielina
	<ol>
		<li>Aggiungere 10 µ l di 100 mg/mL CFSE etichettato residui del myelin in ciascun pozzetto (concentrazione finale di 1 mg/mL).</li>
		<li>Incubare per 1-3 ore a 37 ° C, 5% CO2.</li>
		<li>Lavare la piastra 3 volte con PBS sterile per rimuovere residui del myelin non inghiottito.</li>
		<li>Aggiungere 400 µ l di paraformaldeide al 4% ad ogni pozzetto. Incubare per 30 minuti a TA.</li>
		<li>Lavare la piastra 2 volte con PBS sterile.</li>
		<li>Aggiungere 400 µ l di soluzione di Hoechst 33258 a ciascun pozzetto. Incubare per 5 min a temperatura ambiente al riparo dalla luce.</li>
		<li>Lavare le piastre 2 volte con PBS sterile.</li>
		<li>Aggiungere 200 µ l di Fluoro-gel con tampone Tris ad ogni pozzetto per ridurre photobleaching.</li>
		<li>Celle di immagine utilizzando un microscopio in grado di epi-fluorescenza invertito. 
		Nota: Lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione della CFSE è 494 nm e 521 nm, rispettivamente.</li>
		<li>Dividere il numero di cellule positive CFSE per il numero di nuclei per determinare l'assorbimento di detriti di mielina relativa.</li>
		<li>Prima di formazione immagine, è possibile mantenere piastre fino a 7 giorni a 4 ° C al riparo dalla luce.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. quantificazione dei lipidi intracellulari tramite olio rosso-O macchiatura
Nota: Di seguito è riportato il metodo di base per l'osservazione intracellulari lipidi della mielina-detriti-derivati.L'uso di CFSE etichettato residui del myelin non è raccomandato per quantificazione fluorescente di ORO macchiatura dovuto sovrapposizione spettrale. Aggiunta di altri trattamenti e condizioni sperimentali dovrà essere ottimizzata dallo sperimentatore.
<ol>
	<li>Preparazione di soluzioni di colorazione
	<ol>
		<li>Preparare soluzione colorante di 0,5% olio rosso-O (ORO).<ol>
			<li>Lentamente aggiungere 100 mL del 100% di glicole propilenico (1,2-propandiolo) a 0,5 g di ORO (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) continuando a mescolare.</li>
			<li>Riscaldare la soluzione a 95 ° C per 15 minuti o fino a quando tutte le particelle più grandi vengono sciolti. 
			Nota: non riscaldare oltre i 100 ° C.</li>
			<li>Filtrare la soluzione attraverso un pezzo di carta da filtro mentre ancora caldo in un nuovo contenitore.</li>
			<li>Consentire la soluzione di fresca durante la notte a RT. soluzione può essere conservata fino a 1 anno a TA.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Preparare la soluzione di glicole propilenico 85%.<ol>
			<li>Aggiungere 85 mL di glicole propilenico 100% a 15 mL di ddiH2O. mescolare fino misto. Soluzione può essere conservata fino a 1 anno a TA.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparazione delle piastre di trattamento
	<ol>
		<li>Preparare una piastra a 24 pozzetti seguendo il metodo descritto nella sezione 3.</li>
		<li>Incubare a 37 ° C, 5% CO2 per 24 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trattamento di detriti di mielina
	<ol>
		<li>Aggiungere 10 µ l di residui del myelin 100mg/mL ad ogni pozzetto (concentrazione finale di 1 mg/mL).</li>
		<li>Incubare per 1-3 h a 37 ° C, 5% CO2.</li>
		<li>Lavare la piastra 3 volte con PBS sterile per rimuovere residui del myelin non digerito. Nota: A questo punto, piastre possono sottoporsi sia fissazione immediata o 59cm fresche possono essere aggiunti e celle restituite a incubazione per i punti di tempo aggiuntivo.</li>
		<li>Aggiungere 400 µ l di paraformaldeide al 4% ad ogni pozzetto. Incubare per 30 minuti a TA.</li>
		<li>Lavare la piastra 2 volte con PBS sterile poi dirette alla macchiatura.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ORO di colorazione e analisi
	<ol>
		<li>Lavare la piastra fissa 3 volte con ddiH2O.</li>
		<li>Aggiungere 400 µ l di 100% di glicole propilenico in ogni pozzetto e incubare per 5 minuti a TA. 
		Nota: questo ridurrà il riporto di ddiH2O.</li>
		<li>Aspirare il glicole propilenico e aggiungere 400 µ l di soluzione ORO in ciascun pozzetto.</li>
		<li>Incubare per 8 min a 60 ° C.</li>
		<li>Aspirare la soluzione ORO. Quindi, aggiungere 400 µ l di 85% di glicole propilenico in ogni pozzetto e incubare per 5 minumintes a TA.</li>
		<li>Lavare la piastra 3 volte con ddiH2O.</li>
		<li>Aggiungere 400 µ l di soluzione di Hoechst 33258 a ciascun pozzetto. Incubare per 5 min a RT, al riparo dalla luce.</li>
		<li>Lavare le piastre 2 volte con PBS sterile.</li>
		<li>Aggiungere 200 µ l di Fluoro-gel con tampone Tris in ciascun pozzetto.</li>
		<li>Celle di immagine utilizzando un microscopio in grado di epi-fluorescenza invertito. ORO possa essere imaged utilizzando un set di filtri standard Texas Red o DsRed.</li>
		<li>Quantificare ritenzione del lipido relativa determinazione della superficie ORO positiva in ogni campo di immagine e dividendolo per il numero dei nuclei.</li>
		<li>Mantenere piastre per 7 giorni a 4 ° C al riparo dalla luce.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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Gli autori non hanno alcuna informazioni integrative.

Le procedure descritte qui utilizzano entrambi appena isolato residui del myelin CNS grezza e macrofagi primari derivanti dal midollo osseo. Per ridurre le spese di animale, che si consiglia di entrambi i cervelli e le cellule del midollo osseo raccolte da ogni mouse al momento del sacrificio. Due ricercatori lavorano insieme possono preparare contemporaneamente entrambi i materiali. In alternativa, cervelli possono essere conservati a-80 ° C in PBS completati con antibiotici prima dell'isolamento di detriti di mielina. ...

Derivate da midollo osseo macrofagi (BMDMs) sono un importante collegamento tra il sistema immunitario innato e adattivo. Come antigene che presenta le cellule (APC), possono comunicare con i linfociti tramite entrambi presentazione dell'antigene e rilascio di citochine1,2,3. Tuttavia, come fagociti professionali, la loro funzione primaria è di eliminare gli agenti patogeni, le cellule invecchiate e detriti cellulari1,4. A seguito di una ferita del midollo spinale (SCI), notevoli quantità di residui del myelin viene generato dai oligodendrocytes morente, il tipo di cellula responsabile della CNS assone mielinizzazione5. Noi ed altri abbiamo indicato che la liquidazione dei residui del myelin è principalmente la responsabilità di infiltrazione del BMDMs5,6,7. Tuttavia, all'interno di ferita del midollo spinale engulfment siti di residui del myelin è stato suggerito di spostare queste cellule antinfiammatorie normalmente verso un stato pro-infiammatorio5,8,9. Come mediatori chiave della neuro-infiammazione nel midollo spinale danneggiato, BMDMs sono obiettivi clinici importanti.
Al fine di studiare l'influenza della BMDMs nel midollo spinale danneggiato, abbiamo sviluppato un modello in vitro per studiare direttamente come BMDMs rispondere a residui del myelin. Per migliorare la rilevanza biologica, sia primario BMDMs murino e residui del myelin appena isolate sono utilizzati in queste indagini. Come tale, i metodi presentati qui dettaglio anche l'isolamento e coltura di BMDMs murino primario e derivato una tecnica gradiente di saccarosio modificate usata per isolare murino CNS mielina detriti10,11,12. Residui del myelin possono essere prontamente etichettato con un colorante fluorescente, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), per rilevare che l'internalizzazione di BMDMs. CFSE è adatto per questa applicazione perché è non citotossica e suoi permessi stretto spettro fluorescente Multiplexing con altri fluorescente sonde13,14. A seguito di fagocitosi, mielina detriti i lipidi sono trasportati attraverso i lisosomi e confezionati come lipidi neutri in goccioline di lipidi intracellulari5. Per quantificare questo accumulo di lipidi intracellulari, presentiamo un olio rosso O (ORO) che macchia il metodo ottimizzato per l'analisi quantitativa delle immagini. Questo semplice metodo di macchiatura produce robusti risultati riproducibili e quantificazione15. Questi metodi facilitano lo studio di ritenzione di fagocitosi e del lipido di detriti della mielina con limitate attrezzature specializzate.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30243.01</td><td>Alto glucosio con L-glutammina, piruvato di sodio</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina Soluzione</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>100X Siero</td></tr> di <tr><td>vitello appena nato (NCS)</td><td>Rocky Mountain Biologics</td><td>NBS-BBT-5XM</td><td>Stati Uniti Origine</td></tr><tr><td>NCTC clone 929 [L cellula, L-929, derivato del ceppo L]&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td>L929 Linea cellulare di preparazione di terreni condizionati Piastre per</td></tr><tr><td>colture cellulari a 24 pozzetti</td><td>VWR</td><td>10062-896&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari</td><td>Greiner Bio-One</td><td>639960</td><td>Polistirina, 145/20mm</td></tr><tr><td>Kit di proliferazione cellulare CFSE</td><td>Thermo Fisher</td><td>C34570</td><td>DMSO per la ricostituzione</td></tr><tr><td>Fornito Fluoro-gel con Tris Buffer&nbsp;</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>17985-11</td><td></td></tr><tr><td>Olio rosso O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiali</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td>Thinwall, Polipropilene, 38,5 mL, 25 x 89 mm</td></tr><tr><td>Rotore per ultracentrifuga SW 32 Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td>SW 32 Ti, Secchio oscillante,</td></tr><tr><td>Omogeneizzatore rotativo portatile</td> in titanio <td>Fisher Science</td><td>08-451-71</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro fagocitosi di residui del myelin dai macrofagi derivate da midollo osseo

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

Derivate da midollo osseo macrofagi (BMDMs) sono leucociti maturi che servono un ruolo fisiologico critico come fagociti professionali in grado di cancellare una varietà di particelle. Normalmente, BMDMs sono limitati dal sistema nervoso centrale (SNC), ma a seguito di un infortunio, essi possono facilmente infiltrarsi. Una volta all'interno il tessuto danneggiato del CNS, BMDMs sono il tipo di cellula primaria responsabile per la liquidazione del pregiudizio-derivato di detriti cellulari, tra cui grandi quantità di residui del myelin ricca di lipidi. Le ramificazioni neuropathological della fagocitosi BMDM infiltrazione e mielina detriti all'interno del SNC sono complesse e non ben compreso. I protocolli descritti qui, consentono lo studio diretto in vitro di BMDMs nel contesto della lesione dello SNC. Copriamo murino BMDM isolamento e cultura, preparazione di detriti di mielina e saggi per valutare la fagocitosi di detriti BMDM della mielina. Queste tecniche producono risultati quantificabili robusti senza bisogno di attrezzature specializzate significativa o materiali, eppure possono essere facilmente personalizzate per soddisfare le esigenze dei ricercatori.

Trattamento di BMDMs con CFSE etichettato residui del myelin dovrebbe produrre chiaro internalizzazione (Figura 2). Mentre un tempo di 3 ore di interazione è sufficiente per BMDMs a fagocitare abbastanza residui del myelin aggiunto per rilevamento affidabile a valle, accumulo intracellulare può essere osservata con un minimo di 1 ora di interazione. Tuttavia, alcuni residui del myelin possono ancora essere presenti sulla superficie delle cellule dopo il lavaggio. Questo potrebbe essere a cau...

Vi presentiamo metodi per valutare la capacità fagocitica di primari macrofagi murini derivate da midollo osseo, utilizzando residui del myelin fluorescente contrassegnati e lipido intracellulare gocciolina macchiatura.

In Vitro Fagocitosi di residui del Myelin dai macrofagi derivate da midollo osseo

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è valutare la fagocitosi macrofagica derivata dal midollo osseo dei detriti mielinici derivati dal cervello. Questo protocollo è progettato per rispondere a domande chiave nel campo del neurotrauma. Il vantaggio di questo metodo è che consente un'analisi efficiente e relativamente economica delle risposte dei macrofagi in vitro, in particolare la capacità fagocitaria dei macrofagi derivati dal midollo osseo per i detriti mielinali.Questo metodo può essere facilmente adattato per studiare gli effetti dei modulatori esterni. Dopo aver saturato il topo con il 70% di etanolo, praticare un'apertura nella pelle addominale. Tirare indietro la pelle per rivelare le zampe per la dissezione.Fare attenzione a non perforare la cavità peritoneale durante questo processo. Una volta esposti, rimuovere le gambe tagliando la caviglia e l'anca. Metti le gambe in PBS ghiacciato integrato con antibiotici.Ripetere l'operazione per l'altra gamba. Lavare il fazzoletto in PBS fresco e ghiacciato integrato con antibiotici per rimuovere eventuali particelle che potrebbero aver aderito al tessuto durante la dissezione. Un leggero movimento raschiante applicato lungo il muscolo rimuoverà la maggior parte del tessuto indesiderato.Con bisturi e pinzette, libera la tibia dal muscolo e dal tessuto connettivo. Una volta liberato, rimuovere entrambe le estremità per esporre la cavità del midollo. Ripeti questo processo per il femore.Applicare un ago calibro 25 a una siringa da 20 millimetri riempita con mezzi macrofagici completi derivati dal midollo osseo. Quindi sciacquare la cavità del midollo osseo. L'osso apparirà bianco quando è sufficientemente arrossato.Agitare gli aspirati midollari raccolti con un ago calibro 18 per 30-90 secondi in modo da ottenere una sospensione a cellula singola. Successivamente, passare la sospensione attraverso un colino cellulare sterile di dimensioni dei pori di 70 micrometri. Dividere uniformemente le sospensioni cellulari in piastre di coltura cellulare da 145 centimetri.Ogni topo fornirà abbastanza per un totale di tre piatti. Dopo sette giorni di coltura, questi piatti saranno in genere tra il 70 e l'80% confluenti con macrofagi maturi. Per isolare i detriti grezzi di mielina dal cervello, vengono eseguite una serie di fasi di ultracentrifugazione con gradiente di saccarosio.Per iniziare, vengono sezionati da 10 a 12 cervelli da topi di età compresa tra 8 e 10 settimane. I cervelli vengono quindi omogeneizzati in una soluzione di saccarosio molare 0,32 e quindi stratificati su un cuscino di soluzione di saccarosio molare 0,383 molari per creare un gradiente discontinuo. Dopo la centrifugazione, i detriti grezzi di mielina si trovano all'interfaccia tra gli strati.Questo viene raccolto e dispensato in una soluzione tampone Tris e centrifugato nuovamente per pellettare i detriti di mielina. Il pellet viene nuovamente sospeso in una soluzione tampone Tris e diviso tra due tubi per un'ulteriore cenetrifugazione. Per iniziare, rimuovi l'intero cervello e mettilo in un piatto con una soluzione di saccarosio molare 0,32 ghiacciata.Usando forbici chirurgiche sterili, tagliare i cervelli raccolti in pezzi di circa cinque millimetri di dimensione. Questa fase aiuta nel successivo processo di omogeneizzazione. Raccogli il fazzoletto in una provetta da 50 millilitri.Utilizzando un omogeneizzatore rotante, omogeneizzare il tessuto in un impasto liscio. Assicurarsi che tutti i grandi solidi cerebrali visibili siano stati accuratamente omogeneizzati. In una provetta da ultracentrifuga contenente 20 millilitri di soluzione di saccarosio molare 0,83, generare e omogeneizzare, avendo cura di mantenere la separazione.Bilanciare attentamente ogni provetta utilizzando la soluzione di saccarosio 0,32 molare. Una volta terminato, trasferire le provette in un rotore da centrifuga appropriato e centrifugare per 45 minuti a 100.000 volte la gravità, quattro gradi Celsius. Assicurarsi che l'accelerazione e la decelerazione siano impostate sui valori minimi.Una volta completata la centrifugazione, i detriti di mielina saranno visibili tra l'interfaccia di densità del saccarosio. Raccogli delicatamente i detriti di mielina. Una volta raccolto, aggiungere il tampone Tris ai detriti di mielina.Omogeneizzare nuovamente con un omogeneizzatore rotativo. Dividere l'omogeneizzato tra sei provette per ultracentrifuga pulite e bilanciare le provette secondo necessità con un tampone Tris aggiuntivo. Centrifugare nuovamente i detriti di mielina raccolti a 100.000 volte la gravità, quattro gradi Celsius per 45 minuti, con accelerazione e decelerazione impostate ai valori massimi.Dopo la centrifugazione, la mielina sarà stata pellettata. Utilizzando il tampone Tris, risospendere il pellet. Unire le risospensioni e ultracentrifugare nuovamente.Dopo la centrifugazione, si forma un pellet ben confezionato. Decantare il supernato. Risospendere il pellet in PBS sterile.Dividere equamente i detriti di mielina risospesi in provette da microcentrifuga prepesate. Dopo la centrifugazione per 10 minuti a 22.000 volte la gravità, rimuovere il PBS sopranato. Dopo aver pesato il pellet, risospendere a una concentrazione di 100 milligrammi per millilitro con PBS.I detriti grezzi di mielina risultanti sono ora adatti per lo studio della fagocitosi. I detriti di mielina marcati con CFSE possono essere utilizzati per monitorare l'internalizzazione precoce e il traffico intracellulare. I detriti di mielina non marcati sono compatibili con la colorazione lipidica Oil Red-O per valutare l'immagazzinamento e il metabolismo dei lipidi internalizzati.Se stai utilizzando detriti di mielina che sono stati conservati a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius, ti consigliamo prima di risospendere con un ago calibro 29. Risospendere 10 milligrammi di detriti di mielina pellettati in 200 microlitri di PBS. Quindi aggiungere due microlitri di soluzione CFSE da cinque millimolari.Pipetta per mescolare. Dopo un'incubazione di 30 minuti, al riparo dalla luce e successivi lavaggi, risospendere i detriti mielinici a 100 milligrammi per millilitro con PBS. Dopo la coltura e la fissazione con paraformaldeide al 4%, aggiungere glicole propilenico al 100% in ciascun pozzetto.Dopo l'incubazione per cinque minuti a temperatura ambiente, aggiungere la soluzione colorante Oil Red-O a ciascun pozzetto. Incubare per otto minuti a 60 gradi Celsius agitando delicatamente. Inclinare delicatamente la piastra per consentire l'aspirazione completa della macchia Oil Red-O.Ad ogni pozzetto aggiungere l'85% di glicole propilenico. Dopo cinque minuti di incubazione a temperatura ambiente, lavare i pozzetti con PBS e colorare le cellule con il colorante nucleare preferito. Immagini rappresentative al microscopio ottico di cellule del midollo osseo durante la coltura.24 ore dopo la semina iniziale, sono presenti poche cellule aderenti. Tuttavia, in presenza del fattore stimolante le colonie di macrofagi, l'M-CSF, le cellule precursori dei leucociti iniziano a subire la differenziazione. Dopo sette giorni di coltura in presenza di M-CSF, le cellule precursori sono completamente differenziate in macrofagi maturi derivati dal midollo osseo in grado di fagocitosi.Utilizzando questo metodo, un singolo topo C57 nero 6J di 8-10 settimane produrrà in genere da 18 a 24 milioni di macrofagi del midollo osseo. Per visualizzare l'internalizzazione, i detriti mielinici marcati con CFSE vengono aggiunti alle colture di macrofagi derivati dal midollo osseo. Le cellule sono state trattate con un milligrammo per millilitro di detriti di mielina marcati con CFSE per un'ora prima del lavaggio e della fissazione con paraformaldeide al 4%.I detriti di mielina internalizzati possono essere visualizzati utilizzando set di filtri GFP standard su un microscopio con capacità di epifluorescenza. Per dimostrare come l'accumulo di lipidi mielinici cambia nel tempo, i macrofagi sono stati trattati con detriti di mielina non marcati per 90 minuti, quindi lavati e fissati in vari punti temporali. Subito dopo il lavaggio, sono visibili poche goccioline lipidiche.Tuttavia, con il passare del tempo, diventano visibili più goccioline lipidiche, raggiungendo un massimo di circa 24 ore dopo il lavaggio. I macrofagi inizieranno a metabolizzare l'efflusso alle riserve lipidiche, riducendo il numero di goccioline colorabili. Per quantificare la colorazione Oil Red-O, sono state ottenute cinque immagini ottenute casualmente da ciascun campione di punto temporale utilizzando un microscopio con capacità di epifluorescenza.L'area colorata con Oil Red-O è stata determinata per ciascun pozzo utilizzando le immagini catturate nel canale DsRed. Il numero totale di cellule è determinato contando il numero di nuclei presenti in ciascun campo. Questo grafico mostra la quantificazione risultante.Un aumento costante del segnale Oil Red-O-positivo è tipico, poiché i macrofagi derivati dal midollo osseo convertono i lipidi mielinici internalizzati in lipidi neutri. Una diminuzione del segnale rosso-O-positivo dell'olio segue il picco a 24 ore, quando i macrofagi iniziano a metabolizzare o effluire i lipidi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come isolare e coltivare i macrofagi primari derivati dal midollo osseo, nonché di come studiare la loro interazione con i detriti di mielina derivati dal cervello appena isolati.La parte più importante di queste procedure è il corretto mantenimento della tecnica asettica in ogni momento. Poiché i macrofagi possono rispondere in modo robusto a piccole quantità di molecole associate ai patogeni, è fondamentale ridurre al minimo qualsiasi potenziale interazione che possa influenzare i risultati. Il vantaggio principale di queste tecniche è che ci fanno ottenere cellule primarie biologicamente rilevanti e detriti di mielina freschi, eliminando la quantità di attrezzature specializzate necessarie.Inoltre, con una certa ottimizzazione da parte dell'utente, questi metodi possono essere facilmente adattati per affrontare un'ampia varietà di domande riguardanti la risposta dei macrofagi derivati dal midollo osseo ai detriti di mielina. Facendo uso sia di detriti mielinici marcati in modo fluorescente che di colorazione Oil Red-O dei macrofagi mielinizzati, è possibile studiare potenziali interventi terapeutici per i pazienti affetti da una varietà di neurotraumi. L'obiettivo generale di tale lavoro è la rimozione remota dei detriti cellulari mediata dai macrofagi per promuovere la risoluzione dell'infiammazione.

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I macrofagi sono da tempo riconosciuti come una componente critica delle risposte immunitarie innate e adattative. La recente esplosione di conoscenze relative agli aspetti evolutivi, genetici e biochimici dell'interazione tra macrofagi e microbi ha rinnovato l'attenzione scientifica ai macrofagi. Questo articolo descrive un metodo per differenziare macrofagi da midollo osseo di topo.

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Descriviamo come visualizzare macrofagi C. neoformans (Cn) interazioni in tempo reale, con particolare enfasi sul processo di esocitosi non-litica mediante microscopia ottica digitale. Utilizzando questa tecnica individuale macrofagi infetti può essere studiato per accertare i vari aspetti di questo fenomeno.

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Qui, vi presentiamo un protocollo per isolare microglia da cuccioli di topo postnatale (giorno 1) per la sperimentazione in vitro. Questo metodo improvvisato di isolamento genera sia elevata resa e purezza, un vantaggio significativo rispetto ai metodi alternativi che consente un'ampia gamma sperimentazione ai fini di chiarire biologia microglia.

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Descriviamo qui un metodo semplice e rapido per l'isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi rivestendo i batteri con biotina e streptavidina.

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Qui descriviamo i metodi usando la microscopia di confocal di filatura disco ai singoli eventi fagocitica immagine di residenti macrofagi peritoneali del topo. I protocolli possono essere esteso ad altre cellule fagocitiche.

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Il presente protocollo descrive l'isolamento e la coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo dai topi.

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Questo protocollo descrive un metodo semplice e non enzimatico per isolare cellule di midollo osseo neonatale di topo di 7-9 giorni e generare macrofagi differenziati utilizzando un surnatante di cellule L929 come fonte di fattore stimolante le colonie di granulociti (M-CSF). I macrofagi derivati dal midollo osseo sono stati ulteriormente analizzati per gli antigeni di superficie F4/80, CD206, CD11b e la competenza funzionale.

Isolamento del midollo osseo di topo neonatale e preparazione di macrofagi derivati dal midollo osseo

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Scopri come valutare la fagocitosi dei residui di mielina da parte dei macrofagi derivati dal midollo osseo murino. Questo metodo efficiente e conveniente permette di studiare le risposte immunitarie nel campo del neurotrauma.

In Vitro Fagocitosi di residui del Myelin dai macrofagi derivate da midollo osseo

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