Name: Considerazioni pratiche nello studio di colonizzazione del polmone metastatico nellOsteosarcoma usando lanalisi di metastasi polmonare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Impara l'assay di metastasi polmonare per studiare la crescita delle cellule di osteosarcoma metastatico nel tessuto polmonare. Questo metodo consente la visualizzazione diretta in un microambiente tridimensionale.

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Vorremmo ringraziare il Dr. Arnulfo Mendoza che ha fornito addestramento sulla tecnica di PuMA. Inoltre, vorremmo riconoscere la d. ssa Chand Khanna, Susan Garfield (NCI/NIH) e Sam Aparicio (BC Cancer Agency) per permettere l'utilizzo del loro microscopi nel corso di questo studio. Questa ricerca è stata sostenuta (in parte) dal programma di ricerca intramurale del National Institutes of Health, centro per la ricerca sul cancro, ramo di oncologia pediatrica. M.M.L. è stato sostenuto dal programma nazionale di istituti di salute intramurale visitando Fellow (premio 15335) e attualmente è supportato da un Fellowship di Parker Joan nella ricerca di metastasi. P.H.S è supportato da British Columbia Cancer Foundation.

Tutti i protocolli degli animali da cui sono stati ottenuti dati di imaging sono stati eseguiti con approvazione della cura degli animali e Comitato di uso del National Cancer Institute, National Institutes of Health. Tutti i protocolli animali discusso e interpretato l'articolo dei video sono stati approvati dal comitato di cura degli animali di University of British Columbia.
1. preparazione delle cellule del tumore per iniezione e materiali per il modello di PuMA
Nota: La quantità di soluzioni e cellule sarà sufficiente per 1 mouse. La scalabilità necessarie se più topi vengono utilizzati nello studio. Per ricette di supporti, fare riferimento alla tabella 1 e tabella 2.
<ol><li>Pre-riscaldare 5 mL di A-Media in una provetta conica da 15 mL in bagnomaria a 37 oC.</li>
	<li>Sciogliere l'1,2% bassa fusione soluzione di agarosio (in acqua sterile) utilizzando il forno a microonde di laboratorio.</li>
	<li>Trasferire 5 mL dell'agarosio fuso in una provetta conica da 15 mL e tenere in caldo in un bagno di acqua di 37 oC. Garantire che l'agarosio fuso è al 37 oC e liquido di prova prima il passo di insufflazione del polmone.</li>
	<li>Pre-raffreddare 30 mL di grado di coltura cellulare PBS completati con 1 X penna/strep in un secchio di ghiaccio.</li>
	<li>In un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, pre-immergere una spugna di gelatina in 1,5 mL di B-media. La spugna sarà l'ancoraggio del supporto per le fette di polmone.</li>
	<li>Garantire le cellule OS sono circa 70-90% confluenti il giorno della procedura. Non utilizzare le celle confluenti eccessiva o se il media è arancione al giallo, dal momento che le cellule sono solitamente stressate e hanno diminuito la vitalità a questo punto. Per le linee di cellule di osteosarcoma, MNNG e HOS, 5x105 in un volume di 100 μL serviranno per iniettare nella vena caudale del 1 mouse. Upscale conseguenza se più topi sono utilizzati per lo studio.</li>
	<li>Raccogliere le cellule del tumore con 0,25% tripsina-EDTA (3 mL per un pallone da T75 o 2 mL in una piastra di coltura di 10 cm). Quando le cellule stanno cominciando a sollevare la piastra, neutralizzare la tripsina-EDTA con completa per i media. Rotazione verso il basso le cellule e sciacquare una volta con il grado di coltura cellulare PBS. Risospendere il pellet in 5 mL di PBS.</li>
	<li>Eseguire un conteggio delle cellule con i metodi standard. È meglio fare più sospensione cellulare rispetto a quello che è effettivamente necessario dato che la perdita della sospensione cellulare spesso si verifica durante la redazione dell'ago e tentativi falliti di iniezione.</li>
	<li>Eseguire un'analisi di esclusione del Trypan blu su un campione della sospensione delle cellule per valutare la vitalità delle cellule. Procedere solo se la cella Visualizza attuabilità 90% o superiore.</li>
	<li>Iniettare cellule5 5 x 10 in un volume di 100 μL. Per preparare un eccesso di 2 X di questo importo, 1 x 106 celle dovrebbero essere filate giù e risospesi in 0,2 mL di HBSS.</li>
	<li>Posto sospensione cellulare in un secchio di ghiaccio mentre si prepara i topi per iniezione.</li>
</ol>2. iniezione in vena e insufflazione del polmone di coda
Nota: La quantità di soluzioni e le cellule in questa sezione sarà sufficiente per 1 mouse. La scalabilità necessarie se più topi vengono utilizzati nello studio. Per un elenco delle attrezzature, materiali e strumenti chirurgici utilizzati in questa procedura, fare riferimento alla tabella 3 e tabella 4.
<ol><li>Scaldare un topo femmina (età 6-8 settimane) sotto una lampada di riscaldamento per 5 min al fine di rendere loro coda della vena più visibilmente evidente. Per cellule murine K7M2 o K12, utilizzare topi Balb/c; per MG63.3 umano, cellule MG63, MNNG e HOS, utilizzare topi di immunodeficienza combinata grave.</li>
	<li>Assicurarsi che la sospensione cellulare è uniforme agitando delicatamente il tubo. Redigere con cura la sospensione cellulare nella siringa 1 mL senza ago. Cappuccio della siringa con un 27 ago del manometro. Assicurarsi che la smussatura dell'ago è sullo stesso lato come le marcature di volume sull'ago.</li>
	<li>Posizionare il mouse nel dispositivo di ritenuta e tampone la coda con un batuffolo imbevuto di alcool.</li>
	<li>Procedere per eseguire un'iniezione della vena della coda e iniettare 100 μL della sospensione delle cellule. 5 min dopo l'iniezione, posizionare il mouse in una camera di CO2 e iniziare la procedura operativa standard di eutanasia (come contorno dalla vostra commissione istituzionale cura degli animali). Dislocazione cervicale non deve essere utilizzata come mezzo di eutanasia poiché la procedura potrebbe danneggiare la trachea.</li>
	<li>Una volta che il mouse è eutanasia, iniziare la preparazione della cappa a flusso laminare per insufflazione del polmone del mouse con la soluzione di agarosio/A-media. All'interno della cappa a flusso laminare, impostare un'area di lavoro con il vostro pad sterili. Su questo tampone si inserirà il tuo strumenti sterilizzati, catetere IV, IV set di prolunga e apparato di aspersione di gravità (Vedi Supplemental figura 1).</li>
	<li>Posizionare il mouse in recumbancy dorsale. Con piccole forbici sterili, sezionare con cura lo sterno per esporre la cavità toracica. Fare attenzione a non forare il polmone, poiché una soluzione di agarosio/A-media verrà utilizzata per insufflazione del polmone.</li>
	<li>Quando dissezione fuori dello sterno, sezionare passato l'ingresso toracico su entrambi i lati della trachea. Esporre la trachea dissecando via il tessuto molle circostante.</li>
	<li>Incannulare la trachea con un catetere IV 20 calibro. Senza stringere un nodo chirurgico usando il suturare catgut sterili intorno alla trachea cannulata.</li>
	<li>Allegare un'estensione IV impostata dalla trachea cateterizzata la siringa da 10 mL dell'apparato di aspersione di gravità.</li>
	<li>Combinare l'agarosio di pre-riscaldato 37 oC (5 mL) e A-media (5 mL) in una miscela 1:1. Versare la soluzione di agarosio/A-media liquida nella siringa da 10 mL del dispositivo di aspersione di gravità. Prima insufflazione dei polmoni con la soluzione di agarosio/A-media, assicurarsi che l'intera lunghezza del set di estensione è stata innescata con agarosio/A-media, vanificando così il insufflation accidentale di campioni del polmone con aria.</li>
	<li>Riempire il polmone la soluzione di agarosio/A-media fino a quando il polmone è completamente insufflato.</li>
	<li>Una volta che il polmone è completamente insufflato, rimuovere la cannula e legare saldamente il nodo chirurgico per impedire la fuoriuscita della soluzione il agarase/A-media attraverso la trachea.</li>
	<li>Procedere a sezionare la coratella (trachea, cuore e polmone) dalla cavità toracica. Fare attenzione a non puntura o danneggiare la superficie del polmone.</li>
	<li>Posto la coratella (in nessun particolare orientamento) nel pre-refrigerati 30 mL di PBS integrati con 1 X penna/strep e consentire l'agarosio/A-media a solidificare per 20 min.</li>
	<li>Usando bene forbici e pinzette, tagliare piccoli pezzi del polmone (3 x 1,5 mm) come mostrato in Figura 1A. Sezioni più piccole del polmone possono essere imaged facilmente utilizzando un obiettivo X 2.5. Più sezioni possono essere tagliati a condizione sperimentale, in genere 4-10 fette per ogni gruppo. Nota: Per ogni gruppo sperimentale, sistemare le fettine di polmone in un pozzo separato (piastra a 6 pozzetti) contenente una spugna di gelatina di 2 x 2 cm pre-con B-media. La quantità di supporti per pozzetto deve essere 1,5 mL. Modificare i media ogni 2-3 giorni. Per studi di farmaco, la frequenza di modifica la media/droga è utente determinato.</li>
</ol>3. Widefield fluorescenza Imaging di fette di polmone e di analisi
Nota: Per fluorescenza widefield imaging, più piccole fette sono tagliate (3 x 1,5 x 1 mm) al fine di inserirsi nella sezione di polmone 1 immagine utilizzando un obiettivo X 2.5.
Acquisizione di immagini su un microscopio a fluorescenza widefield:
<ol><li>Fette del polmone sono in genere imaging a 0, 3, 7 e 14 giorni post-iniezione. Nell'ambiente sterile del gabinetto biologico, trasferire con cautela le fettine di polmone dalla gelatina spugne per un fondo di vetro sterile 35 mm tondo piatto. Aver cura di asciugare il liquido in eccesso dal slice del polmone come il liquido in eccesso sarà agire come uno specchio e riflettono la luce fluorescente provenienti dalle cellule del tumore.</li>
	<li>Disporre le fette di polmone in modo simile, raffigurato in Figura 1A. Ogni colonna rappresenta una diversa condizione sperimentale. Fare attenzione a non cross-contaminare i polmoni con le pinzette. Risciacquare con etanolo al 70% e asciugare prima di maneggiare le fette del polmone da un altro gruppo sperimentale.</li>
	<li>Ottimizzare i parametri di imaging (ie. guadagno, offset, esposizione del tempo, binning) che fornisce il miglior contrasto tra le cellule del tumore fluorescente e tessuto polmonare di sfondo del controllo (veicolo non trattata) gruppo. Utilizzare gli stessi parametri del gruppo di controllo per i gruppi sperimentali di immagine. Salvare come formato di immagine tiff.</li>
	<li>Per un riferimento di scala, è possibile scattare una foto digitale di un micrometro allo stesso obiettivo.</li>
	<li>Poiché polmone auto-fluorescenza cambia nel corso del tempo, i parametri di imaging devono essere adeguati ai polmoni controllo ogni sessione di imaging. I parametri di imaging per una sessione potrebbero non necessariamente essere ottimali per le sessioni successive di formazione immagine.</li>
</ol>Analisi dell'immagine: Nota: Le seguenti fasi di lavorazione di immagine sono fatte con ImageJ 1,51 h software pacchetto 17.
<ol><li>Aprire un file di immagine in ImageJ (Figura 3A).</li>
	<li>Sfondo di sottrarre: processo > sottrarre sfondo > Rolling raggio della sfera (inizio con 50 pixel), deseleziona "Light Background" (Figura 3B).</li>
	<li>Convertire immagine in 8-bit formato: immagine > tipo > 8 - bit (Figura 3).</li>
	<li>Impostare le unità di pixel: immagine > invio "Pixel" in unità di lunghezza, immettere 1 nella "Larghezza in Pixel", "Altezza in Pixel", "Voxel profondità". La casella "Global" per applicare alle immagini successive.</li>
	<li>Utilizzando lo strumento di selezione poligono, delineare la forma della fetta intero polmone e determinare l'area (pixel2) della sezione totale del polmone. Questo valore verrà utilizzato per calcolare il carico percentuale del tumore del polmone.</li>
	<li>Immagine di soglia: immagine > regolazione > soglia > evidenziare "Predefinito" e "B & W" > usare il cursore soglia l'immagine tale che la maggior parte delle cellule del tumore è evidenziata con precisione. Premere "Applica" si tradurrà in un'immagine in bianco e nero dove il polmone è tutto nero, e le lesioni fluorescenti sono bianche (Figura 3D). Premendo "Apply" una seconda volta sarà invertito l'immagine dove tutte le strutture fluorescenti sono ora forme nere (Figura 3E).</li>
	<li>Quantificazione del numero e della forma delle lesioni: Analizzare > impostare misure > Verifica "Area". Deselezionare tutte le altre caselle. Analizzare le particelle > dimensioni (pixel2): 0-infinito rappresenta l'intervallo di forme che enumererà ImageJ. Determinare empiricamente la lesione più piccola che è ritenuta per essere una cellula di singolo tumore nelle immagini di veicolo giorno 0. Utilizzare l'area di questa cella di singolo tumore come limite inferiore per le immagini rimanenti nel set di dati. Per il lavoro presentato in questa carta, 11 pixel2 è impostato come il limite inferiore. Per il lavoro presentato nell'esempio dei video, 24 pixel2 è impostato come il limite inferiore. Lasciare "Circolarità" intervallo 0-1. "Show" può essere impostato su "Nothing". In alternativa, se "Show" e "Contorni" è selezionata, viene generato un disegno di tutte le forme con contorni. Verifica "Visualizza risultati" per una finestra separata di misurazioni di pop-up. Facoltativamente, avere selezionata la casella "Aggiungi al manager" salverà tutte le forme quantificate a un manager di ROI, che possa essere salvato per riferimento futuro. Dopo aver premuto OK, una finestra "Risultati" si aprirà contenente tutte le forme enumerate e misure di zona (Figura 3F).</li>
	<li>Copiare e incollare i dati dalla finestra "Risultati" in un foglio di calcolo. Utilizzare la funzione di somma matematica in Excel per sommare tutte le aree delle lesioni metastatiche per quella fetta di particolare del polmone. Per valutare l'onere di tumore del polmone per cento della fetta del polmone, dividere la somma delle aree delle lesioni metastatiche dall'area totale della sezione del polmone. Questo parametro è noto anche come zona frazione (unaA) che è descritto più ulteriormente da Underwood 18. Carico del tumore del polmone = somma dell'area di aree/totale di lesione metastatica della fetta del polmone</li>
	<li>Calcolare il carico del tumore del polmone per il resto delle sezioni del polmone nel gruppo di controllo e restanti gruppi. Tracciare l'onere di tumore polmonare medio per ogni gruppo nel 0, 3, 7 e 14 giorni. Rappresentante widefield immagini fluorescenti delle cellule OS ad alta e bassa metastatiche umane cresce nel modello PuMA a intervalli di tempo progressivo sono visualizzate (Figura 4A). Un grafico di linea che indica il piega-cambiamento (normalizzato al giorno 0) carico percentuale del tumore metastatico nel corso del tempo è mostrato (Figura 4B).</li>
</ol>4. formazione immagine di fluorescenza confocale del modello PuMA
Nota: Per l'imaging confocale, elaborare del tessuto è simile a quello nella sezione precedente tranne che fette più grandi del polmone sono tagliati (sezioni trasversale complete, 1-2 mm di spessore) per consentire più ROIs essere imaged.
Etichettatura del parenchima polmonare con DAR4M:
<ol><li>Immergere le fette di polmone in 10 μμM di DAR4M (in HBSS) per 45 min a 37 ° C. DAR4M etichette di specie reattive dell'azoto all'interno delle cellule del polmone.</li>
	<li>Dopo 45 min di incubazione, sciacquare le fette di polmone con HBSS fresco.</li>
	<li>Mettete la fetta di polmone in un fondo di vetro 35 mm tondo piatto e l'immagine al microscopio confocale.</li>
	<li>I parametri di imaging per le immagini di esempio illustrate nella Figura 5 sono elencati nella tabella 5.</li>
	<li>Acquisire un Z-stack per una regione di interesse. Utilizzare lo spessore di taglio Z suggerito per il campionamento di Nyquist. Un film rappresentativo di uno stack 3D risultati cellule OS fluorescente verde nel tessuto polmonare DAR4M-labeled è fornito in Movie 1 e supplementare Movie 1.</li>
</ol>Per le immagini confocal di esempio illustrate nella Figura 5, la sessione di imaging era terminale. Se la formazione immagine longitudinale è necessaria, si consiglia l'uso di un 2-fotone o multi-fotone attrezzata LSM microscopio confocale per l'imaging poiché ci è meno photodamage vivente tessuti19,20. Cellule MG63 esprimenti di mito-RFP nel modello PuMA di imaging:
<ol><li>Eseguire il protocollo PuMA come muta nel passaggio 1 e 2 con l'utilizzo di cellule MG63 esprimendo il costrutto di mito-RFP.</li>
	<li>Mettete la fetta di polmone in un fondo di vetro 35 mm tondo piatto e l'immagine al microscopio confocale.</li>
	<li>I parametri di imaging per le immagini di esempio illustrate nella Figura 6 sono elencati nella tabella 6. Un film rappresentativo di uno stack 3D risultati cellule OS fluorescente verde con rosso fluorescenti mitocondri è fornito in 2 film e supplementare Movie 2.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il seguente articolo tecnico descrive alcuni aspetti pratici del modello PuMA nello studio di colonizzazione del polmone in OS. Alcuni passaggi critici nel protocollo dove i ricercatori dovrebbero prestare particolare attenzione sono i seguenti:
a) inserimento di una canula della trachea. La trachea può essere facilmente danneggiata durante la dissezione del muscolo circostante e del tessuto connettivo. Inoltre, l'ago del catetere può essere inserito facilmente attraverso la trachea. Prestare ...

I risultati migliori per i pazienti pediatrici con osteosarcoma metastatico (OS) rimane ancora un bisogno insoddisfatto critico di clinica 1. Ciò sottolinea l'importanza di sviluppare nuove terapie mirate al livello molecolare. Chemioterapici convenzionali che proliferazione delle cellule tumorali di destinazione non hanno dimostrato di essere efficace nel trattamento della malattia metastatica e quindi nuove strategie devono avere come destinazione lo stesso processo metastatico 2. L'attuale articolo vengono illustrati gli aspetti pratici di un tipo relativamente nuovo di ex vivo modello della metastasi del polmone, il dosaggio di metastasi polmonare (PuMA) sviluppato da Mendoza e colleghi3, che fornisce uno strumento utile a scoprire nuovi driver molecolare nella progressione di metastasi del polmone in OS 4,5. Prima di procedere, tuttavia, sarebbe prudente toccare brevemente su diversi modelli correnti della metastasi, e come il modello PuMA offre diversi vantaggi rispetto ai convenzionali in vitro dosaggi.
Modelli più sperimentali usati per studiare metastasi dispongono di sistemi in vitro e in vivo che ricapitolano un passo specifico o diversi passaggi della cascata metastatica. Tali passaggi includono: 1) tumorale abbandonando il tumore primario, 2) intravasation nei vasi vicini (sangue o linfatico) e transito all'interno di circolazione, 3) arresto al sito secondario, 4) stravaso e sopravvivenza presso il sito secondario, formazione di 5) di micrometastasi e 6) crescita in metastasi vascolarizzate (Figura 1). Modelli in vitro di metastasi possono includere migrazione di 2-dimensionale (2D) e 3-dimensionale (3D) saggi di invasione di Matrigel che sono esaminati in dettaglio altrove 6. Per i modelli in vivo , i due sistemi di modello comunemente usate includono: 1) il modello della metastasi spontanea è dove un tumore le cellule sono orthotopically iniettato in un tipo specifico tessuto per formare un tumore locale che getta spontaneamente le cellule metastatiche ai luoghi distanti; 2) il modello della metastasi sperimentale è dove le cellule del tumore sono iniettate nel vaso sanguigno a monte dell'organo bersaglio. Ad esempio, un'iniezione della vena della coda dei risultati delle cellule del tumore nello sviluppo polmonare metastasi5,7,8. Altri modelli di metastasi sperimentali includono iniezione delle cellule del tumore nella milza o vena mesenterica che provoca lo sviluppo di metastasi epatiche9,10. Considerazioni pratiche di questi modelli in vivo sono discussi in dettaglio da Welch 11. Un altro modello in vivo utilizzato per lo studio di metastasi nei sarcomi pediatrici è il modello di impianto di subcapsular del tumore renale del rene che si traduce in formazione locale del tumore e metastasi spontanea per i polmoni 12,13. Una tecnica più tecnicamente impegnativa come videomicroscopia videomicroscopia può visualizzare direttamente, in tempo reale, interazioni tra cellule tumorali metastatiche e del microcircolo di un sito metastatico (cioè. polmone o fegato) come descritto da MacDonald14 ed Entenberg15, o lo stravaso delle cellule di cancro nella membrana corio-allantoidea come descritto da Kim 16.
Il modello di PuMA è un ex vivo, espianto del tessuto polmonare, il sistema di coltura chiuso dove la crescita delle cellule del tumore fluorescenti possa essere osservata longitudinalmente tramite microscopia a fluorescenza per un periodo di un mese (Vedi Figura 2A). Questo modello racchiude in sintesi le fasi iniziali di colonizzazione del polmone (passaggi da 3 a 5) in cascata metastatica. Alcuni vantaggi principali del modello PuMA rispetto ai modelli convenzionali in vitro sono: 1) fornisce la possibilità di misurare la crescita della cellula tumorale metastatico in un microambiente 3D che conserva molte delle caratteristiche del microambiente polmonare longitudinalmente vivo 3; 2) puMA consente al ricercatore di valutare se l'atterramento di un trattamento di gene o farmaco candidato ha attività anti-metastatica nel contesto di un microambiente polmonare 3D; 3) il modello di PuMA è flessibile con molti tipi di piattaforme di microscopia di fluorescenza (Figura 2B) come microscopia di fluorescenza widefield o microscopia confocale a scansione laser, esempi di ciascuno sono mostrati in Figura 2 & D, rispettivamente. Questo articolo verrà illustrato come utilizzare il modello di PuMA per ottenere dati di imaging longitudinali sulla crescita metastatica di migliorata della proteina fluorescente verde (eGFP)-che esprimono, le cellule umane di osteosarcoma metastatico ad alta e bassa (cellule MNNG e HOS, rispettivamente) utilizzando basso ingrandimento widefield fluorescenza. Esempi di un colorante fluorescente che etichette il parenchima polmonare e una proteina fluorescente rosso reporter genetici che etichette mitocondri in OS cellule nel modello PuMA mediante microscopia confocale a scansione laser imaging inoltre sono discussi.

<table><tbody><tr><td>Tabella 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagenti per colture cellulari per terreni A, terreni B e terreni completi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MNNG-HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1547</td><td>linea cellulare OS altamente metastatica</td></tr><tr><td>HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td>linea cellulare OS scarsamente metastatica</td></tr><tr><td>MG63.3</td><td>Amy LeBlanc Laboratory (NCI)</td><td>N/A</td><td>linea cellulare OS altamente metastatica</td></tr><tr><td>MG63</td><td>ATCC</td><td>CRL-1427</td><td>linea cellulare OS scarsamente metastatica</td></tr><tr><td>10X terreni M199</td><td>Thermofisher</td><td>11825015</td><td>Terreni di base per terreni A e terreni B</td></tr><tr><td>Acqua distillata (sterilizzata)</td><td>Thermofisher</td><td>15230-147</td><td>Componente di terreni A e Soluzione di</td></tr><tr><td>bicarbonato di sodio al 7,5%</td><td>B-media Thermofisher</td><td>25080094</td><td>Componente di A-media & B-media</td></tr><tr><td>Idrocortizone</td><td>Sigma-Alrich</td><td>H6909</td><td>Componente di A-media & B-media</td></tr><tr><td>Acetato di retinolo solubile in acqua</td><td>Sigma-Alrich</td><td>R0635-5MG</td><td>Componente di A-media & Soluzione concentrata B-media</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina 10X (10000 U/ml)</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td>Componente di A-media & B-media, media completo.</td></tr><tr><td>Soluzione di insulina bovina (10mg/ml)</td><td>Sigma-Alrich</td><td>I0516-5ML</td><td>Componente di A-media & B-media</td></tr><tr><td>DMEM, alto glucosio</td><td>Thermofisher</td><td>11965092</td><td>Terreni base del terreno completo</td></tr><tr><td>L-Glutammina (200 mM)</td><td>Thermofisher</td><td>25030081</td><td>Componente del terreno completo</td></tr><tr><td>Fetale Siero bovino</td><td>Thermofisher</td><td>16000044</td><td>Componente del terreno completo</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Thermofisher</td><td>14190144</td><td>Utilizzato in coltura cellulare.</td></tr><tr><td>Hank' s Soluzione di sali tamponati, senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenolo</td><td>Thermofisher</td><td>14175095</td><td>Utilizzato per risospendere il pellet cellulare prima dell'iniezione</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo</td><td>Thermofisher</td><td>25200114</td><td>Utilizzato in colture cellulari.</td></tr><tr><td>DAR4M</td><td>Enzo</td><td>ALX-620-069-M001</td><td>Utilizzato per etichettare il parenchima polmonare.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Table 3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiali per PuMA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 710 LSM confocale</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>LSM verticale confocale microscopio</td></tr><tr><td>Zeiss 780 LSM confocale</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Microscopio confocale LSM invertito</td></tr><tr><td>SCID topi Charles</td><td>River</td><td>N/A</td><td>NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, femmina, età 6-8 settimane</td></tr><tr><td>GelFoam</td><td>Harvard Apparatus</td><td>59-9863</td><td>Utilizzato come supporto per sezioni di tessuto polmonare.</td></tr><tr><td>SeaPlaque Agarosio</td><td>Lonza</td><td>50100</td><td>Utilizzato durante l'insufflazione del polmone.</td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml con ago calibro 27</td><td>Fisherscientific</td><td>14-826-87</td><td>Utilizzato per l'iniezione della vena caudale.</td></tr><tr><td>Siringa da 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td>Utilizzato per l'insufflazione del polmone.</td></tr><tr><td>Catetere calibro 20</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2032CA</td><td>Utilizzato durante l'insufflazione del polmone.</td></tr><tr><td>Set di prolunga Abbott IV (30", sterile)</td><td>Medisca</td><td>8342</td><td>Utilizzato durante l'insufflazione del polmone.</td></tr><tr><td>Tamponi imbevuti di alcol</td><td>BD</td> 326895 <td>Per pulire la vena della coda prima</td><td>dell'iniezione</td></tr><tr><td>Guanti chirurgici sterili</td><td>Fisherscientific</td><td>Varia a seconda delle dimensioni</td><td>Mano asscettica dei polmoni di topo</td></tr><tr><td>Righello di 30 cm</td><td>Graffe</td><td></td><td>Utilizzato per l'insufflazione del polmone.</td></tr><tr><td>Supporto per righello</td><td>Pipette.com</td><td>HS29022A</td><td>Utilizzato per l'insufflazione del polmone.</td></tr><tr><td>Piatto di coltura con fondo in vetro da 35 mm</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td>Utilizzato durante l'imaging di fette polmonari Sottocuscinetti</td></tr><tr><td>assorbenti con barriera all'umidità impermeabile</td><td>VWR</td><td>56617-014</td><td>Utilizzato per rivestire l'area di lavoro sterile nella cappa biologica.</td></tr><tr><td>Catgut Plain Suture Riassorbibile</td><td>Braun</td><td>N/A</td><td>Utilizzato per legare la trachea cannulata.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Table 4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strumenti chirurgici per PuMA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro Forbici da dissezione 3.5" Dritte Affilate/Affilate</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td>Per il taglio di sezioni polmonari</td></tr><tr><td>da 4" (10 cm) Punta lunga seghettata dritta extra delicata da 0,5 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-5132</td><td>Per manipolare/trattenere sezioni polmonari.</td></tr><tr><td>4 pollici (10 cm) Punta lunga seghettata con curva leggera da 0,8 mm</td><td>Roboz</td><td>RS5135</td><td>Per manipolare/trattenere sezioni polmonari.</td></tr><tr><td>pinze per medicazione del pollice; Seghettato; Delicato; Lunghezza 4,5"; 1,3 mm Larghezza punta</td><td>Roboz</td><td>RS-8120</td><td>Per la dissezione generale.</td></tr><tr><td>Pinze per medicazione pollice 4,5" seghettate 2,2 mm Larghezza punta</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td>Per la dissezione generale.</td></tr><tr><td>Forbici da microdissezione extra fini 3,5" dritte affilate/affilate, lama da 20 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-5880</td><td>Per dissezione generale.</td></tr><tr><td>Forbici Knapp; Diritto; Tagliente-Blunt; Lunghezza lama 27 mm; 4" di lunghezza totale</td><td>Roboz</td><td>RS-5960</td><td>Per la dissezione generale.</td></tr></tbody></table>

considerazioni pratiche nello studio di colonizzazione del polmone metastatico nell'osteosarcoma usando l'analisi di metastasi polmonare

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Il dosaggio di metastasi polmonare (PuMA) è un ex vivo espianto del polmone e il sistema di coltura di cellule chiuse che permette ai ricercatori di studiare la biologia della colonizzazione del polmone nell'osteosarcoma (OS) da microscopia di fluorescenza. In questo articolo fornisce una descrizione dettagliata del protocollo e vengono illustrati esempi di ottenere dati di immagine sulla crescita metastatica utilizzando widefield o piattaforme di microscopia di fluorescenza confocale. La flessibilità del modello PuMA permette i ricercatori a studiare non solo la crescita delle cellule di OS nel microambiente polmonare, ma anche di valutare gli effetti di anti-metastatica terapeutica nel tempo. La microscopia confocale permette per l'imaging ad alta risoluzione, senza precedenti delle interazioni cellula OS con il parenchima polmonare. Inoltre, quando il modello di PuMA è combinato con coloranti fluorescenti o reporter genetici proteina fluorescente, i ricercatori possono studiare il microambiente polmonare, strutture cellulare e subcellulare, funzione del gene e l'attività del promotore in cellule metastatiche di OS. Il modello PuMA fornisce un nuovo strumento per i ricercatori di osteosarcoma scoprire la nuova biologia di metastasi e valutare l'attività di nuove terapie anti-metastatiche, mirate.

Microscopia di fluorescenza basso ingrandimento widefield
Per microscopia di fluorescenza widefield delle fette di polmone di PuMA, immagini rappresentative e quantificazione dei dati è mostrati in Figura 2e Figura 4A e B. Le propensioni per linee ad alta e bassa metastatico delle cellule metastatici sono visivamente evidente s...

L'obiettivo di questo articolo è di fornire una descrizione dettagliata del protocollo per il dosaggio di metastasi polmonare (PuMA). Questo modello permette ai ricercatori di studiare la crescita delle cellule di osteosarcoma metastatico (OS) nel tessuto del polmone usando un widefield fluorescenza o il microscopio confocale a scansione laser.

Considerazioni pratiche nello studio di colonizzazione del polmone metastatico nell'Osteosarcoma usando l'analisi di metastasi polmonare

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

L'obiettivo generale di questo test per le metastasi polmonari è quello di visualizzare e studiare direttamente la crescita delle cellule di osteosarcoma metastatico nel tessuto polmonare vitale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande davvero chiave nel campo delle metastasi dell'osteosarcoma. Ad esempio, come le cellule metastatiche dell'osteosarcoma si adattano, sopravvivono e proliferano nel microambiente polmonare.Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente una visualizzazione diretta della crescita delle cellule metastatiche dell'osteosarcoma in un microambiente tridimensionale rilevante. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà, a causa delle fasi tecnicamente impegnative dell'incannulamento della trachea e dell'insufflazione del polmone. L'iniezione della vena caudale delle cellule tumorali e l'eutanasia del topo vengono eseguite secondo le linee guida istituzionali standard.Dopo cinque minuti, posizionare il topo soppresso in decubito dorsale su un tampone sterile in una cappa a flusso laminare e utilizzare piccole forbici sterili per sezionare con cura lo sterno, oltre l'ingresso toracico su entrambi i lati della

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Ricerca sul cancro

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Metastasi di analisi sperimentale

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Una migliore visualizzazione delle metastasi polmonari a risoluzione singola cella in Mouse di combinata<em&gt; In-situ</emPerfusione&gt; del tessuto polmonare e X-Gal colorazione del<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged cellule tumorali

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Uso combinato dei saggi di metastasi della vena della coda e dell'imaging in vivo in tempo reale per quantificare la colonizzazione metastatica del cancro al seno e il carico nei polmoni

L'iniezione endovenosa di cellule tumorali viene spesso utilizzata nella ricerca sulle metastasi, ma il carico tumorale metastatico può essere difficile da analizzare. Qui, dimostriamo un modello di iniezione della vena caudale di metastasi e includiamo un nuovo approccio per analizzare il carico tumorale polmonare metastatico risultante.

Analisi patologica delle metastasi polmonari a seguito di iniezione laterale della vena della coda di cellule tumorali

I modelli di metastasi ossee non sviluppano metastasi in modo uniforme o con un'incidenza del 100%. L'iniezione diretta di cellule tumorali intra-ossee può provocare l'embolizzazione del polmone. Presentiamo la nostra tecnica di modellazione dei tumori ossei primari e delle metastasi ossee utilizzando l'impianto di innesto tumorale solido nell'osso, portando a attecchimento e crescita riproducibili.

Modellazione dei tumori ossei primari e delle metastasi ossee con impianto di innesto tumorale solido nell'osso

Qui, viene descritto un impianto ortotopico singenico seguito da una procedura di amputazione dell'osteosarcoma con metastasi polmonari spontanee che può essere utilizzato per l'indagine preclinica della biologia delle metastasi e lo sviluppo di nuove terapie.

Un modello di ratto sprague Dawley ortotopico singenico con amputazione per controllare il tasso di metastasi

Il presente protocollo descrive l'iniezione di cellule di osteosarcoma intratibia per generare modelli murini portatori di osteosarcoma ortotopico e lesioni da metastasi polmonari.

Iniezione di cellule di osteosarcoma intratibiale per generare modelli murini di osteosarcoma ortotopico e metastasi polmonari

Il manoscritto descrive una metodologia per l'instaurazione e il monitoraggio longitudinale della crescita delle metastasi polmonari spontanee da tumori mammari iniettati ortotopicamente, suscettibili di intervento in tutte le fasi della cascata metastatica.

In vivo Imaging per misurare le metastasi polmonari spontanee di cellule tumorali mammarie iniettate ortotopicamente

Questo protocollo sperimentale fornisce un metodo stabile, economico ed efficiente che combina il knockdown dell'inncRNA con saggi formatori di colonie per quantificare l'effetto dell'inncRNA sulla proliferazione cellulare dell'osteosarcoma.

Test di formazione di colonie che rileva la capacità proliferativa delle cellule osteosarcoma knockdown di RNA LncRNA

Impara l'assay di metastasi polmonare per studiare la crescita delle cellule di osteosarcoma metastatico nel tessuto polmonare. Questo metodo consente la visualizzazione diretta in un microambiente tridimensionale.

Considerazioni pratiche nello studio di colonizzazione del polmone metastatico nellOsteosarcoma usando lanalisi di metastasi polmonare (Video) | JoVE Journal

Considerazioni pratiche nello studio di colonizzazione del polmone metastatico nell'Osteosarcoma usando l'analisi di metastasi polmonare

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