Il dosaggio di ricostituzione di Organoid (ORA) per l'analisi funzionale di nicchia cellule staminali intestinale e

L'obiettivo generale del saggio di ricostituzione degli organoidi è l'analisi funzionale dei due componenti principali della nicchia di cellule staminali intestinali Lgr5 positivi nelle cellule di Paneth attraverso la loro modificazione genetica o biochimica seguita dalla ricostituzione in organoidi auto-rinnovanti. Questo metodo consente di affrontare questioni chiave specifiche nel campo delle cellule staminali intestinali, come la modificazione genetica o biochimica nelle cellule staminali e di nicchia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che, a differenza di altri saggi che utilizzano intere cripte, impiega cellule staminali e di nicchia selezionate, consentendo così l'analisi specifica del tipo di cellula.

dimostrazione video di questo metodo è fondamentale, soprattutto quando si tratta delle fasi di dissociazione dei tessuti e di manipolazione delle cellule. Se non eseguiti correttamente, questi passaggi porteranno a una scarsa vitalità cellulare, soprattutto dopo lo smistamento dei fatti. Inizia questa procedura con la preparazione dei materiali e il sacrificio di un mouse Lgr5 su uno sfondo C57BL/6J come descritto nel protocollo di testo.

Sezionare longitudinalmente il peritoneo con un paio di forbici. Tenete lo stomaco con la pinza e tagliatelo trasversalmente a metà usando le forbici intestinali da questo punto in poi. Estrarre l'intestino e metterlo in una capsula di Petri contenente PBS.

Inizia posizionando la punta smussata nello stomaco e spingila delicatamente attraverso il piloro. Procedete tagliando con le forbici e tirando con le pinze. Una volta aperto longitudinalmente tutto l'intestino tenue, lavarlo in PBS freddo tenendolo con la pinza e sciacquandolo delicatamente nella soluzione di PBS con movimenti a forma di U.

Una volta eliminati tutti i resti di feci, procedi ad appiattire l'intestino su un tagliere, con il lato lumenale rivolto verso l'alto. Il lato lumenale è facilmente riconoscibile per l'assenza di vasi sanguigni e per il suo aspetto pallido rispetto alla parte esterna. Con un vetrino, rimuovere delicatamente i villi raschiando l'intestino appiattito.

Eseguire il passaggio due volte lungo l'intera lunghezza del tessuto. Quindi, tagliare l'intestino tenue con una lama chirurgica sterile in pezzi da due a cinque millimetri. Metti i frammenti dell'intestino tenue in una provetta da 50 millilitri contenente 10 millilitri di PBS ghiacciato.

Pulire i frammenti di tessuto rimuovendo eventuali impurità rimanenti pipettandoli su e giù nel PBS. Scartare il surnatante e ripetere il passaggio fino a quando il PBS non è completamente chiaro. Successivamente, aggiungere 15 millilitri di PBS freddo per portare il volume finale totale di PBS a 25 millilitri.

Aggiungere due millimolari di EDTA e incubare per 45 minuti su un rullo a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il PBS EDTA, aggiungere 10 millilitri di PBS e staccare le cripte pipettando con forza i frammenti di tessuto su e giù. Quindi, raccogli il surnatante.

Ripeti questo passaggio quattro volte. Aggiungere il terreno di coltura per raggiungere un volume finale di 50 millilitri. Pellettare le celle mediante centrifugazione.

Infine, risospendere il pellet in 10 millilitri di terreno di coltura prima di pellettare le cripte mediante centrifugazione. Per la preparazione di singole cellule, scartare prima il surnatante delle cripte pellettate e risospenderle in un millilitro di enzimi simili alla tripsina insieme a 50 microlitri di DNasi. Incubare le cellule in un bagno d'acqua a 32 gradi Celsius per due minuti.

Dopo aver aggiunto 10 millilitri di terreno di coltura, dissociare le cripte in singole cellule pipettando energicamente su e giù almeno cinque volte. Filtrare la soluzione attraverso un colino da 40 micron per eliminare grumi e altre impurità. Quindi, pellettare le singole celle a 300 volte la gravità per cinque minuti.

Per la citometria a flusso, risospendere il pellet in un millilitro di una soluzione salina tamponata di X Hank con il 2% di siero fetale di vacca per ogni milione di cellule. Alla sospensione cellulare, aggiungere gli anticorpi marcati con Brilliant Violet 421 per i marcatori di lignaggio CD31, CD45 e Ter119 a una concentrazione di uno a 100. Inoltre, aggiungere l'anti-CD24 APC e l'anti-CD117 PE a una concentrazione di uno a 250.

Dopo 30 minuti, selezionare le cellule staminali Lgr5 positive e le cellule Paneth in provette separate a basso legame. Centrifugare le celle selezionate a 300 volte la gravità per cinque minuti. Quindi, risospendere le cellule in 100 microlitri di terreno con i componenti descritti nel protocollo di testo.

Per trattare le cellule, utilizzare cinque microlitri di reagente di trasfezione mediata da liposomi in un volume totale di 100 microlitri di terreno di coltura e piccolo RNA interferente a una concentrazione di 100 nanomolari. Incubare le cellule per 30 minuti a 37 gradi Celsius per piccoli RNA interferenti, o per il tempo necessario alla modifica scelta. Lavare le cellule due volte in 500 microlitri di terreno di coltura.

Dopo aver centrifugato le cellule a 300 volte la gravità per cinque minuti, risospenderle in 10 microlitri di terreno di coltura. Successivamente, raggruppare i due componenti cellulari in un volume totale di 20 microlitri prima di centrifugare a 300 volte la gravità per cinque minuti a temperatura ambiente. Co-incubare le cellule positive di Paneth e Lgr5 per 10 minuti a temperatura ambiente.

Togliete 10 microlitri di surnatante e lasciateli in uno sci di liquido in modo da evitare di aspirare il pellet cellulare. Quindi, aggiungere 30 microlitri di membrana basale ricostituita alle cellule per un volume totale di 40 microlitri. Risospendere le cellule e piastarle in una piastra preriscaldata a 96 pozzetti.

Dopo 10 minuti, aggiungere 200 microlitri di terreno completo. Cambiare il supporto ogni 48 ore. Infine, conta la molteplicità degli organoidi al quinto giorno.

Il knockdown mediato da RNA interferente del gene APC murino nelle cellule staminali Lgr5 positive e la conseguente attivazione della via di segnalazione canonica Wnt/beta-catenina influenzano positivamente la molteplicità degli organoidi rispetto alle loro controparti non trattate o al controllo di sequenza criptato. La costituzione dell'attivazione di Wnt salva anche la necessità di cellule Paneth come precedentemente riportato. Inoltre, questi organoidi appaiono come sfere cave, un fenotipo ben descritto per gli organoidi mutanti APC o stimolati da Wnt se confrontati con la morfologia di quelli ottenuti dai doppietti cellulari Paneth-Lgr5.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa tecnica, è importante seguire tutti i passaggi e i tempi di incubazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre la cripta intestinale, preparare un digestato a singola cellula e ricostituire le cellule di nicchia e staminali per generare organoidi.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle cellule staminali intestinali per sezionare gli effetti specifici delle cellule staminali o di nicchia nell'intestino tenue o nell'intestino crasso del topo. Sebbene questo metodo sia stato stabilito per l'analisi funzionale della nicchia delle cellule staminali intestinali, può essere applicato anche ad altre nicchie di cellule staminali somatiche come la ghiandola mammaria o il follicolo pilifero. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire ulteriori esperimenti per analizzare l'espressione proteica del genoma negli organoidi, come la QPCR o il Western blotting.