Name: Analisi enzimatica fluorometrica cell-free biochimico per la misura di High-throughput di perossidazione lipidica in lipoproteina ad alta densità (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Scopri un saggio fluorometrico cell-free per misurare la perossidazione lipidica nelle HDL. Questo metodo biochimico ad alto rendimento consente di valutare la funzione delle lipoproteine ad alta densità nelle malattie cardiovascolari.

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Gli autori riconoscono con gratitudine il lavoro del Dr Mohamad Navab, Alan Fogelman e Srinivasa Reddy per il loro ruolo chiave nello sviluppo di precedenti iterazioni di questo modello. T.A.A. è supportato da un RMIT University Vice-Cancelliere di Postdoctoral Fellowship. AJ e AH sono supportati da NHMRC progetto grant 1108792. TK è supportato da NIH concede NIH K08AI08272, Grant NIH/NCATS # µL1TR000124.

tutti gli esperimenti utilizzando campioni biologici umani sono stati eseguiti con l'approvazione di etica presso l'Università di California Los Angeles, Los Angeles e il Comitato di etica umana di Alfred Hospital, Melbourne.
 Nota: ci sono molte variazioni della funzione fluorocromo HDL Assay (Vedi la discussione) 32. Qui di seguito descriviamo il protocollo che dà i risultati più coerenti e riproducibili. Una panoramica del test è illustrata nella Figura 2.
 1. esemplare lavorazione <ol><li>uso fresco, non emolizzato (possono essere raccolti in provette separazione siero) del siero o plasma citrato ottenuto dopo 12-14 ore di digiuno. Se utilizza campioni crioconservati, includere il controllo appropriato come descritto in questo protocollo.</li>
</ol> 2. Giorno 0-preparazione per l'analisi <ol><li>preparare layout di lavoro di esperimento con gli opportuni controlli, campioni e replica. Eseguire almeno ogni esempio in triplici copie. Un rappresentante 96 ben layout è illustrato nella Figura 3.</li>
	<li>Calcolare tutti i volumi dei reagenti che verranno utilizzati per il dosaggio basato sul numero di campioni e replicati. 
	Nota: Includere un volume supplementare di 10% in ogni magazzino di lavoro per assicurarsi che ci sia abbastanza volume per ciascun reagente per l'esperimento specifico.</li>
	<li>Provette obbligatori per tutte le diverse fasi del dosaggio ad es. per la separazione di HDL, misura di HDL-C (opzionale) e il fluorochromeassay.</li>
</ol> 3. Giorno 1-la preparazione dei controlli <ol><li>preparazione del controllo pool specifici dello studio <ol><li>Crea un campione di controllo da pool di plasma o siero di studio tutti i campioni. Se in esecuzione 20 campioni in ogni piatto in triplice copia, è possibile combinare 10 µ l di ogni campione in un controllo di 200 µ l in pool. Dare un'aliquota separata di questo controllo in pool per il laboratorio clinico per determinare il valore di HDL-C di questo controllo. 
		Nota: Utilizzare questo controllo in pool per standardizzare il dosaggio e conto per tutti i possibili noto (ad esempio tipo di siero di matrice rispetto al plasma, cicli di gelo-disgelo, crioconservazione) e sconosciuti fattori di confondimento che possono influenzare la variabilità sperimentale 27 , 28.</li>
	</ol></li> <li>Preparazione di specifici del laboratorio controllo qualità (QCs) <ol><li>preparare un grande magazzino di HDL in ciascun laboratorio (ad esempio HDL isolato da 5 mL di plasma di donatori sani 10) e crioconservare diverse aliquote di questo magazzino per ridurre al minimo i cicli di gelo-disgelo.</li>
		<li>Uso almeno 10 diversi replica da questo stock per determinare il valore medio di HDLox. Una gamma accettabile di HDLox misurato valori per ciascun campione QC incluso in ogni dosaggio è all'interno di &lt; 15% del coefficiente di variazione di questo valore medio.</li>
		<li>Dare un'aliquota separata di questo controllo in pool per il laboratorio clinico per determinare il valore di HDL-C di questo controllo (es. 40 mg/dL). 
		Nota: Un approccio dettagliato come utilizzare sangue da banche del sangue per creare questi controlli è stato precedentemente descritto 27 , 28 , 32. Utilizzare ulteriori QCs come necessario (per esempio uno da un donatore sano, noto per avere la funzione di HDL normale e uno da un donatore conosciuto per avere la funzione di HDL in gran parte anormale.</li>
	</ol></li> <li>Ottimizzazione del segnale di fondo e valori vuoti (opzionali) <ol><li>per ridurre al minimo di sfondo, aggiungere la quantità appropriata di catalasi (1-4 U/mL) nel medium di incubazione per rimuovere rapidamente il formato di H 2 O 2 a causa di ossidazione spontanea aria dei buffer. 
		Nota: Poiché i valori dai pozzetti vuoti (nessun HDL) sono essere sottratti dai valori dei campioni HDL e i risultati sono stati segnalati rispetto a un controllo in pool (che è incluso nello stesso piatto ben 96), abbiamo trovato che questo passaggio non praticamente non applicar t i risultati. Così, ottimizzazione del segnale sfondo con catalasi può essere omesso, se necessario.</li>
	</ol></li></ol> 4. Giorno 1-separazione di HDL colesterolo usando la precipitazione di HDL Nota: utilizzare un reagente precipitante di HDL colesterolo standardizzato commercialmente disponibile per isolare apoB impoverito siero secondo il produttore ' s istruzioni. Questi reagenti sono ampiamente usati in saggi colorimetrici per determinare i livelli di colesterolo di HDL.
<ol><li>Fresca (o sbloccare) campione di plasma o siero.</li>
	<li>Mescolare volumi uguali (per esempio 80 µ l) di plasma e reagente precipitante colesterolo di HDL (20% w/v polietilene glicole in tampone di glicina a pH 10,0 (25 ° C)).</li>
	<li>Mix ben pipettando su e giù.</li>
	<li>Centrifugare a 1000-2000 x g per 10 min.</li>
	<li>Aspirare il supernatante (frazione di HDL).</li>
	<li>Idealmente utilizzare immediatamente l'HDL isolato per il fluorochromeassay di perossidazione lipidica di HDL. Tuttavia, se parecchi campioni vengono eseguiti nello stesso giorno e altri passi come misura della concentrazione di HDL-colesterolo sono anche fatto, quindi memorizzare l'HDL isolato a 4 ° C e utilizzarlo il giorno successivo per la funzione di fluorochromeHDL Assay.</li>
</ol> 5. Giorno 1-determinazione di HDL-C a HDL isolato Nota: questo è facoltativo se il valore di HDL-C da laboratorio clinico è utilizzato per normalizzare HDLox dalla quantità di HDL-C.
<ol><li>Quantificare il HDL-colesterolo da plasma, utilizzando standard colorimetrico dosaggi 27. Aggiungere 50 µ l di reagente di colesterolo in ciascun pozzetto e calcolare la concentrazione di colesterolo mediante un lettore colorimetrico e un colesterolo standard fornito in ogni kit.</li>
</ol> 6. Giorno 2-preparazione dei reagenti <ol><li>preparare HRP e colesterolo soluzioni HRP 5 U/mL di soluzione (gamma 1-10 U/mL).</li>
	<li>Preparare 20mm fluorocromo (ad es., Molceular rosso) soluzioni: scongelare un flacone di reagente fluorocromo e DMSO a temperatura ambiente. Prima dell'uso, sciogliere reagente fluorocromo (1 mg) in 200 µ l di DMSO. Conservare la soluzione stock congelati a ≤-20 ° C, al riparo dalla luce.</li>
	<li>Preparare i controlli positivi e negativi: uso 1 X ' tampone di reazione ' senza colesterolo e 20 mM H 2 O 2 soluzione di lavoro come controllo positivo e negativo, rispettivamente.</li>
</ol> 7. Giorno 2-fluorocromo Assay <ol><li>aggiungere 50 µ l di tampone di reazione come vuoto (controllo negativo) 1x.</li>
	<li>Facoltativo: aggiungere la soluzione di lavoro di 20 mM di H 2 O 2 come controllo positivo in ogni piastra.</li>
	<li>Per ridurre al minimo la variabilità sperimentale e garantire che l'aggiunta di reagenti e campioni sono fatto costantemente e in modo tempestivo, eseguire tutte le aggiunte di campioni in un separato piastra di ben rotondo-fondo, chiaro, polistirolo o polipropilene 96 (tavola 1). Quindi utilizzare una pipetta multicanale per trasferire volumi specifici in 3 piastre da 96 pozzetti (piastre 2-4: bot in polipropilene, casalinghiTom, nero) (che hanno layout identico) ( Figura 2, Figura 3).
	<ol><li>, Ad esempio, aggiungere innanzitutto 160 µ l di HDL isolato in ogni pozzo/campione della piastra 1 e poi con l'uso di pipette multicanale trasferire 50 µ l di HDL-colesterolo da ciascun pozzo/campione nelle piastre 96 pozzetti nere. Cambiare suggerimenti tra ogni riga/colonna e utilizzare suggerimenti non filtrata per tutti i trasferimenti.</li>
	</ol></li> <li>Lasciare campioni nei pozzetti. Non gettare via. Non ci sono gradini di lavaggio tra aggiunta di reagenti.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l di soluzione di HRP 5 U/mL (0,25 U) in ciascun pozzetto. 
	Nota: Uso HRP prima dell'aggiunta del reagente fluorocromo.</li>
	<li>Incubare 30 min a 37 ° C. Non gettare via i campioni dopo incubazione (senza fasi di lavaggio tra aggiunte dei reagenti).</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l di fluorochromereagent per una concentrazione finale di 300 µM. A questo punto, volume di reazione totale è di 150 µ l. mescolare bene e proteggere dalla luce.</li>
	<li>Valutare la lettura fluorescente (nel buio) ogni minuto oltre 120 min a 37 ° C con un lettore di piastra fluorescente (filtri di 530/590 nm). 
	Nota: Utilizzare un intervallo di 60 minuti più breve con campioni freschi. Abbiamo trovato quel dosaggio di 120 minuti dà più dati riproducibili con l'uso di campioni crioconservati.</li>
	<li>Registrare i dati utilizzando il software appropriato.</li>
</ol> 8. Giorno 3-analisi dei dati <ol><li>registrare unità di fluorescenza (unità arbitrarie) a 120 minuti dopo l'aggiunta del fluorocromo reagente per tutti i campioni compresi pozzetti del bianco e tutti i controlli.</li>
	<li>Calcolare il valore medio delle unità di fluorescenza (basato su almeno triplicates) (HDL ox_sample). Non assumere valori erratici (&gt; 2 SDs dal valore medio) in considerazione.</li>
	<li>Sottrarre alla fluorescenza di fondo utilizzando la seguente equazione: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq1.jpg"></li> <li>normalizzazione per la quantità di colesterolo HDL (HDL-C): normalizzare il valore di perossidazione lipidica di HDLox per ogni campione (incluso il controllo pool) di HDL-C) (mg/dl). In tutta la sezione risultati, HDL bue è presentato come n (HDL-C) HDLox misura per riflettere la regolazione per HDL-C. Utilizzare la seguente equazione: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq2.jpg"></li> <li>standardizzare l'espressione del valore di perossidazione lipidica HDLox di ciascun campione contro il valore di un controllo in pool. Normalizzare la n (HDL-C) HDLox del lipido perossidazione valore per ogni campione (regolato per HDL-C) di n (HDL-C) HDLox valore di perossidazione lipidica del controllo in pool. In tutta la sezione risultati, HDL bue è presentato come misura di bue nHDL per riflettere la regolazione per la variabilità sperimentale e HDL-C. Utilizzare la seguente equazione: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq3.jpg"> Nota: questo approccio è simile ad altri approcci sperimentali stabiliti di ridurre la variabilità sperimentale delle misurazioni come International normalized ratio (INR) 44 , 45. Questo approccio è stato validato in studi clinici 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39.</li> <li>eseguire il controllo di qualità di risultati sperimentali utilizzando campioni di controllo di qualità standard. Ogni laboratorio dovrebbe stabilire i propri controlli di qualità (QCs). Idealmente, c'è un QC per nHDLox da un campione con noti HDL disfunzionali e un QC per nHDLox da un campione da donatori sani [ad es. uso campione da giovani adulti che sono stabiliti banca del sangue di donatori e non hanno conosciuto comorbidità e fattori di rischio per malattia cardiovascolare compreso il fumo]. Il controllo di quest'ultimo standardizza risultati tra i diversi laboratori. I valori medi di questi QCs sono stabiliti sulla base almeno 5 replicati (in genere si usa 10 replicati per questo importante passo).
	<ol><li>Check se misurato QCs in ogni dosaggio hanno valori entro l'intervallo di valori previsto. Supponendo che un'accettabile massima variabilità sperimentale del 15%, tutti i valori sperimentali misurati dovrebbero rientrare nel 15% dei valori medi noti di QC stabiliti. Utilizzare le seguenti equazioni: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq4.jpg"> <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq5.jpg"> Nota: se sia il controllo di qualità incluso campioni ( normali rispetto alle HDL disfunzionali) dà HDLox valori fuori intervallo previsto (stabilito in ciascun laboratorio) poi ripetere l'esperimento.</li>
	</ol></li> <li>Eseguire il controllo di qualità di risultati sperimentali utilizzando il coefficiente di variazione (CV) per quantificare la variabilità sperimentale: ripetere tutti i campioni con CV % &gt; 15%. Utilizzare la seguente equazione: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq6.jpg"> Nota: un tipico intra-dosaggio (all'interno della placca stessa) e la variabilità sperimentale Inter-saggio (tra piastre differenti) è &lt; 15%. 2) un tipico CV intra-assay è tra 1-7% e un tipico interassay CV è tra 3-10%.</li>
</ol>

Questo protocollo e il dosaggio sono rilevanti per il brevetto PCT/US2015/018147.

Il protocollo descritto qui offre un robusto strumento per rispondere alle domande di ricerca importante per quanto riguarda il ruolo della funzione di HDL nell'aterosclerosi e nella malattia umana. Il dosaggio quantifica il contenuto di perossido lipidico HDL per mg di HDL-C usando amplificazione enzimatica (HRP). Questo approccio evita limitazioni note di saggi per la funzione di HDL preventiva (ad es. il saggio di efflusso di colesterolo) tra cui eterogeneità significativa per quanto riguarda i tipi di celle utilizzat...

Malattia aterosclerotica cardiovascolare (CVD) è la principale causa di morte nel mondo1,2. Studi epidemiologici hanno dimostrato che bassi livelli di colesterolo della lipoproteina ad alta densità (HDL) sono generalmente associati inversamente con il rischio per lo sviluppo di aterosclerosi1,2. Anche se parecchi studi sostengono un ruolo atheroprotective per HDL1,2, il meccanismo con cui HDL attenua l'inizio e la progressione di aterosclerosi è complesso 3,4. Così, è stato suggerito che la complessa struttura e la funzione di assoluto livello di HDL piuttosto che può prevedere più accuratamente aterosclerosi 5,6,7,8. Si verificano diversi HDL del lipido e della proteina compositivo modifiche che alterano la funzione di HDL negli Stati infiammatori come l'aterosclerosi. Questi i) ridurre le potenziali efflusso di colesterolo 9, ii) diminuire anti-infiammatori e aumentare HDL-collegati di proteine pro-infiammatorie 6,7, iii) ridurre i livelli di fattore antiossidante e attività e HDL capacità di inibire l'ossidazione delle lipoproteine a bassa densità (LDLox)10 e iv) aumentare del lipido del perossido d'idrogeno contenuto e redox attività (HDLox)9,11. Saggi di robusti che valutano le funzioni di pleotropic di HDL (ad esempio di efflusso di colesterolo, funzione antiossidante) possono complementare determinazione del HDL-HDL-C nella clinica.
La funzione di HDL è solitamente valutata dai metodi basati su cellule quali il colesterolo efflusso dosaggio8,12,13,14. Questi metodi hanno limiti principali tra cui eterogeneità significativa per quanto riguarda i tipi di celle utilizzate, il tipo di lettura segnalata, mancanza di standardizzazione ed effetti confondenti di trigliceridi 7,15. Questi inconvenienti pongono difficoltà per grandi studi clinici16. Analisi senza cellula possono dare misure più robuste della funzione di HDL rispetto alle analisi cell-based. L'efflusso di colesterolo è una delle funzioni più importanti di HDL, ma può essere determinato solo da analisi cell-based. Altri approcci per determinare la funzione di HDL come proteomica17,18,19,20,21,22,23, 24 e chemiotassi del monocito basati su cellule di HDL funzione 17,22,25 non sono state standardizzate e non può essere utilizzati negli studi umani su larga scala.
HDL ha antiossidanti significative atheroprotective effetto5,6,7,8. La funzione antiossidante di HDL è stata determinata in presenza di LDL in precedente cella analisi fluorometriche gratis 26. Questi metodi fluorometrica biochimici della funzione antiossidante di HDL sono stati originariamente sviluppati da Mohamad Navab e Alan Fogelman e loro colleghi26. Anche se molti studi umani hanno utilizzato questi metodi per determinare HDL funzione 17,18,19,20,21,22,23 ,24, lipidi (HDL)-lipidica (LDL) e interazioni lipido-fluorocromo possono limitare la riproducibilità di questi saggi biochimici non enzimatico libero delle cellule del HDL funzione27,28.
L'interesse recente si è concentrata sulle conseguenze funzionali dell'ossidazione di HDL che è il risultato dell'ossidazione di lipidi e di proteine all'interno di HDL 27,29,30. Studi precedenti hanno dimostrato che l'ossidazione di HDL altera HDL funzione 27,29,30. HDL ha un ruolo importante nel trasporto perossido lipidico ed elevata quantità di perossidi del lipido è relativo a funzione anormale di HDL. Così il contenuto di perossido lipidico HDL può essere utilizzato per determinare HDL funzione 9,17,20,31 e dato le limitazioni note di analisi preventiva di HDL funzione7, 15,27,32, abbiamo sviluppato un metodo fluorimetrico alternativo che quantifica HDL lipidi perossido contenuto (HDLox) 32. Questo metodo si basa sulla perossidasi di rafano (HRP) e il fluorocromo rosso di Molceular che può quantificare (senza colesterolo ossidasi) il contenuto di perossido lipidico per mg di HDL-C 32. Il principio biochimico del dosaggio è mostrato nella Figura 1. Abbiamo dimostrato che questo approccio basato sulla fluorescenza non ha le limitazioni del precedente HDL funzione saggi27,28. Questo test è stato ulteriormente affinato e standardizzato nel nostro laboratorio in modo che può essere utilizzato in modo affidabile negli studi umani su larga scala anche con crioconservati plasma 32,33,34, 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. la lettura di questo test è associata con le letture di analisi cell-based convalidate, misure sostitutive della malattia cardiovascolare, l'infiammazione sistemica, disfunzione immune e fenotipi associati rischio cardiovascolare e metabolico 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. qui, Descriviamo questo metodo semplice, ma robusto per misurare il contenuto di perossido lipidico di HDL (HDLox). Questo test utilizzabile come strumento per rispondere alle domande di ricerca importante per quanto riguarda il ruolo della funzione di HDL nella malattia umana dove l'infiammazione sistemica, stress ossidativo e lipidi ossidati hanno un ruolo chiave (come l'aterosclerosi)32.

<table><tbody><tr><td>Reagenti sperimentali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDL PEG (Polyethylene Glycol) Reagente precipitante</td><td>Pointe Scientific</td><td>H7511</td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red.</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Kit per il dosaggio del colesterolo rosso Amplex. &bull; &le; &ndash; 20 gradi C & toro; Essiccato & toro; Proteggere dalla luce</td></tr><tr><td>DMSO.</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Kit per il dosaggio del colesterolo rosso Amplex. &bull; &le; &ndash; 20 gradi C & toro; Essiccato & toro; Proteggere dalla luce</td></tr><tr><td>Rafano perossidasi (HRP)</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Kit per il dosaggio del colesterolo rosso Amplex. &bull; &le; &ndash; 20 gradi C & toro; Essiccato & toro; Proteggere dalla leggera</td></tr><tr><td>esterasi del colesterolo.</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Kit per il dosaggio del colesterolo rosso Amplex. &bull; &le; &ndash; 20 gradi C & toro; Essiccato & toro; Proteggere dal</td></tr><tr><td>colesterolo leggero Standard di riferimento</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Kit di analisi del colesterolo rosso Amplex. &bull; &le; &ndash; 20 gradi C & toro; Essiccato & toro; Proteggere dalla luce</td></tr><tr><td>Resorufin fluorescense Standard di riferimento</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Kit di analisi del colesterolo rosso Amplex. &bull; &le; &ndash; 20 gradi C & toro; Essiccato & toro; Proteggere dalla luce</td></tr><tr><td>5x Buffer di reazione.</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Kit per il dosaggio del colesterolo rosso Amplex. &bull; &le; &ndash; 20 gradi C & toro; Essiccato & toro; Proteggere dalla luce</td></tr> il <tr><td>colesterolo HDL Reagente automatizzato</td><td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td><td>TR39601</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well plates (polipropilene, fondo piatto, trasparente).</td><td>Piastre Sigma Aldrich</td><td>M0687</td><td></td></tr><tr><td>a 96 pozzetti (polipropilene, fondo piatto, nero).</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9936</td><td></td></tr><tr><td>Provette Eppendorf da 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>ClipTip 200, sterile</td><td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td><td>14-488-058</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pipette multicanale, 8 canali, 125&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, Stati Uniti.</td><td>&nbsp; 14-387--955</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 2.01 software</td><td>Biotek, Vermont, USA</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td> Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 Lettore di piastre</td><td>Biotek, Vermont, USA</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi enzimatica fluorometrica cell-free biochimico per la misura di high-throughput di perossidazione lipidica in lipoproteina ad alta densità

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Lipoproteina ad alta densità bassa di livelli di colesterolo (HDL-C) sono uno dei più potenti predittori negativi indipendenti della malattia cardiovascolare aterosclerotica (CVD). La struttura e la funzione di HDL piuttosto che HDL-C può predire più accuratamente l'aterosclerosi. Si verificano diversi HDL del lipido e della proteina compositivo modifiche che alterano la funzione di HDL negli Stati infiammatori come l'aterosclerosi. Funzione di HDL è solitamente determinato dalla cella basata saggi come saggio di efflusso di colesterolo ma queste analisi hanno numerosi inconvenienti mancanza di standardizzazione. Analisi senza cellula possono dare misure più robuste della funzione di HDL rispetto alle analisi cell-based. Ossidazione di HDL altera la funzione di HDL. HDL ha un ruolo importante nel trasporto perossido lipidico ed elevata quantità di perossidi del lipido è relativo a funzione anormale di HDL. Interazioni lipido-sonda dovrebbero essere considerati quando l'interpretazione dei risultati di fluorescenza non enzimatici dosaggi per misurare lo stato ossidativo del lipido. Questo ci ha motivato a sviluppare un metodo enzimatico senza cellula biochimico per valutare HDL perossido contenuto lipidico (HDLox) che contribuisce a disfunzione di HDL. Questo metodo si basa sulla perossidasi di rafano (HRP) e il fluorocromo rosso di Molceular che può quantificare (senza colesterolo ossidasi) il contenuto di perossido lipidico per mg di HDL-C. Qui è un protocollo describedfor determinazione di HDL-perossidazione lipidica utilizzando il reagente fluorocromo. Variabilità di dosaggio può essere ridotto dalla rigorosa standardizzazione delle condizioni sperimentali. I valori più alti di HDLox sono associati con ridotta funzione antiossidante di HDL. La lettura di questo test è associata con le letture di analisi cell-based convalidate, misure sostitutive di malattia cardiovascolare, l'infiammazione sistemica, disfunzione immune e fenotipi associati rischio cardiovascolare e metabolico. Questo approccio tecnico è un metodo affidabile per valutare la funzione di HDL nella malattia umana dove l'infiammazione sistemica, stress ossidativo e lipidi ossidati hanno un ruolo chiave (come l'aterosclerosi).

In tutti i pozzetti come al punto 7.3 vengono aggiunti 50 µ l di ciascun campione di HDL. 50 µ l di soluzione di HRP 5 U/mL (0,25 U) vengono quindi aggiunti in tutti i pozzetti come al punto 7.5. I campioni sono incubati per 30 min a 37 ° C come descritto al punto 7.6. 50 µ l di reagente fluorocromo vengono quindi aggiunti in tutti i pozzetti come al punto 7.7 (concentrazione finale di 300 µM). La lettura fluorescente (nel buio) è quindi valutata ogni minuto oltre 120 minuti a 37 ° C con ...

Descriviamo qui un'analisi fluorometrica senza cellula biochimica per la determinazione di HDL-perossidazione lipidica. Questo test rapido e riproducibile può essere utilizzato per determinare la funzione di HDL in studi su larga scala e può contribuire alla nostra comprensione della funzione di HDL nella malattia umana.

Analisi enzimatica fluorometrica cell-free biochimico per la misura di High-throughput di perossidazione lipidica in lipoproteina ad alta densità

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

L'obiettivo generale di questo metodo sperimentale è determinare la funzione delle lipoproteine ad alta densità utilizzando un saggio biochimico privo di cellule che misura il contenuto di perossido lipidico di una specifica quantità di HDL. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in diversi campi della medicina, come il ruolo della funzione HDL nelle anomalie metaboliche delle malattie cardiovascolari. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un metodo biochimico privo di cellule che può essere utilizzato per determinare in modo affidabile la funzione delle HDL.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul ruolo della funzione HDL nelle malattie cardiovascolari e nelle anomalie metaboliche, può essere applicato anche ad altri studi sulle malattie, come le malattie infiammatorie. Per iniziare questa procedura, preparare il layout di lavoro per la piastra a 96 pozzetti, compresi i controlli, i campioni e le repliche appropriati, come indicato nel protocollo di testo. Calcola il volume di reagenti necessari in base al numero di campioni e repliche.Utilizzando un pennarello indelebile, etichettare le provette per ogni fase del saggio. Quindi, combina 10 microlitri da ciascun campione per creare un campione di controllo raggruppato. Creare un secondo campione di controllo aggregato per il laboratorio clinico, al fine di determinare il valore HDL-C.Dopo aver preparato una grande scorta di HDL, crioconservare diverse aliquote per ridurre al minimo i cicli di congelamento e disgelo. Raggruppare almeno 10 repliche diverse per creare un controllo di qualità in pool. Quindi, determinare il valore medio di HDLox come indicato nel protocollo di testo.Creare un secondo controllo di qualità aggregato per il laboratorio clinico, al fine di determinare il valore HDL-C. Per iniziare, scongelare un nuovo campione di plasma o di siero. Mescolare volumi uguali di plasma e reagente precipitante del colesterolo HDL.Pipettare su e giù più volte per mescolare bene. Centrifugare ad una velocità compresa tra 1000 e 2000 volte G per 10 minuti. Successivamente, aspirare il surnatante.Conservare l'HDL isolato a quattro gradi Celsius fino al momento di eseguire il test della funzione HDL al fluorocromo. Se il valore HDL-C del laboratorio clinico viene utilizzato per normalizzare l'HDLox, quantificare l'HDL-C dal plasma come indicato nel protocollo di testo. Per iniziare, mescola colesterolo e HRP, in modo tale che le soluzioni preparate contengano cinque unità per millilitro di HRP.Scongelare una fiala di reagente fluorocromo e una fiala di DMSO a temperatura ambiente. Dopo che sono stati scongelati, sciogliere un milligrammo di reagente fluorocromo in 200 microlitri di DMSO. Conservare questa soluzione a una temperatura inferiore a meno 20 gradi Celsius, al riparo dalla luce.Quindi, aggiungere 50 microlitri di tampone di reazione 1X alla piastra del campione come controllo negativo. Aggiungere 50 microlitri di soluzione di lavoro di perossido di idrogeno da 20 millimolari come controllo positivo. Successivamente, posizionare una nuova piastra a 96 pozzetti a fondo tondo da utilizzare come piastra di preparazione.Aggiungere 200 microlitri di HDL isolato a ciascun pozzetto di questa piastra di preparazione. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 50 microlitri di HDL dalla piastra di preparazione alle piastre sperimentali, come indicato nel protocollo di testo, con il numero di piastre sperimentali uguale al numero di repliche nel saggio. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di soluzione HRP preparata a ciascun pozzetto.Incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti, quindi aggiungere 50 microlitri di reagente fluorocromo a ciascun pozzetto, per un volume totale di 150 microlitri per pozzetto. Mescolare bene e proteggere dalla luce. Utilizzando un lettore di lastre fluorescenti, valutare la lettura fluorescente a 37 gradi Celsius, al buio, ogni minuto per 120 minuti.Registrare i dati utilizzando un software appropriato, quindi calcolare il valore medio delle unità di fluorescenza come indicato nel protocollo di testo. In questo studio, viene sviluppato un test fluorometrico biochimico privo di cellule per quantificare il contenuto di perossido lipidico HDL per milligrammo di HDL-C. Ciò si ottiene mediante amplificazione enzimatica utilizzando HRP.Un lettore di piastre fluorescenti viene quindi utilizzato per misurare la fluorescenza al buio, ogni minuto, per 120 minuti. Qui sono mostrati dati rappresentativi per un paziente noto per avere HDL disfunzionale, rispetto al controllo aggregato. Si è visto che l'HDL disfunzionale ha livelli di perossido lipidico due volte superiori a quelli osservati nell'HDL aggregato di partecipanti sani.Successivamente, l'HDL viene isolato e l'HDLox viene determinato in 50 soggetti sani e 100 pazienti con infezione da HIV. Si è visto che i pazienti con infezione da HIV hanno, in media, un contenuto di perossido HDL superiore del 60% per milligrammo di HDL-C rispetto ai soggetti sani. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di sei ore se eseguita correttamente.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di preparare tutti i reagenti e i controlli in anticipo, di essere coerenti, precisi e di includere sempre il controllo sperimentale appropriato in ogni piastra sperimentale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare l'HDL, determinare il contenuto di perossido lipidico di una quantità specifica di HDL e depredare la nostra funzione HDL. Non dimenticare che lavorare con campioni biologici può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come i guanti.

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Analisi enzimatica fluorometrica cell-free biochimico per la misura di High-throughput di perossidazione lipidica in lipoproteina ad alta densità (Video) | JoVE Journal

Analisi enzimatica fluorometrica cell-free biochimico per la misura di High-throughput di perossidazione lipidica in lipoproteina ad alta densità

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