Considerazioni pratiche nello studio di colonizzazione del polmone metastatico nell'Osteosarcoma usando l'analisi di metastasi polmonare

L'obiettivo generale di questo test per le metastasi polmonari è quello di visualizzare e studiare direttamente la crescita delle cellule di osteosarcoma metastatico nel tessuto polmonare vitale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande davvero chiave nel campo delle metastasi dell'osteosarcoma. Ad esempio, come le cellule metastatiche dell'osteosarcoma si adattano, sopravvivono e proliferano nel microambiente polmonare.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente una visualizzazione diretta della crescita delle cellule metastatiche dell'osteosarcoma in un microambiente tridimensionale rilevante. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà, a causa delle fasi tecnicamente impegnative dell'incannulamento della trachea e dell'insufflazione del polmone. L'iniezione della vena caudale delle cellule tumorali e l'eutanasia del topo vengono eseguite secondo le linee guida istituzionali standard.

Dopo cinque minuti, posizionare il topo soppresso in decubito dorsale su un tampone sterile in una cappa a flusso laminare e utilizzare piccole forbici sterili per sezionare con cura lo sterno, oltre l'ingresso toracico su entrambi i lati della trachea, senza perforare i polmoni. Sezionare tutto il muscolo e il tessuto connettivo che circonda la trachea è essenziale per una cannullazione di successo. Successivamente, utilizzare un catetere IV calibro 20 per incannulare accuratamente la trachea e utilizzare una sutura sterile di catgut per fissare liberamente il catetere e la trachea.

Collegare un set di prolunga IV dal catetere alla siringa da 10 millilitri di un apparecchio a profusione per gravità e versare nella siringa agarosio liquido a 37 gradi Celsius miscelato con una soluzione di mezzo A. Riempire i polmoni con la soluzione di agarosio fino a quando non sono completamente insufflati. Quindi rimuovere la cannula e legare saldamente la sutura per evitare la fuoriuscita della soluzione di agarosio.

È importante mantenere intatto il polmone durante l'insufflazione. Una corretta insufflazione con agarosio e il successivo raffreddamento del pizzico, manterrà il polmone in uno stato espanso. Raccogli il pizzico, la trachea, il cuore e il polmone, facendo attenzione a non perforare o danneggiare la superficie del polmone.

Mettere i fazzoletti in 30 millilitri di PBS pre-raffreddato integrato con antibiotici e lasciare solidificare l'agarosio. Mettere il pluck sul ghiaccio per 20 minuti. Dopo 20 minuti, usa forbici e pinzette sottili per tagliare il polmone in pezzi di 3 x 1,5 millimetri e posiziona le fette in pozzetti individuali di una piastra a 6 pozzetti contenente 2 spugne di gelatina da 2 x 2 centimetri pre-imbevute di B medium.

Il giorno dell'imaging, trasferire con cura le fette polmonari dalla piastra a 6 pozzetti in un piatto rotondo sterile con fondo di vetro da 35 millimetri in colonne secondo il loro gruppo sperimentale. Successivamente, su un microscopio a fluorescenza ad ampio campo, selezionare l'obiettivo 2,5x e impostare i parametri di imaging per fornire il miglior contrasto tra le cellule tumorali fluorescenti e il tessuto di fondo non fluorescente nel gruppo di campioni di tessuto di controllo. Visualizzare tutti i campioni utilizzando gli stessi parametri dei tessuti di controllo.

Se il software non è calibrato in scala, è possibile creare un'immagine di un micrometro utilizzando lo stesso obiettivo del tessuto polmonare per ottenere un riferimento alla scala e salvare tutte le immagini come file tif. Una volta ottenute tutte le immagini, per analizzare le immagini in ImageJ, aprire il primo file. Utilizzare lo strumento di selezione poligono per delineare l'intera fetta polmonare per determinare l'area della fetta polmonare totale.

Seleziona il processo e sottrai lo sfondo. Impostate il raggio della sfera rotante su un valore iniziale di 50 pixel. Questo valore dipenderà dal grado di fluorescenza di fondo e dovrebbe essere ottimizzato per ogni set di dati.

Assicurati di deselezionare lo sfondo chiaro. Seleziona l'immagine e il tipo, 8 bit, quindi l'immagine e le proprietà, inserisci i pixel. In unità di lunghezza, inserisci 1 per la larghezza in pixel, l'altezza in pixel e la profondità del voxel.

Quindi, selezionare globale per applicare questi parametri a tutte le immagini successive. Quindi, seleziona l'immagine, quindi regola, quindi la soglia. Evidenzia predefinito e bianco e nero e usa il cursore per limitare l'immagine in modo che la maggior parte delle cellule tumorali sia evidenziata accuratamente.

Fare clic su applica una volta per trasformare il polmone in nero e le lesioni fluorescenti in bianco. Quindi, fai clic su Applica una seconda volta per invertire l'immagine in modo che tutte le strutture fluorescenti diventino nere. Per quantificare il numero e la forma delle lesioni, selezionare Analizza e imposta misurazioni e controllare l'area.

Deseleziona tutte le altre caselle. Quindi, selezionare analizza particelle e nel campo delle dimensioni utilizzare l'area della lesione più piccola determinata come una singola cellula da ImageJ, per impostare l'intervallo di forme che il programma enumererà. Utilizzare un'immagine del gruppo di veicoli del giorno zero per scegliere l'area più piccola che si considera essere una singola cellula tumorale.

Una volta impostato il limite inferiore, fare clic su OK. Apparirà una finestra dei risultati contenente tutte le forme enumerate e le misure dell'area. Quindi, copia e incolla i dati dalla finestra dei risultati in un foglio di calcolo e utilizza la funzione matematica di somma per aggiungere tutte le aree delle lesioni metastatiche per quella particolare fetta polmonare.

Le propensioni metastatiche per le linee cellulari metastatiche alte e basse sono visivamente evidenti in punti temporali progressivi. Più specificamente, queste immagini al microscopio mostrano come le cellule altamente metastatiche siano in grado di colonizzare il polmone in modo più efficiente rispetto alle linee cellulari a bassa metastazione. L'analisi delle immagini, la quantificazione e l'analisi statistica dei dati delle immagini confermano che le cellule tumorali altamente metastatiche possono colonizzare in modo efficiente il tessuto polmonare.

Mentre le cellule a bassa metastasi non possono crescere affatto. La microscopia a fluorescenza confocale ad alto ingrandimento consente la visualizzazione delle cellule del parenchima polmonare con un grande dettaglio spaziale rispetto alle cellule tumorali che esprimono EGFP. Oltre a facilitare l'analisi delle strutture subcellulari, come questi mitocondri.

A seconda del numero di topi utilizzati, questa tecnica può essere completata in quattro ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di lavorare con attrezzature chirurgiche pulite e sterili. Dopo il suo sviluppo, la tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca sul cancro per esplorare la progressione delle metastasi nei polmoni dei topi.

Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come i saggi di coltura cellulare in vitro e il western blotting per rispondere a ulteriori domande sugli effetti del knockdown genico o del trattamento farmacologico sulle cellule tumorali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un test di metastasi polmonari. Non dimenticare che lavorare con le cellule tumorali umane può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero sempre essere prese precauzioni come lavorare in un laboratorio di sicurezza a livello biologico.