Iniezione idrodinamica pelvi renale per Non virali espressione delle proteine nel rene

L'obiettivo generale di questa procedura chirurgica è quello di produrre l'espressione proteica dal DNA plasmidico nel rene del topo adulto. Questo metodo è un nuovo strumento per affrontare questioni chiave in nefrologia, come ad esempio il modo in cui l'espressione di una proteina di interesse influisce sul rene adulto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che produce l'espressione proteica in modo riproducibile, in particolare nel rene, a differenza di altri metodi che possono produrre anche l'espressione genica in altri organi.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto l'iniezione della pelvi renale richiede un'attenta esposizione e deve essere eseguita rapidamente affinché il DNA plasmatico possa entrare nelle cellule. Inizia risospendendo il DNA plasmidico nel tampone di consegna idrodinamico. Su un termoforo a circolazione d'acqua coperto da un pad blu, posizionare il mouse.

Utilizzando un rasoio progettato per la toelettatura degli animali domestici, radere il lato sinistro della parte posteriore del mouse dalla spalla alla groppa e dal fianco alla colonna vertebrale. Pulisci i capelli sciolti e i detriti e applica un unguento veterinario in entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione corneale. Ora, prepara 100 microlitri contenenti da 10 a 50 microgrammi di DNA plasmidico diluito in una siringa separata per ogni topo anestetizzato, assicurandoti che non ci siano bolle d'aria.

L'ago deve essere fissato in modo permanente senza sicurezza. Prima di eseguire l'intervento chirurgico, svuotare gli strumenti chirurgici sterili senza toccare un vassoio sterile posizionato sul cuscinetto termico. Ora, prendi il mouse e allaccialo in un campo visivo illuminato.

Dalla confezione, rimuovere il 3,15% di clorexidina gluconato e il 70% di alcol isopropilico tamponi antisettici cutanei e posizionarli vicino all'animale. Indossare guanti chirurgici sterili e partendo dal sito di incisione, tamponare l'animale con un nuovo tampone alcolico di clorexidina, tre volte con movimenti circolari. Ora, individua il sito di incisione.

Pizzicare la pelle con una pinzetta e con le forbici tagliare lo strato di pelle a circa un centimetro dalla colonna vertebrale, sotto la gabbia toracica. Fai un altro taglio di un centimetro sotto nello strato muscolare. Localizzare il rene e, senza toccarlo, esporlo delicatamente dalla cavità addominale esercitando una leggera pressione costante sull'addome con le dita.

Esporre il rene a volte è difficile. Applicare una leggera pressione sull'addome e sulla colonna vertebrale per evitare di danneggiare la milza. Se escono organi diversi dal rene, rimetterli delicatamente nella cavità del corpo usando una pinza chiusa, se necessario.

Quindi, separa delicatamente il rene dal grasso circostante quel tanto che basta per visualizzare la pelvi renale, che può essere vista come un piccolo punto bianco. Dopo aver visualizzato la pelvi renale, utilizzare una pinza chiusa per spingere verso il basso il lato destro del rene in modo che la pelvi renale rimanga in vista. Quindi, afferrare la siringa da insulina carica con la mano destra tenendola parallela alla superficie di lavoro e inserire con cautela l'ago nella pelvi renale.

Una volta inserito l'ago, iniettare la soluzione rapidamente, entro tre secondi. Lasciare che l'ago rimanga in posizione per circa 10 secondi per evitare il riflusso della soluzione. Quindi, rimuovere l'ago lentamente e con attenzione e riportare l'organo nella cavità addominale allungando delicatamente il sito di incisione utilizzando una pinza chiusa.

Ora, sutura lo strato muscolare con suture riassorbibili a cinque e posiziona da due a quattro nodi indipendenti. Allo stesso modo, sutura lo strato cutaneo con suture di nylon non assorbibili a cinque o sei O e posiziona da due a quattro nodi indipendenti. Per valutare l'efficienza della trasfezione, introdurre 10 microgrammi di un plasmide che esprime luciferasi nel DNA diluito per l'iniezione per eseguire l'imaging di animali vivi, il giorno successivo.

Metti la prima gabbia di topi nella camera e sigillala. Una volta anestetizzato, iniettare ogni topo per via intraperitoneale con 100 microlitri di luciferina scongelata e registrare il tempo. Seleziona l'ID utente corretto e dalla barra dei menu in alto, fai clic su acquisizione e seleziona salva automaticamente due dal menu a discesa.

Inizializzare il sistema facendo clic su inizializza. Attendi il completamento dell'inizializzazione e modifica il campo visivo su D, per visualizzare cinque topi. Assicurati che gli animali siano posizionati nell'ordine desiderato e che le loro schiene siano rivolte verso la telecamera in modo da visualizzare il rene.

Quindi, premere acquisisci cinque minuti dopo l'iniezione per acquisire l'immagine. Dopo l'acquisizione, rimuovere i mouse dalla macchina di imaging. Spegni il gas.

Pulire la camera, i pettini nasali e il tavolino di imaging. Per analizzare i dati, dopo aver fatto clic sugli strumenti ROI, fare clic sull'icona del cerchio e selezionarne uno nel menu a discesa per posizionare il nuovo ROI nell'immagine come indicato da un ovale rosso con quattro quadrati intorno. Per regolare le dimensioni del ROI, posizionare il cursore su un quadrato rosso e trascinare per racchiudere l'area viola che si sovrappone al rene iniettato.

Ora, fai clic con il pulsante destro del mouse su questa ROI e seleziona duplica ROI per duplicare la ROI nella finestra corrente e spostarla sul mouse successivo. Dopo aver posizionato tutte le ROI dal menu direttamente sopra l'immagine, cambia le unità da conteggi a fotoni di radianza. Infine, crea un foglio di calcolo delle misurazioni esportando i dati ROI dal palato degli strumenti facendo clic su Strumenti ROI e quindi sull'icona del righello a matita.

Viene mostrata l'espressione genica specifica del rene dei plasmidi reporter. A tutti i topi è stato iniettato il plasmide pTet che esprime la luciferasi potenziata della lucciola, mentre ai topi due, tre e cinque è stato iniettato anche il plasmide pEF1-alfa-tdpomodoro, che esprime la proteina fluorescente rossa, tdtomato. Generalmente, la radianza nei topi giovani sarà entro un ordine di grandezza.

È possibile che alcuni topi non mostrino livelli apprezzabili di radianza, a causa della bassa efficienza di trasfezione o della mancanza del transgene stesso. L'iniezione di tampone idrodinamico funge da controllo. Non si osserva alcuna espressione plasmidica quando viene somministrato solo il tampone idrodinamico.

Nei primi giorni dopo la trasfezione, ci sarà probabilmente un basso numero di cellule che si colorano positivamente per il transgene. Queste cellule sono localizzate in chiazze nelle aree infiltrate dal fluido di iniezione. In questa immagine, i segnali verdi provengono dai tubuli prossimali, che sono colorati per l'agglutinina tetragonolobo del loto e i segnali rossi provengono dalle cellule trasfettate che esprimono il gene reporter tdtoato.

Una volta padroneggiato, l'intervento chirurgico può essere eseguito in meno di 10 minuti, tuttavia, l'anestesia richiede tempo per essere indotta e recuperata. Quindi, due membri del personale addestrato, lavorando a stretto contatto, sarebbero in grado di fare solo circa 10-15 topi al giorno. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare topi giovani.

La tecnica idrodinamica non funziona altrettanto bene negli organi fibrotici più vecchi. A seguito di questa procedura, possono essere eseguite altre metodiche, come l'analisi di campioni di sangue, urine e tessuto renale, al fine di valutare l'espressione del gene di interesse. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come iniettare la pelvi renale con DNA plasmidico per ottenere l'espressione proteica specifica del rene.