Considerazioni pratiche nello studio di colonizzazione del polmone metastatico nell'Osteosarcoma usando l'analisi di metastasi polmonare
March 12th, 2018
L'obiettivo di questo articolo è di fornire una descrizione dettagliata del protocollo per il dosaggio di metastasi polmonare (PuMA). Questo modello permette ai ricercatori di studiare la crescita delle cellule di osteosarcoma metastatico (OS) nel tessuto del polmone usando un widefield fluorescenza o il microscopio confocale a scansione laser.
L'obiettivo generale di questo test per le metastasi polmonari è quello di visualizzare e studiare direttamente la crescita delle cellule di osteosarcoma metastatico nel tessuto polmonare vitale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande davvero chiave nel campo delle metastasi dell'osteosarcoma. Ad esempio, come le cellule metastatiche dell'osteosarcoma si adattano, sopravvivono e proliferano nel microambiente polmonare.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente una visualizzazione diretta della crescita delle cellule metastatiche dell'osteosarcoma in un microambiente tridimensionale rilevante. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà, a causa delle fasi tecnicamente impegnative dell'incannulamento della trachea e dell'insufflazione del polmone. L'iniezione della vena caudale delle cellule tumorali e l'eutanasia del topo vengono eseguite secondo le linee guida istituzionali standard.
Dopo cinque minuti, posizionare il topo soppresso in decubito dorsale su un tampone sterile in una cappa a flusso laminare e utilizzare piccole forbici sterili per sezionare con cura lo sterno, oltre l'ingresso toracico su entrambi i lati della trachea, senza perforare i polmoni. Sezionare tutto il muscolo e il tessuto connettivo che circonda la trachea è essenziale per una cannullazione di successo. Successivamente, utilizzare un catetere IV calibro 20 per incannulare accuratamente la trachea e utilizzare una sutura sterile di catgut per fissare liberamente il catetere e la trachea.
Collegare un set di prolunga IV dal catetere alla siringa da 10 millilitri di un apparecchio a profusione per gravità e versare nella siringa agarosio liquido a 37 gradi Celsius miscelato con una soluzione di mezzo A. Riempire i polmoni con la soluzione di agarosio fino a quando non sono completamente insufflati. Quindi rimuovere la cannula e legare saldamente la sutura per evitare la fuoriuscita della soluzione di agarosio.
È importante mantenere intatto il polmone durante l'insufflazione. Una corretta insufflazione con agarosio e il successivo raffreddamento del pizzico, manterrà il polmone in uno stato espanso. Raccogli il pizzico, la trachea, il cuore e il polmone, facendo attenzione a non perforare o danneggiare la superficie del polmone.
Mettere i fazzoletti in 30 millilitri di PBS pre-raffreddato integrato con antibiotici e lasciare solidificare l'agarosio. Mettere il pluck sul ghiaccio per 20 minuti. Dopo 20 minuti, usa forbici e pinzette sottili per tagliare il polmone in pezzi di 3 x 1,5 millimetri e posiziona le fette in pozzetti individuali di una piastra a 6 pozzetti contenente 2 spugne di gelatina da 2 x 2 centimetri pre-imbevute di B medium.
Il giorno dell'imaging, trasferire con cura le fette polmonari dalla piastra a 6 pozzetti in un piatto rotondo sterile con fondo di vetro da 35 millimetri in colonne secondo il loro gruppo sperimentale. Successivamente, su un microscopio a fluorescenza ad ampio campo, selezionare l'obiettivo 2,5x e impostare i parametri di imaging per fornire il miglior contrasto tra le cellule tumorali fluorescenti e il tessuto di fondo non fluorescente nel gruppo di campioni di tessuto di controllo. Visualizzare tutti i campioni utilizzando gli stessi parametri dei tessuti di controllo.
Se il software non è calibrato in scala, è possibile creare un'immagine di un micrometro utilizzando lo stesso obiettivo del tessuto polmonare per ottenere un riferimento alla scala e salvare tutte le immagini come file tif. Una volta ottenute tutte le immagini, per analizzare le immagini in ImageJ, aprire il primo file. Utilizzare lo strumento di selezione poligono per delineare l'intera fetta polmonare per determinare l'area della fetta polmonare totale.
Seleziona il processo e sottrai lo sfondo. Impostate il raggio della sfera rotante su un valore iniziale di 50 pixel. Questo valore dipenderà dal grado di fluorescenza di fondo e dovrebbe essere ottimizzato per ogni set di dati.
Assicurati di deselezionare lo sfondo chiaro. Seleziona l'immagine e il tipo, 8 bit, quindi l'immagine e le proprietà, inserisci i pixel. In unità di lunghezza, inserisci 1 per la larghezza in pixel, l'altezza in pixel e la profondità del voxel.
Quindi, selezionare globale per applicare questi parametri a tutte le immagini successive. Quindi, seleziona l'immagine, quindi regola, quindi la soglia. Evidenzia predefinito e bianco e nero e usa il cursore per limitare l'immagine in modo che la maggior parte delle cellule tumorali sia evidenziata accuratamente.
Fare clic su applica una volta per trasformare il polmone in nero e le lesioni fluorescenti in bianco. Quindi, fai clic su Applica una seconda volta per invertire l'immagine in modo che tutte le strutture fluorescenti diventino nere. Per quantificare il numero e la forma delle lesioni, selezionare Analizza e imposta misurazioni e controllare l'area.
Deseleziona tutte le altre caselle. Quindi, selezionare analizza particelle e nel campo delle dimensioni utilizzare l'area della lesione più piccola determinata come una singola cellula da ImageJ, per impostare l'intervallo di forme che il programma enumererà. Utilizzare un'immagine del gruppo di veicoli del giorno zero per scegliere l'area più piccola che si considera essere una singola cellula tumorale.
Una volta impostato il limite inferiore, fare clic su OK. Apparirà una finestra dei risultati contenente tutte le forme enumerate e le misure dell'area. Quindi, copia e incolla i dati dalla finestra dei risultati in un foglio di calcolo e utilizza la funzione matematica di somma per aggiungere tutte le aree delle lesioni metastatiche per quella particolare fetta polmonare.
Le propensioni metastatiche per le linee cellulari metastatiche alte e basse sono visivamente evidenti in punti temporali progressivi. Più specificamente, queste immagini al microscopio mostrano come le cellule altamente metastatiche siano in grado di colonizzare il polmone in modo più efficiente rispetto alle linee cellulari a bassa metastazione. L'analisi delle immagini, la quantificazione e l'analisi statistica dei dati delle immagini confermano che le cellule tumorali altamente metastatiche possono colonizzare in modo efficiente il tessuto polmonare.
Mentre le cellule a bassa metastasi non possono crescere affatto. La microscopia a fluorescenza confocale ad alto ingrandimento consente la visualizzazione delle cellule del parenchima polmonare con un grande dettaglio spaziale rispetto alle cellule tumorali che esprimono EGFP. Oltre a facilitare l'analisi delle strutture subcellulari, come questi mitocondri.
A seconda del numero di topi utilizzati, questa tecnica può essere completata in quattro ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di lavorare con attrezzature chirurgiche pulite e sterili. Dopo il suo sviluppo, la tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca sul cancro per esplorare la progressione delle metastasi nei polmoni dei topi.
Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come i saggi di coltura cellulare in vitro e il western blotting per rispondere a ulteriori domande sugli effetti del knockdown genico o del trattamento farmacologico sulle cellule tumorali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un test di metastasi polmonari. Non dimenticare che lavorare con le cellule tumorali umane può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero sempre essere prese precauzioni come lavorare in un laboratorio di sicurezza a livello biologico.
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Panoramica
Questo articolo descrive il protocollo del saggio di metastasi polmonare (PuMA), che consente la visualizzazione e lo studio della crescita delle cellule di osteosarcoma metastatico nel tessuto polmonare. Il metodo fornisce informazioni su come queste cellule si adattano e proliferano in un microambiente tridimensionale.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Oncologia
- Ricerca sulle metastasi
Sfondo
- L'osteosarcoma metastatico è un cancro difficile da studiare.
- Comprendere il comportamento delle cellule nel microambiente polmonare è cruciale.
- Il modello PuMA offre una piattaforma rilevante per tali studi.
- Esistono sfide tecniche nell'esecuzione del saggio.
Obiettivo dello studio
- Visualizzare la crescita delle cellule di osteosarcoma metastatico.
- Investigare l'adattamento e la sopravvivenza cellulare nel tessuto polmonare.
- Migliorare la comprensione della metastasi dell'osteosarcoma.
Metodi utilizzati
- Cannulazione della trachea per insufflazione polmonare.
- Iniezione di cellule tumorali nella vena caudale.
- Utilizzo di microscopia confocale a scansione laser a campo ampio o di fluorescenza.
- Rispettare le linee guida istituzionali per l'eutanasia degli animali.
Risultati principali
- Viene raggiunta la visualizzazione diretta della crescita delle cellule metastatiche.
- Incontri sulla proliferazione cellulare in un ambiente tridimensionale.
- Identificazione dei meccanismi chiave di sopravvivenza nei polmoni.
- Sfide tecniche evidenziate per i nuovi ricercatori.
Conclusioni
- Il saggio PuMA è uno strumento prezioso per studiare la metastasi dell'osteosarcoma.
- Fornisce informazioni critiche sul comportamento metastatico.
- Studi futuri possono basarsi su questa metodologia per comprendere ulteriormente la metastasi del cancro.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
The pulmonary metastasis assay (PuMA) enables direct visualization of osteosarcoma cell colonization in lung tissue, providing a physiologically relevant model for evaluating metastatic potential and therapeutic intervention. This ex vivo system supports mechanistic de-risking by allowing real-time assessment of tumor cell adaptation, survival, and proliferation in a three-dimensional microenvironment. It enhances predictive confidence in target validation and lead identification by linking phenotypic outcomes to drug effects in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing how metastatic osteosarcoma cells adapt and survive in the lung microenvironment.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of tumor cell behavior in a relevant tissue context.
- Strategic Value: Facilitates target confidence by linking genetic or pharmacological perturbations to measurable changes in metastatic colonization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative image-based readouts of lesion area and number, enabling standardized assessment of metastatic growth across experimental conditions.
- Operational Value: Compatible with widefield and confocal fluorescence microscopy, allowing scalable imaging workflows for compound screening.
- Strategic Value: Supports assay readiness by generating reproducible, quantifiable outputs that can be used to evaluate anti-metastatic therapeutics over time.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by using murine lung tissue to model the osteosarcoma metastatic niche, enabling study of microenvironmental interactions.
- Operational Value: Permits longitudinal imaging to assess dynamic changes in tumor growth and response to intervention.
- Strategic Value: Connects discovery-phase findings to preclinical validation by providing a bridge between in vitro models and in vivo metastasis.
Pipeline & Workflow Integration
The PuMA model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment, offering a platform to prioritize candidates based on metastatic phenotype.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling visualization of how osteosarcoma cells colonize lung tissue and respond to microenvironmental cues.
- Screening: Delivers quantitative outputs such as metastatic lesion area, which can be measured and compared across treatment groups using image analysis tools like ImageJ.
- Analytics: Generates measurable data on tumor cell proliferation and spatial distribution, supporting statistical analysis to confirm differences between high and low metastatic lines.
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by using intact lung explants to study gene function, promoter activity, and subcellular structures in metastatic cells.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform for evaluating multiple therapeutic candidates or genetic modifiers in a consistent, standardized system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in metastatic potential through direct, visual confirmation of colonization.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized tissue preparation, imaging parameters, and quantification protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, mechanistic insight into anti-metastatic efficacy, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their ability to inhibit colonization in a disease-relevant lung microenvironment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine tissue dissection, tracheal cannulation, and agarose insufflation to maintain lung integrity.
- Depends on access to fluorescence microscopy systems (widefield or confocal) and image analysis software such as ImageJ for quantification.
- Necessitates standardization across teams in tissue slicing, plating, and imaging conditions to ensure comparability of results.
- Involves adaptation considerations when applying the model to different cell lines or genetic backgrounds, particularly in defining single-cell thresholds for particle analysis.
- Limited by the technical complexity of lung dissection and insufflation, which may affect throughput and require training for consistent execution.
