Grande Volume, illuminazione comportamentale pertinenti per optogenetica in primati Non umani

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di creare un illuminatore tissutale di grande volume che sia adatto alle manipolazioni optogenetiche nei primati non umani. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come ad esempio in che modo le popolazioni di neuroni nelle diverse regioni del cervello contribuiscono al comportamento e in che modo i modelli di attivazione neuronale temporalmente specifici in una regione possono influire su un'altra regione? Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza la luce e quindi consente la manipolazione optogenetica di grandi volumi cerebrali rilevanti dal punto di vista comportamentale con un danno tissutale minimo.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla medicina traslazionale a causa delle somiglianze tra il cervello umano e quello non umano dei primati. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché ci vuole un po' di pratica per applicare la giusta quantità di pressione quando si tirano queste fibre. Per iniziare questa procedura, utilizzare un paio di cesoie affilate per tagliare una sezione di fibra ottica di plastica di 250 micrometri di diametro che sia almeno 10 centimetri più lunga della lunghezza totale dell'illuminatore desiderata.

Quindi, rimuovere da 15 a 20 centimetri di rivestimento in polietilene da un'estremità della fibra ottica di plastica utilizzando uno spelafili calibro 22. Quindi, fissare i tre o cinque centimetri più distali dell'estremità spelata della fibra in un morsetto per morsa da tavolo. Tenere tesa l'estremità rivestita della fibra in una mano, con una trazione costante e costante.

La fibra deve essere parallela al pavimento, tirata via dalla morsa. Mantenere questa tensione costante sulla fibra durante il riscaldamento e il raffreddamento, in modo che la fibra rimanga diritta e tesa mentre si assottiglia. Utilizzando l'impostazione più bassa di una pistola termica a doppia temperatura, riscaldare la sezione spogliata della fibra fino a quando non si assottiglia a un diametro compreso tra 60 e 100 micrometri, o circa il diametro di un capello umano.

Mantenere la tensione costante sulla fibra lasciandola raffreddare. Il mancato mantenimento della tensione o il surriscaldamento della fibra possono causare l'arricciamento e/o la rottura della fibra. Per aiutare a mantenere una tensione costante sulla fibra mentre la riscaldi, usa la tua mano non dominante in modo da non dover lasciare andare quando usi la pistola termica.

Inoltre, puoi avvolgere delicatamente la fibra attorno al palmo della mano per ottenere una presa ancora migliore. Una volta che la fibra si è completamente raffreddata e ha raggiunto il diametro desiderato, pizzicare la fibra a tre centimetri dal punto più stretto su entrambi i lati. Con una rapida trazione decisa lungo l'asse della fibra, separare i lati per creare una punta affusolata.

Quindi, esaminare la punta affusolata a bassa potenza con un microscopio da dissezione. Se la punta è biforcuta o arricciata, scartare la fibra. Anche con molta pratica, circa un terzo delle fibre avrà le punte biforcute o arricciate.

Scartiamo semplicemente quelle fibre piuttosto che cercare di ripararle, dal momento che è così veloce ed economico tirarne un'altra. Preparati a mordenzare la punta affusolata posizionando un pezzo di nastro adesivo da laboratorio vicino all'estremità della punta, lasciando esposta la lunghezza della punta desiderata. Qui sono esposti gli ultimi cinque millimetri.

Il nastro protegge la fibra dall'incisione al di sopra della lunghezza di emissione luminosa desiderata. Dopodiché, piega un quadratino di cinque micrometri di foglio di lappatura in carburo di silicio tra il pollice e l'indice. Posizionare la punta della fibra tra i due lati del foglio di lappatura e incidere delicatamente la fibra con piccoli movimenti circolari.

Ruotare frequentemente la fibra in modo che tutti i lati siano incisi in modo uniforme. Quindi, rimuovere circa cinque millimetri di rivestimento in polietilene dall'estremità opposta dell'illuminatore utilizzando uno spelafili calibro 22. Quindi, taglia l'estremità opposta con un coltello caldo per levigare la superficie.

Fissare un connettore all'estremità dell'illuminatore opposta alla punta incisa. Ciò consente all'illuminatore di collegarsi a un cavo ottico o a un laser. Successivamente, lucidare l'estremità opposta in piano con fogli di lappatura successivamente più fini.

Successivamente, inserire l'estremità opposta piatta in una ghiera in acciaio inossidabile con diametro interno di 260 micrometri fino a quando non è a filo con l'estremità della ghiera. Confermare visivamente che l'estremità opposta sia lucidata in modo uniforme e uniforme con un microscopio a fibra. Fissare la ghiera verticalmente sul bordo del tavolo con l'apertura più piccola della ghiera rivolta verso il basso.

Quindi, riempi una siringa da un millilitro con resina epossidica di plastica e attacca un ago smussato calibro 18 alla siringa. Successivamente, utilizzare l'ago per applicare la resina epossidica nella ghiera. Riempire completamente la ghiera con resina epossidica.

Inserire la fibra nella ghiera in modo che sia a filo con la parte inferiore della ghiera. Se necessario, rimuovere la resina epossidica in eccesso dalla superficie lucida della fibra con un panno umido e privo di lanugine prima dell'asciugatura. In questa fase, preparare un microdrive tower prima di ogni sessione di test.

Quindi fissare un tubo guida calibro 25 con una punta smussata al morsetto inferiore sull'azionamento. Fissare l'illuminatore di grande volume nel morsetto superiore sulla stessa unità. Questo morsetto è fissato al motore di azionamento.

Successivamente, infilare completamente l'illuminatore di grande volume attraverso il tubo guida e verificare che la punta dell'illuminatore si estenda oltre la punta del tubo guida. In alternativa, il nastro da laboratorio può essere applicato alla fibra in modo che il nastro, piuttosto che la fibra stessa, sia bloccato, per proteggere la fibra. Quindi, immergere il tubo guida e l'illuminatore in una soluzione antisettica per la sterilizzazione.

Posizionare una griglia sterilizzata personalizzata con una distanza tra i fori di un millimetro all'interno della camera pulita e fissarla con un orientamento prespecificato con la vite sul lato della camera. Ritrarre l'illuminatore sterilizzato dal tubo guida tirandolo verso l'alto utilizzando una pinza smussata sterile. La punta dell'illuminatore deve trovarsi da cinque a 10 millimetri sopra la punta del tubo guida.

Fissare il microdrive al supporto e posizionare il tubo guida nel foro della griglia di destinazione. Quindi, abbassare lo stadio del microdrive fino a quando il tubo guida non supera appena il livello della dura. Allo stesso tempo, abbassare manualmente l'illuminatore con una pinza sterile.

In caso di resistenza, ritrarre l'illuminatore da cinque a 10 millimetri, attendere 10 minuti e riprovare. Se c'è ancora resistenza al secondo tentativo, ritrarre la punta dell'illuminatore nel tubo guida, abbassare il tubo guida di 0,25 millimetri e riprovare. Collegare la ghiera sull'altra estremità dell'illuminatore alla configurazione ottica più grande o al laser.

Questa figura mostra che i tassi di errore sono aumentati in modo significativo con l'illuminazione. E i grafici raster qui mostrano l'inibizione dei neuroni che coprono lo spessore di 2,5 millimetri della corteccia. E il potenziale del campo locale che mostra l'artefatto luminoso che si estende per 4,5 millimetri.

Una volta padroneggiato, un illuminatore di grande volume può essere costruito utilizzando questa tecnica in 10-15 minuti, più il tempo di asciugatura della resina epossidica. La calibrazione aggiunge un'altra mezz'ora circa, quindi per massimizzare l'efficienza, di solito realizziamo più illuminatori contemporaneamente. Durante questa procedura, è importante ricordare che molti degli illuminatori non soddisfano gli standard di controllo della qualità.

Va bene. Se non superano l'ispezione della punta, li scartiamo. Ma se non superano la calibrazione, di solito li rilucidiamo e ripetiamo la calibrazione.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha contribuito a spianare la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per utilizzare l'optogenetica per sopprimere l'attivazione neuronale e modulare il comportamento nei primati non umani. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come costruire un illuminatore tissutale di grande volume.