Generazione di modelli cellulari del carcinoma della prostata di resistenza per il Docetaxel agente anti-mitotico

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare modelli sperimentali di cellule tumorali resistenti al docetaxel come piattaforma per studiare i meccanismi molecolari che guidano la resistenza alla terapia antimitotica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia delle cellule tumorali e della genomatica, come l'identificazione delle vie di segnalazione che contribuiscono alla progressione della malattia e la determinazione di potenziali strategie bersaglianti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un modo affidabile e semplice per generare modelli sperimentali per studiare le risposte ai farmaci antitumorali oltre a utilizzare campioni di tumore dei pazienti e modelli animali.

A dimostrare la procedura saranno Lisa Mohr, una postdoc del mio laboratorio, e Jungreem Woo, un'altra postdoc del nostro team. Per iniziare questa procedura, piastrate le cellule DU145 o 22Rv1 in palloni quadrati da 150 centimetri contenenti 20 millilitri di terreno. Dopo 24 ore, quando le cellule sono a circa il 70-80% di confluenza, aggiungere Docetaxel a cinque nanomolari.

Dopo 72 ore, aspirare il farmaco contenente terreno e aggiungere terreno fresco privo di Docetaxel. Cambia il supporto ogni tre o quattro giorni. Attendi una o due settimane fino a quando i cloni compaiono nel pallone.

Aspirare il terreno, lavare accuratamente le cellule con 15 millilitri di PBS e incubarle con quattro millilitri di tripsina-EDTA allo 0,05% per tre-cinque minuti a 37 gradi Celsius per staccare le cellule dalla superficie del pallone. Quindi, risospendere le cellule tripsinizzate dal pallone utilizzando otto millilitri di terreno fresco. Estrarre le celle da tutti i palloni trattati e pellettizzarle mediante centrifugazione.

Successivamente, rimuovere il superna-den, risospendere il pellet di cella in 20 millilitri di terreno fresco e placcare le celle in fiasche quadrate di 150 centimetri. Dopo 24 ore, quando le cellule sono a circa il 70-80% di confluenza, aggiungere nuovamente cinque nanomolari di Docetaxel. Ripetere le procedure come mostrato in precedenza fino a quando i cloni non compaiono nel pallone.

Quindi impiattare nuovamente le cellule in fiasche quadrate da 150 centimetri. Dopo 24 ore, quando le cellule sono a circa il 70-80% di confluenza, trattarle con 10 nanomolari di Docetaxel. Ripetere gli stessi passaggi nel modo di aumentare la dose di Docetaxel e continuare a raggruppare i cloni sopravvissuti dopo ogni trattamento di concentrazione.

Alla fine del processo, otterrai un pool di celle resistenti pronte per l'uso sperimentale. In questa procedura, piastra 2.000 cellule utilizzando 2 millilitri di terreno per pozzetto nelle piastre a sei pozzetti. Dopo 24 ore, aggiungere concentrazioni crescenti di Docetaxel per entrambe le linee cellulari DU145 e 22Rv1.

Aggiungere DMSO solo a un pozzetto come controllo allo stesso volume utilizzato per la dose più alta di Docetaxel. Dopo 72 ore, aspirare il farmaco contenente terreno e aggiungere terreno fresco privo di Docetaxel. Incubare le piastre per una o due settimane fino a quando le colonie sono visibili al microscopio.

Per macchiare le colonie, lavarle delicatamente con due o tre millilitri di PBS. Incubarli con due o tre millilitri di soluzione di cristallovioletto per 20 minuti all'interno della cappa di coltura tissutale o di una cappa aspirante. Successivamente, rimuovere la soluzione in piedi e lavare le piastre con due o tre millilitri di acqua.

Quindi rimuovere l'acqua e asciugare le piastre all'aria. Scatta immagini digitali delle lastre per la rappresentazione della figura. Analizza il risultato visualizzando i pozzetti e contando manualmente le colonie con l'aiuto di un pennarello.

E rappresentano la percentuale di vitalità cellulare in un grafico. Ecco un diagramma che illustra la determinazione del Docetaxel IC50 nelle linee cellulari parentali di cancro alla prostata DU145 e 22Rv1. Di seguito sono riportate le percentuali attese di vitalità cellulare nelle concentrazioni crescenti di dose di Docetaxel necessarie.

Ed ecco le immagini rappresentative della microscopia in campo chiaro delle cellule DU145 e 22Rv1 nei tempi indicati durante la generazione della resistenza al docetaxel. Le frecce rosse indicano un clone resistente al docetaxel dopo il completamento del protocollo. Qui sono mostrati i saggi rappresentativi di formazione di colonie corrispondenti alla validazione funzionale delle cellule resistenti a Docetaxel.

Le cellule sono state esposte a concentrazioni crescenti di Docetaxel e la sopravvivenza è stata valutata mediante colorazione con cristallovioletto. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare e convalidare linee cellulari resistenti ai farmaci, che possono quindi essere utilizzate per esami e procedure di tua scelta come l'analisi dell'espressione genica e le manipolazioni genetiche. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.