Name: Grande Volume, illuminazione comportamentale pertinenti per optogenetica in primati Non umani (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Scopri come costruire un illuminatore di grandi volumi per manipolazioni optogenetiche in primati non umani. Questo metodo consente di illuminare estese regioni cerebrali con danno tissutale minimo, facilitando lo studio delle interazioni neuronali e dei comportamenti.

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LCA riconosce finanziamenti da una compagnia NDSEG, il GRFP NSF e gli amici dell'Istituto McGovern. EP riconosce finanziamenti l'Harry ed Eunice Nohara UROP Fund, la classe del MIT del 1995 UROP fondo e sul fondo di UROP MIT. ESB riconosce finanziamenti dal NIH 2R44NS070453-03A1, il premio di Harvey di IET e il Premio Fondazione-Robertson della cellula formativa di New York. RD riconosce finanziamenti dal NIH EY017292. Michael Williams ha aiutato il team a organizzare e raccogliere le forniture prima delle riprese.

Nota: tutte le procedure di animali erano in conformità con le linee guida NIH e sono state approvate dal Massachusetts Institute di tecnologia Comitato sulla cura degli animali.
 1. Illuminatore fabbricazione <ol><li>usare un paio di forbici taglienti per tagliare una sezione di 250 µm diametro fibra ottica di plastica che è superiore alla lunghezza desiderata illuminatore totale di almeno 10 cm.</li>
	<li>Rimuovere 15-20 cm di rivestimento in polietilene da un'estremità della fibra ottica plastica utilizzando una spogliarellista di filo di 22 calibro.</li>
	<li>Secure distale maggior parte 3-5 cm dell'estremità spogliato della fibra in un morsetto morsa da tavolo.</li>
	<li>Tenere l'estremità rivestita della fibra tesa in una mano con un tiro costante costante. La fibra deve essere parallela al piano, perpendicolare al vice. Mantenere questa costante la tensione sulla fibra durante il riscaldamento e raffreddamento (punti 1.5 e 1.6 qui sotto) in modo che la fibra rimane dritto e teso come si assottiglia.</li>
	<li>Utilizzando l'impostazione più bassa di una pistola di calore doppia temperatura (570/1.000 ° F,), scaldare la sezione spogliata della fibra fino a quando si è assottigliata ad un diametro di 60-100 μm, o circa il diametro di un capello umano.</li>
	<li>Mantenere la tensione costante sulla fibra, consentendo la fibra raffreddare. L'incapacità di mantenere la tensione può causare la fibra ad arricciarsi.</li>
	<li>Confermare il diametro della punta assottigliata sotto un microscopio per dissezione. Alternativamente, uno può utilizzare pinze.
	<ol><li>Se la fibra non è abbastanza sottile, ripetere i passaggi da 1.4 attraverso 1.6 come necessario per ottenere il diametro desiderato punta.</li>
		<li>Opzionale se ri-tirando, mettere un piccolo segno alla parte più stretta della fibra se esso sarà riscaldata nuovamente affinché la parte più stretta della fibra si rivolge al centro della pistola di calore.</li>
		<li>Se la fibra è troppo sottile, ricominciare da capo.</li>
	</ol></li> <li>Una volta che la fibra piena è raffreddato e il diametro desiderato è stato raggiunto, pizzicare la fibra di 3 cm dal punto più stretto su entrambi i lati. Con un rapido, sharp pull lungo l'asse della fibra, separare i lati per creare una punta conica.</li>
	<li>Esaminare la punta conica sotto a bassa potenza (ad es., 4x) il microscopio di dissezione. Se la punta è biforcuta o arricciata ( Figura 1f), scartare la fibra.</li>
	<li>Preparazione per incidere la punta conica mettendo un pezzo di nastro di laboratorio vicino alla fine della punta, lasciando l'ultimo 5 mm esposti. Il nastro protegge la fibra dall'incisione sopra la lunghezza desiderata dell'emissione luminosa. La lunghezza della punta è stata selezionata basato sullo spessore della corteccia del primate della regione di destinazione. Una lunghezza più corta o poteva essere esposti a seconda la lunghezza desiderata di illuminazione. Se si desidera una lunghezza della punta etch differenti, il bordo del nastro lab può essere spostato più vicino a o più lontano la punta conica.</li>
	<li>Piegare un quadrato piccolo (~ 1 pollici x 2 pollici) di 5 μm in carburo di silicio lappatura foglio sopra tra il pollice e l'indice. Posizionare la punta della fibra tra i due lati del foglio lappatura ed etch delicatamente la fibra con piccoli movimenti circolari, come se un BB di rotolamento tra il pollice e l'indice. Consente di ruotare frequentemente la fibra in modo che tutti i lati sono incisi in modo uniforme. La punta della fibra apparirà &#8220; irruvidito &#8221; ad occhio nudo nelle aree che sono stati impressi, mentre ONU-acidati aree in genere appaiono uniformi.</li>
	<li>Ripetere il punto 1.11 con un ossido di alluminio di 3 μm lappatura foglio.</li>
	<li>Apporre un connettore all'estremità dell'illuminatore di fronte la punta acidata. Questo consente l'illuminatore per connettersi a un cavo ottico o laser. 
	Nota: Questo metodo differisce dal metodo preferito per fissaggio vetro / fibre ottiche silice in puntali. Perché il puntale del metallo è più difficile che la fibra ottica di plastica, lucidatura della fibra e puntale come unità dopo incollaggio può danneggiare la fibra ottica di plastica come minuscoli frammenti di metallo prodotto durante il processo di lucidatura si può incorporare nel piatto-spaccati della fibra.
	<ol><li>Rimuovere circa 5 mm della giacca in polietilene dalla parte opposta dell'illuminatore con una spogliarellista di filo di 22 calibro.</li>
		<li>Tagliare l'estremità opposta con un coltello caldo per lisciare la superficie.</li>
		<li>Polacco l'estremità opposta piatto con lappatura successivamente più sottili fogli: 5 µm, 3 μm, 1 μm e 0,3 µm.</li>
		<li>Inserire il piatto altra estremità in un puntale in acciaio inox di diametro interno di 260 µm fino a quando non è a filo con la fine della ferrula.</li>
		<li>Confermare visivamente che l'estremità opposta è lucidato uniformemente e perfino con un microscopio fibra.</li>
		<li>Rimuovere la fibra dal puntale e la ghiera in senso verticale sul bordo di una tabella con nastro adesivo con la fibra rivolta verso il basso.</li>
		<li>Riempire una siringa da 1 mL con plastica epossidica e inserire un ago 18 calibro smussato nella siringa.</li>
		<li>Utilizzare l'ago per applicare la resina epossidica giù nella ghiera. Riempire completamente la ghiera con resina epossidica.</li>
		<li>Inserire la fibra della ferrula.</li>
		<li>Pulire qualsiasi resina epossidica in eccesso dalla superficie lucidata della fibra con un panno privo di lanugine bagnato prima dell'essiccazione se necessario. In caso contrario, la resina epossidica in eccesso può essere rimosso dopo 12-24 h.</li>
		<li>Memorizzare delicatamente la fibra fino a taratura e mettere un tappo di polvere sopra il puntale.</li>
	</ol></li></ol> 2. Illuminatore di calibrazione e controllo di qualità Nota: questi metodi per la taratura valutare per emissione di luce non-linearità a distanze diverse dalla punta della fibra. Distribuzione irregolare della luce provoca tipicamente da un &#8220; accidentata &#8221; o &#8220; ondulato &#8221; cono.
<ol><li>Crea una schermatura luce a membrana per la parte superiore della sfera integratrice utilizzando luce assorbendo foil ( Figura 2). 
	Nota: Indossare guanti quando foglio per evitare la pelle che assorbe luce di trattamento oli dalla creazione di macchie di luce riflettente.
	<ol><li>Fold 2 &#8221; da 4 &#8221; pezzo di luce assorbendo stagnola sopra su se stessa per formare un 2 &#8221; x 2 &#8221; Piazza. un metodo alternativo è quello di tagliare un 2 &#8221; x 2 &#8221; quadrato con una luce assorbendo laterale e una luce che riflette sul lato (cioè un lato del foglio di alluminio standard); Tuttavia, il metodo di piega è più sicuro perché fornisce un bordo opaco per la gestione del diaframma nel prossimo passaggio.</li> <li>piegare laboratorio nastro o nastro isolante lungo i bordi della piazza per associare i bordi non piegato. Questo tiene insieme i lati e protegge contro i tagli da spigoli vivi.</li>
		<li>Perforare un foro al centro del quadrato utilizzando un ago di 26 calibro.</li>
		<li>Rimuovere la grande vite il tappo dalla sfera integrata e coprire l'apertura con il diaframma. Posizionare il foro sopra il centro. Se il diaframma è stato creato con una luce assorbente e una luce che riflette sul lato, posizionare la luce assorbendo lato a e la luce si riflette sul lato verso il basso, verso l'interno della sfera integrata. 
		Nota: Per evitare polvere e detriti di entrare la sfera di integrazione e di mantenere il foro centrato, garantire il diaframma verso l'esterno della sfera integrata con nastro adesivo lab.</li>
	</ol></li> <li>Misura luce uscita lungo la punta incrementi di 500 µm utilizzando un micromanipolatore o stereotassica braccio e una sfera integratrice. 
	Nota: Ogni volta che il laser è in si devono indossare occhiali di sicurezza della lunghezza d'onda appropriata.
	<ol><li>Collegare l'estremità opposta della fibra con un laser o la luce fonte, ma non attivano la luce uscita ancora.</li>
		<li>Secure l'illuminatore a un titolare stereotassica (Laddomeriscontro con nastro di laboratorio) con la punta 7-10 mm sotto il bordo inferiore del titolare.</li>
		<li>Vite il titolare stereotassica nell'ARM stereotassica.</li>
		<li>Allineare la punta dell'illuminatore con il foro al centro del diaframma. Zero il micromanipolatore quando la punta è sullo stesso livello esatto come il diaframma.</li>
		<li>Girare fuori le luci della camera e zero la sfera integratrice.</li>
		<li>Attivare il laser (o altra sorgente luminosa) e misurare la potenza di luce totale output utilizzando la sfera integratrice. 
		Nota: Utilizzare la potenza luminosa minima possibile per il test di calibrazione.</li>
		<li>Abbassare la fibra 500 µm nell'integrazione sfera e ripetete il punto 2.2.6.</li>
		<li>Continuare abbassando la fibra nella sfera integratrice e misurazione della luce totale emessa 500 µm con incrementi fino a quando il potere della luce totale livelli off. 
		Attenzione: Potenza di luce totale deve stabilizzarsi una volta che la punta intera è nella sfera. Non continuare ad abbassare la fibra più di 1-2 mm oltre l'acidato suggerimento lunghezza. Se la punta tocca il fondo della sfera integrata, esso può fondere e/o rovinare la sfera integratrice.</li>
	</ol></li> <li>Confermare una fibra uniformemente acidata tracciando potenza luce totale output come una funzione di quanto la fibra è stata abbassata nella sfera integrata per confermare linearità.</li></ol>
 3. illuminazione in Vivo
 Nota: qui, questi metodi vengono visualizzati utilizzando un modello di plastica piuttosto che un primate non umano.
<ol><li>Dell'impianto è stata impiantata una camera di registrazione di diametro 25 mm sopra l'area del cervello di interesse prima sperimentazione.</li>
	<li>Eseguire anatomico imaging a risonanza magnetica (MRI) prima della sperimentazione. Posizionare una griglia di registrazione personalizzata in aula e riempirlo con lubrificante chirurgico sterile per consentire visualizzazione griglia e determinazione del livello delle strutture cerebrali dura e target.</li>
	<li>Preparare una torre micro-unità prima di ogni sessione di test.
	<ol><li>Affisso un tubo di guida di 25 calibro con punta tagliata a metà e inferiore morsetti sull'unità. Due morsetti sono utilizzati per garantire che il tubo di guida rimane dritto. Entrambi questi morsetti possono essere spostati manualmente se lo si desidera. 
		Nota: Il tubo di guida può essere incollato con resina epossidica o saldato ai morsetti.</li>
		<li>Fissare l'illuminatore di grande volume nel morsetto superiore sulla stessa unità. Questo morsetto è attaccato il motore di azionamento.</li>
		<li>Infilare l'illuminatore di grande volume attraverso il tubo di guida completamente e confermare che la punta dell'illuminatore si estende oltre la punta del tubo guida. 
		Nota: La lunghezza dell'illuminatore che estende passato la punta del tubo guida è uguale la distanza dalla dura al margine inferiore della regione del cervello di destinazione, come determinato tramite MRI.</li>
		<li>Immergere il tubo di guida e illuminatore in soluzione antisettica (ad es., clorexedina) per sterilizzare.</li>
	</ol></li> <li>Posizionare una griglia personalizzata sterilizzata all'interno della camera pulita e fissarlo a un orientamento pre-specificato con una vite sul lato della camera. La griglia mostrata qui ha distanza di 1 mm; Tuttavia, la spaziatura può essere personalizzata secondo le necessità. 
	Nota: Questo dovrebbe essere identico alla griglia e orientamento utilizzato nel MRI anatomico.</li>
	<li>Fissare il supporto di micro-unità stereotassica sulla camera di registrazione in un orientamento predeterminato.</li>
	<li>Ritrarre l'illuminatore sterilizzato dal tubo guida tirando l'illuminatore utilizzando pinze sterili, smussate. La punta dell'illuminatore dovrebbe essere 5-10 mm sopra la punta del tubo guida. 
	Nota: L'illuminatore si piegherà verso l'esterno tra il tubo di guida e il morsetto. Questo non danneggerà l'illuminatore flessibile.</li>
	<li>Appone il micro-drive al titolare e posizionare il tubo di guida nel foro della griglia di destinazione.</li>
	<li>Abbassare la fase di micro-unità fino a quando il tubo di guida è solo attraverso il livello del dura. 
	Nota: Se lo si desidera, un secondo micro-drive con un elettrodo possa essere collocato sulla scena e abbassa in un buco di griglia differenti. Local field potential su questo elettrodo mostrerà un artefatto luce di distanza-dipendente, che può essere utilizzato per confermare il posizionamento di illuminatore.</li>
	<li>Tentativo minore l'illuminatore manualmente con pinze sterili.
	<ol><li>Se non c'è alcuna resistenza, ritirare l'illuminatore 5 - 10 mm, attendere 10 minuti per consentire al tessuto di stabilirsi e riprovare.</li>
		<li>Se c'è ancora resistenza al secondo tentativo, ritirare la punta di illuminatore nel tubo guida, più basso la guida tubo 0,25 mm e riprovare.</li>
		<li>Ripetere fino a quando le diapositive di illuminatore attraverso il tubo di guida senza alcuna resistenza.</li>
		<li>Abbassare l'illuminatore fino a quando è teso. 
		Attenzione: Non spingere l'Illuminatore con forza contro resistenza. In questi casi il tubo di guida in genere non l'ha penetrata dura completamente. Spingendo con forza la fibra farà sì che per piegare su se stesso, impedendo la fibra di entrare il cervello e possibilmente distruggendo la punta ( Figura 1 g).</li>
	</ol></li> <li>Collegare il puntale su altra estremità dell'illuminatore al più grande ottica impostare o laser.</li>
	<li>Assicurarsi che nessuna luce è visibile per il primate non umano.
	<ol><li>Utilizzare black out schermatura o luce assorbendo stagnola per comprendere pienamente le torri registrazione.</li>
		<li>Inserire tutti i collegamenti ottici in schermato buste fatte di stagnola che assorbe luce.</li>
		<li>Scudo tutti i cavi di patch con entrambi foglio o nastro isolante nero che assorbe luce.</li>
		<li>Come ulteriore precauzione, posizionare una banca del diodo luminoso (LED) di richiamo dello stesso colore luce utilizzato nell'esperimento dietro il primate non umano e lampeggiano i LED continuamente a 2,5 Hz. Ciò impedisce agli occhi di regolazione completamente al buio. Se c'erano perdite involontarie di luce, questa luce lampeggiante aiuterebbe a prevenire la perdita da servire come un trigger comportamentale.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+brain+in+numbers%3A+a+linearly+scaled-up+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Hum+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain.</a> Front Hum Neurosci. 3, 31(2009).</li>
<li>Tamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glass-coated+tungsten+microelectrode+enclosing+optical+fibers+for+optogenetic+exploration+in+primate+deep+brain+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">A glass-coated tungsten microelectrode enclosing optical fibers for optogenetic exploration in primate deep brain structures.</a> J Neurosci Meth. 211 (1), 49-57 (2012).</li>
<li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nat Neurosci. 14 (3), 387-397 (2011).</li>
<li>Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+and+Electrical+Microstimulation+Systematically+Bias+Visuospatial+Choice+in+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic and Electrical Microstimulation Systematically Bias Visuospatial Choice in Primates.</a> Curr biol. 24 (1), 63-69 (2014).</li>
<li>Ozden, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+coaxial+optrode+as+multifunction+write-read+probe+for+optogenetic+studies+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">A coaxial optrode as multifunction write-read probe for optogenetic studies in non-human primates.</a> J Neurosci Meth. 219 (1), 142-154 (2013).</li>
<li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> J Neurophysiol. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li>
<li>Chuong, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+optical+inhibition+with+a+red-shifted+microbial+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Noninvasive optical inhibition with a red-shifted microbial rhodopsin.</a> Nat Neurosci. 17 (8), 1123-1129 (2014).</li>
<li>Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FEF+inactivation+with+improved+optogenetic+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FEF inactivation with improved optogenetic methods.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 7297-7306 (2016).</li>
<li>Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccadic+eye+movements+evoked+by+optogenetic+activation+of+primate+V1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1.</a> Nat Neurosci. 15 (10), 1368-1370 (2012).</li>
<li>Gerits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetically+Induced+Behavioral+and+Functional+Network+Changes+in+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetically Induced Behavioral and Functional Network Changes in Primates.</a> Curr Biol. 22 (18), 1722-1726 (2012).</li>
<li>Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccade+modulation+by+optical+and+electrical+stimulation+in+the+macaque+frontal+eye+field%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field.</a> J Neurosci. 33 (42), 16684-16697 (2013).</li>
<li>Cavanaugh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+inactivation+modifies+monkey+visuomotor+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetic inactivation modifies monkey visuomotor behavior.</a> Neuron. 76 (5), 901-907 (2012).</li>
</ol>

Mentre optogenetica strumenti sono ampiamente utilizzati per studiare la malattia e della fisiologia nei roditori, la sfida tecnica di volumi di grandi dimensioni del cervello illuminante ha limitato l'uso di optogenetica in primati non umani. Studi nelle scimmie pionieristici utilizzato densità di grande potenza della luce (~ 100 mW/mm2 a 20 W/mm2) per illuminare piccoli volumi, forse &#60; 1 mm3e segnalati effetti comportamentali modesti con opsine eccitatorie in corteccia<sup class="xr...

Strumenti di optogenetica, che consentono un controllo preciso al millisecondo, luce-driven neuronale sono ampiamente utilizzati per lo studio funzionale fisiologia e comportamento nei roditori e invertebrati. Tuttavia, le sfide tecniche hanno limitato l'uso di optogenetica nel cervello primate non umano, che ha un volume ~ 100 volte più grandi del cervello del roditore 1.
Per facilitare gli studi optogenetica in primati non umani, un illuminatore è stato progettato per affrontare due obiettivi contrastanti: illuminazione di grande volume e penetrazione minima danni. Precedenti tentativi di affrontare uno di questi problemi sono venuti presso il costoso di altro. Fasci di fibre per illuminare grandi volumi, ma con diametro maggiorato e, quindi, danno2,3. Fibre di vetro conico riducono danni di penetrazione, ma stretto fuoco luce alla luce che emettono superfici &#60; 100 µm2 4,5. Illuminazione esterna del cervello attraverso una finestra nella dura elude la sfida di danni di penetrazione e può consentire per l'illuminazione di grande volume, ma può essere utilizzato solo per qualche superficiale cervello zone6.
Per creare un illuminatore di grandi volumi, di piccolo diametro (Figura 1a), la punta di plastica ottico della fibra è calore affusolato e il nucleo e il rivestimento sono incisi (Figura 1bc). A differenza di altre fibre conici che focalizzare la luce in un punto stretto, l'acquaforte permette alla luce di sfuggire uniformemente fuori i lati della punta, così, distribuendo in linea di massima luce su una vasta area (Figura 1 de). Perché danno di penetrazione è proporzionale al diametro di penetrazione, questo illuminatore non ha nessun più danni di penetrazione di una fibra convenzionale, eppure ha &#62; 100 x la luce che emettono luce superficie area e trasporta più largamente con 1/100th il potere della luce densità in un cervello fantasma (1,75% agarosio) (Figura 1e). Un modello Montecarlo (Figura 1f) viene illustrata la differenza nella diffusione della luce tra una fibra convenzionale e l'illuminatore di grande volume hanno densità uguale potenza luce come loro superfici di uscita della luce. Ogni illuminatore è calibrato individualmente utilizzando una sfera integratrice (Figura 2a, b) per garantire una distribuzione uniforme della luce lungo la punta (Figura 2C).
Questo illuminatore di grande volume è stato convalidato con optogenetica manipolazione di comportamento e di firing neuronale in primati non umani. Lunghezza della punta della fibra può essere personalizzata a qualsiasi area del cervello e alla mappa del campo recettivo individuali di ogni animale. L'illuminatore può essere accoppiato con un elettrodo penetrante per le registrazioni di un neurone che si estendono la durata di illuminazione. Inoltre, poiché la fibra può trasportare qualsiasi colore della luce visibile, può essere accoppiato con qualsiasi delle molecole optogenetica disponibile disponibile.

<table><tbody><tr><td>Fibra ottica in plastica</td><td>Fibra ottica industriale</td><td>SK-10</td><td>250 micron di diametro, linea Super Eska</td></tr><tr><td>Spelafili</td><td>Klein Tools</td><td>11047</td><td>22 calibro</td></tr><tr><td>Morsetto morsa</td><td>Wilton</td><td>11104</td><td>Morsetto per morsa generico per montaggio su tavolo</td></tr><tr><td>Pistola termica a doppia temperatura</td><td>Milwaukee</td><td>8975-6</td><td>570 / 1.000 &deg; F</td></tr><tr><td>Marcatore da laboratorio</td><td>VWR</td><td>52877</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>VistaVision</td><td>82027-156</td><td>Stereomicroscopio con doppia luce a incandescenza, ingrandimento 2X/4X, disponibile da VWR</td></tr><tr><td>Nastro da laboratorio</td><td>VWR</td><td>89097-972</td><td>Confezione da 4 di colore viola; tuttavia, il colore del nastro non ha importanza</td></tr><tr><td>Foglio di lappatura in carburo di silicio</td><td>ThorLabs</td><td>LF5P</td><td>grana 5 micron, confezione da 10</td></tr><tr><td>Foglio di lappatura in ossido di alluminio</td><td>ThorLabs</td><td>LF3P</td><td>grana 3 micron, confezione da 10</td></tr><tr><td>Foglio di lappatura in ossido di alluminio</td><td>ThorLabs</td><td>LF1P</td><td>grana 1 micron, confezione da 10</td></tr><tr><td>Foglio di lappatura in allumina calcinata</td><td>ThorLabs</td><td>LF03P</td><td>grana 0,3 micron, confezione da 10</td></tr><tr><td>Coltello a caldo</td><td>Fibra ottica industriale</td><td>IF370012</td><td>60 Watt, portata</td></tr><tr><td>di ispezione</td> <td>delle fibre per impieghi gravosiThorLabs</td><td>FS201</td><td></td></tr><tr><td>ghiera opzionale in acciaio inossidabile</td><td>Fibra ottica di precisione</td><td>MM-FER2003SS-265</td><td>265 micron</td></tr><tr><td>diametro interno 1 mL siringa</td><td>BD</td><td>14-823-30</td><td>La punta Luer-lok è preferibile per ridurre il rischio di perdite, ma non è strettamente necessaria</td></tr><tr><td>Fibra ottica industriale</td><td>epossidica</td> plastica <td>40 0005</td><td></td></tr><tr><td>ago smussato calibro 18 BD</td><td></td><td>305180</td><td>Salvietta senza lanugine da 1,5 pollici</td></tr><tr><td>di lunghezza (KimWipe)</td><td>ThorLabs</td><td>KW32</td><td>disponibile da molti fornitori</td></tr><tr><td>Foglio assorbente della luce</td><td>ThorLabs</td><td>BKF12</td><td></td></tr><tr><td>Nastro isolante</td><td>3M</td><td>Temflex 1700</td><td>Opzionale, può sostituire altre marche / modelli</td></tr><tr><td>Ago affilato calibro 26&nbsp;</td><td>BD</td><td>305111</td><td>0,5 pollici di lunghezza</td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Siskiyou</td><td>70750000E</td><td>può sostituire altre marche/modelli</td></tr><tr><td>Steretactic arm</td><td>Kopf</td><td>1460</td><td>può sostituire altre marche/modelli</td></tr><tr><td>Occhiali di sicurezza laser</td><td>KenTeK</td><td>KCM-6012</td><td>devono essere selezionati in base al colore del laser utilizzato, esempio fornito qui</td></tr><tr><td>Laser o altra sorgente luminosa</td><td>vortran</td><td>Stradus 473-50</td><td>esempio di laser blu</td></tr><tr><td>Sfera di integrazione</td><td>ThorLabs</td><td>S142C</td><td>Misuratore di potenza collegato, disponibile anche da ThorLabs, articolo #PM100D</td></tr><tr><td>camera di registrazione Ultem</td><td>Crist instrument company</td><td>6-ICO-J0</td><td>Personalizzato con tacca di allineamento</td></tr><tr><td>Microdrive a torre con morsetti</td><td>NAN</td><td>DRTBL-CMS</td><td></td></tr><tr><td>Tubo guida</td><td>personalizzato</td><td>N/A</td><td>Realizzato con ago spinale (BD) calibro 25 o tubo smussato</td></tr><tr><td>Sistema di driver NAN</td><td>NAN</td><td>NANDrive</td><td></td></tr><tr><td>Design della griglia personalizzato</td><td></td>, piani <td>personalizzati</td><td>personalizzati disponibili su richiesta</td></tr><tr><td>Pinze smussate</td><td>FischerScientific</td><td>08-875-8A</td><td>pinze smussate generiche in acciaio inossidabile</td></tr><tr><td>Calibri digitali</td><td>Neiko</td><td>01407A</td><td>Disponibile su amazon.com. È possibile selezionare un calibro a risoluzione più fine per misurazioni più precise.</td></tr><tr><td>Cavo patch</td><td>ThorLabs</td><td>FG200LCC-custom</td><td>Questo è un esempio dei tanti possibili cavi patch. Finché il diametro della fibra è inferiore o uguale al diametro della fibra dell'illuminatore di grande volume e finché i connettori si interfacciano, qualsiasi cavo patch (vetro o plastica, acquistato dal fornitore o prodotto in laboratorio) va bene per questa applicazione.</td></tr><tr><td>Cappucci antipolvere in plastica trasparente</td><td>ThorLabs</td><td>CAPF</td><td>Confezione da 25</td></tr><tr><td>manicotti di accoppiamento divisi in ceramica</td><td>Precision Fiber Products, Inc.</td><td>SM-CS1140S</td><td></td></tr></tbody></table>

grande volume, illuminazione comportamentale pertinenti per optogenetica in primati non umani

Large Volume, Behaviorally-relevant Illumination for Optogenetics in Non-human Primates

Questo protocollo descrive un illuminatore di grande volume, che è stato sviluppato per le manipolazioni di optogenetica nel cervello primate non umano. L'illuminatore è una fibra ottica di plastica modificata con punta acidato, tale che la superficie di uscita della luce è &#62; 100 volte quella di una fibra convenzionale. Oltre a descrivere la costruzione dell'illuminatore a grandi volumi, questo protocollo dettaglia la taratura del controllo di qualità utilizzata per garantire la distribuzione uniforme della luce. Inoltre, questo protocollo descrive le tecniche per inserimento e rimozione dell'illuminatore di grande volume. Strutture superficiali e profonde possono essere illuminate. Questo illuminatore di grande volume non ha bisogno di essere fisicamente accoppiato ad un elettrodo, e perché l'illuminatore è fatta di plastica, non di vetro, esso semplicemente si piegherà a circostanze quando fibre ottiche tradizionali avrebbe distrutto. Perché questo illuminatore trasporta la luce sopra volumi rilevanti relativamente al comportamento del tessuto (≈ 10 mm3) con nessun danno una maggiore penetrazione di una fibra ottica convenzionale, esso facilita studi comportamentali utilizzando optogenetica in primati non umani.

L'illuminazione di volumi di grandi dimensioni del cervello in primati non umani consente per la manipolazione di optogenetica comportamentale pertinenti. Acker et al. (2016) utilizzato questo illuminatore di grande volume con il Halorhodopsin rosso-spostato, Jaws 7 per studiare il contributo temporale del campo frontale dell'occhio (FEF) da saccadi memoria-Guida in due scimmie rhesus. In particolare, FEF neuroni sono stati iniettati con un vettore virale contenente Jaws e poi illuminati ...

Un protocollo per costruire un illuminatore penetrante di tessuto per fornire luce attraverso grandi volumi con diametro minimo è presentato.

Grande Volume, illuminazione comportamentale pertinenti per optogenetica in primati Non umani

This protocol describes a large-volume illuminator, which was developed for optogenetic manipulations in the non-human primate brain. The illuminator is a ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di creare un illuminatore tissutale di grande volume che sia adatto alle manipolazioni optogenetiche nei primati non umani. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come ad esempio in che modo le popolazioni di neuroni nelle diverse regioni del cervello contribuiscono al comportamento e in che modo i modelli di attivazione neuronale temporalmente specifici in una regione possono influire su un'altra regione? Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza la luce e quindi consente la manipolazione optogenetica di grandi volumi cerebrali rilevanti dal punto di vista comportamentale con un danno tissutale minimo.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla medicina traslazionale a causa delle somiglianze tra il cervello umano e quello non umano dei primati. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché ci vuole un po' di pratica per applicare la giusta quantità di pressione quando si tirano queste fibre. Per iniziare questa procedura, utilizzare un paio di cesoie affilate per tagliare una sezione di fibra ottica di plastica di 250 micrometri di diametro che sia almeno 10 centimetri più lunga della lunghezza totale dell'illuminatore desiderata.Quindi, rimuovere da 15 a 20 centimetri di rivestimento in polietilene da un'estremità della fibra ottica di plastica utilizzando uno spelafili calibro 22. Quindi, fissare i tre o cinque centimetri più distali dell'estremità spelata della fibra in un morsetto per morsa da tavolo. Tenere tesa l'estremità rivestita della fibra in una mano, con una trazione costante e costante.La fibra deve essere parallela al pavimento, tirata via dalla morsa. Mantenere questa tensione costante sulla fibra durante il riscaldamento e il raffreddamento, in modo che la fibra rimanga diritta e tesa mentre si assottiglia. Utilizzando l'impostazione più bassa di una pistola termica a doppia temperatura, riscaldare la sezione spogliata della fibra fino a quando non si assottiglia a un diametro compreso tra 60 e 100 micrometri, o circa il diametro di un capello umano.Mantenere la tensione costante sulla fibra lasciandola raffreddare. Il mancato mantenimento della tensione o il surriscaldamento della fibra possono causare l'arricciamento e/o la rottura della fibra. Per aiutare a mantenere una tensione costante sulla fibra mentre la riscaldi, usa la tua mano non dominante in modo da non dover lasciare andare quando usi la pistola termica.Inoltre, puoi avvolgere delicatamente la fibra attorno al palmo della mano per ottenere una presa ancora migliore. Una volta che la fibra si è completamente raffreddata e ha raggiunto il diametro desiderato, pizzicare la fibra a tre centimetri dal punto più stretto su entrambi i lati. Con una rapida trazione decisa lungo l'asse della fibra, separare i lati per creare una punta affusolata.Quindi, esaminare la punta affusolata a bassa potenza con un microscopio da dissezione. Se la punta è biforcuta o arricciata, scartare la fibra. Anche con molta pratica, circa un terzo delle fibre avrà le punte biforcute o arricciate.Scartiamo semplicemente quelle fibre piuttosto che cercare di ripararle, dal momento che è così veloce ed economico tirarne un'altra. Preparati a mordenzare la punta affusolata posizionando un pezzo di nastro adesivo da laboratorio vicino all'estremità della punta, lasciando esposta la lunghezza della punta desiderata. Qui sono esposti gli ultimi cinque millimetri.Il nastro protegge la fibra dall'incisione al di sopra della lunghezza di emissione luminosa desiderata. Dopodiché, piega un quadratino di cinque micrometri di foglio di lappatura in carburo di silicio tra il pollice e l'indice. Posizionare la punta della fibra tra i due lati del foglio di lappatura e incidere delicatamente la fibra con piccoli movimenti circolari.Ruotare frequentemente la fibra in modo che tutti i lati siano incisi in modo uniforme. Quindi, rimuovere circa cinque millimetri di rivestimento in polietilene dall'estremità opposta dell'illuminatore utilizzando uno spelafili calibro 22. Quindi, taglia l'estremità opposta con un coltello caldo per levigare la superficie.Fissare un connettore all'estremità dell'illuminatore opposta alla punta incisa. Ciò consente all'illuminatore di collegarsi a un cavo ottico o a un laser. Successivamente, lucidare l'estremità opposta in piano con fogli di lappatura successivamente più fini.Successivamente, inserire l'estremità opposta piatta in una ghiera in acciaio inossidabile con diametro interno di 260 micrometri fino a quando non è a filo con l'estremità della ghiera. Confermare visivamente che l'estremità opposta sia lucidata in modo uniforme e uniforme con un microscopio a fibra. Fissare la ghiera verticalmente sul bordo del tavolo con l'apertura più piccola della ghiera rivolta verso il basso.Quindi, riempi una siringa da un millilitro con resina epossidica di plastica e attacca un ago smussato calibro 18 alla siringa. Successivamente, utilizzare l'ago per applicare la resina epossidica nella ghiera. Riempire completamente la ghiera con resina epossidica.Inserire la fibra nella ghiera in modo che sia a filo con la parte inferiore della ghiera. Se necessario, rimuovere la resina epossidica in eccesso dalla superficie lucida della fibra con un panno umido e privo di lanugine prima dell'asciugatura. In questa fase, preparare un microdrive tower prima di ogni sessione di test.Quindi fissare un tubo guida calibro 25 con una punta smussata al morsetto inferiore sull'azionamento. Fissare l'illuminatore di grande volume nel morsetto superiore sulla stessa unità. Questo morsetto è fissato al motore di azionamento.Successivamente, infilare completamente l'illuminatore di grande volume attraverso il tubo guida e verificare che la punta dell'illuminatore si estenda oltre la punta del tubo guida. In alternativa, il nastro da laboratorio può essere applicato alla fibra in modo che il nastro, piuttosto che la fibra stessa, sia bloccato, per proteggere la fibra. Quindi, immergere il tubo guida e l'illuminatore in una soluzione antisettica per la sterilizzazione.Posizionare una griglia sterilizzata personalizzata con una distanza tra i fori di un millimetro all'interno della camera pulita e fissarla con un orientamento prespecificato con la vite sul lato della camera. Ritrarre l'illuminatore sterilizzato dal tubo guida tirandolo verso l'alto utilizzando una pinza smussata sterile. La punta dell'illuminatore deve trovarsi da cinque a 10 millimetri sopra la punta del tubo guida.Fissare il microdrive al supporto e posizionare il tubo guida nel foro della griglia di destinazione. Quindi, abbassare lo stadio del microdrive fino a quando il tubo guida non supera appena il livello della dura. Allo stesso tempo, abbassare manualmente l'illuminatore con una pinza sterile.In caso di resistenza, ritrarre l'illuminatore da cinque a 10 millimetri, attendere 10 minuti e riprovare. Se c'è ancora resistenza al secondo tentativo, ritrarre la punta dell'illuminatore nel tubo guida, abbassare il tubo guida di 0,25 millimetri e riprovare. Collegare la ghiera sull'altra estremità dell'illuminatore alla configurazione ottica più grande o al laser.Questa figura mostra che i tassi di errore sono aumentati in modo significativo con l'illuminazione. E i grafici raster qui mostrano l'inibizione dei neuroni che coprono lo spessore di 2,5 millimetri della corteccia. E il potenziale del campo locale che mostra l'artefatto luminoso che si estende per 4,5 millimetri.Una volta padroneggiato, un illuminatore di grande volume può essere costruito utilizzando questa tecnica in 10-15 minuti, più il tempo di asciugatura della resina epossidica. La calibrazione aggiunge un'altra mezz'ora circa, quindi per massimizzare l'efficienza, di solito realizziamo più illuminatori contemporaneamente. Durante questa procedura, è importante ricordare che molti degli illuminatori non soddisfano gli standard di controllo della qualità.Va bene. Se non superano l'ispezione della punta, li scartiamo. Ma se non superano la calibrazione, di solito li rilucidiamo e ripetiamo la calibrazione.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha contribuito a spianare la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per utilizzare l'optogenetica per sopprimere l'attivazione neuronale e modulare il comportamento nei primati non umani. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come costruire un illuminatore tissutale di grande volume.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

I neuroni adulti, nato del bulbo olfattivo può essere controllato tramite optogenetically Channelrhodopsin2 che esprimono iniezione lentivirali nel flusso migratorio rostrale e fotostimolazione cronica con una miniatura impiantato LED.

Selettiva trasduzione virale di neuroni olfattivi per adulti nati per cronica In vivo Optogenetic Stimolazione

Il recente sviluppo di strumenti neuroscienza che combinano genetica e ottica, definito "optogenetics", consente il controllo sulle attività del circuito neurale con un livello senza precedenti di risoluzione spaziale e temporale. Qui forniamo un protocollo per l'integrazione nella registrazione vivo con la manipolazione optogenetic di sottoinsiemi geneticamente definiti di neuroni piramidali corticali prefrontali e subicular.

Un metodo per High Fidelity optogenetic controllo dei singoli Piramidale neuroni<em&gt; In vivo</em

L'optogenetica è diventata un potente strumento da utilizzare negli esperimenti di neuroscienze comportamentali. Questo protocollo offre una guida passo passo alla progettazione e all'impostazione di sistemi laser e fornisce un protocollo completo per l'esecuzione di stimolazioni optogenetiche in vivo multiple e simultanee compatibili con la maggior parte dei paradigmi di test comportamentali dei roditori.

In vivo optogenetic stimolazione del sistema nervoso centrale Roditore

Qui descriviamo la nostra strategia per ottenere registrazioni stabili e ben isolate di singole unità da interneuroni inibitori identificati nella corteccia del topo anestetizzata. I neuroni che esprimono ChR2 sono identificati dalla loro risposta alla luce blu. Il metodo utilizza apparecchiature di registrazione extracellulare standard e rappresenta un'alternativa economica all'imaging del calcio o al patching guidato visivamente.

Una guida per In vivo Singola unità di registrazione da Optogenetically Identificato corticale inibitorio interneuroni

Questo protocollo descrive i passaggi e l'analisi dei dati necessari per eseguire con successo la risonanza magnetica funzionale optogenetica (ofMRI). ofMRI è una nuova tecnica che combina la lettura fMRI ad alto campo con la stimolazione optogenetica, consentendo la mappatura specifica del tipo di cellula dei circuiti neurali funzionali e delle loro dinamiche in tutto il cervello vivente.

Optogenetic risonanza magnetica funzionale

Qui, dimostriamo la risonanza magnetica (MR) guidata dalla convezione migliorata (CED) dei vettori virali nella corteccia come un approccio efficiente e semplificato per ottenere l'espressione optogenetica attraverso grandi aree corticali nel cervello macaco.

Convezione Consegna migliorata del vettore virale optogenetico adeno-associato alla Corteccia di Rhesus Macaque Sotto la guida di immagini MRI online

Con la manipolazione optogenetica di specifiche popolazioni neuronali o regioni cerebrali, il comportamento può essere modificato con alta risoluzione temporale e spaziale in animali in movimento libero. Utilizzando diversi strumenti optogenetici in combinazione con fibre ottiche cronicamente impiantate, è possibile eseguire una varietà di modulazioni neuronali e test comportamentali.

Manipolazione optogenetica dell'attività neuronale per modulare il comportamento nei topi in movimento libero

Il metodo descritto di seguito mira a fornire un protocollo completo per la preparazione della neurochirurgia dei primati non umani (NHP) utilizzando una nuova combinazione di metodi di stampa tridimensionali (3D) ed estrazione di dati MRI.

Una cassetta degli attrezzi basata sulla risonanza testurtica per la pianificazione neurochirurgica in primati non umani

Come attualmente implementato, l'optogenetica nei primati non umani richiede l'iniezione di vettori virali nel cervello. Un metodo di iniezione ottimale dovrebbe essere affidabile e, per molte applicazioni, in grado di colpire singoli siti di profondità arbitraria che sono prontamente e inequivocabilmente identificati nell'istologia postmortem. Viene presentato un metodo di iniezione con queste proprietà.

Iniezioni di vettori AAV per l'optogenetica in cervello di primati non umani anestetizzati e svegli

La bioluminescenza - la luce emessa da un enzima luciferasi che ossida un substrato di piccole molecole, una luciferina - può essere sfruttata per attivare le proteine fotosensoriali, aggiungendo così un'altra dimensione alla stimolazione della luce e consentendo la manipolazione di una moltitudine di funzioni mediate dalla luce nelle cellule attraverso scale temporali e spaziali.

Optogenetica bioluminescente 2.0: sfruttare la bioluminescenza per attivare proteine fotosensoriali in vitro e in vivo

Questo documento delinea i processi automatizzati per la pianificazione neurochirurgica dei primati non umani basata su scansioni di risonanza magnetica (MRI). Queste tecniche utilizzano passaggi procedurali nella programmazione e nelle piattaforme di progettazione per supportare la progettazione di impianti personalizzati per NHP. La validità di ogni componente può quindi essere confermata utilizzando modelli anatomici tridimensionali (3D) stampati a grandezza naturale.

Una cassetta degli attrezzi per la progettazione di impianti neurali per primati non umani

Scopri come costruire un illuminatore di grandi volumi per manipolazioni optogenetiche in primati non umani. Questo metodo consente di illuminare estese regioni cerebrali con danno tissutale minimo, facilitando lo studio delle interazioni neuronali e dei comportamenti.

Grande Volume, illuminazione comportamentale pertinenti per optogenetica in primati Non umani

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