Fabbricazione e validazione di un sistema di organo-on-chip con elettrodi integrati direttamente quantificare transendoteliale resistenza elettrica

L'obiettivo generale di questo video è mostrare come fabbricare e utilizzare chip microfluidici con elettrodi integrati per misure di resistenza elettrica transendoteliale o transepiteliale, o misure TEER. Ciò è dimostrato utilizzando una barriera emato-encefalica nel chip microfluidico. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo degli Organs-on-Chip, consentendo la misurazione diretta della funzione di barriera, ad esempio, del tessuto barriera emato-encefalico utilizzando elettrodi integrati.

Il vantaggio principale della nostra tecnica è che gli elettrodi sono facilmente integrati nei sistemi Organ-on-Chip e che i risultati di questo possono essere confrontati tra i diversi sistemi. Le implicazioni di questa tecnologia si estendono alla comprensione della funzione della barriera emato-encefalica in salute e malattia, alla scoperta di farmaci e alla medicina personalizzata. Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per fornire informazioni sulla funzione della barriera emato-encefalica, può anche essere utilizzato nel contesto di altri sistemi Organ-on-Chip come il Lung-on-Chip e il Gut-on-Chip.

Per iniziare questa procedura, mescolare accuratamente 27 grammi di agente base PDMS e 2,7 grammi di agente indurente. Quindi degassare la miscela in un essiccatore per circa 45 minuti per rimuovere le bolle d'aria. Nel frattempo, preparare lo stampo per la miscela PDMS liquida attaccando del nastro adesivo trasparente attorno allo stampo, oppure posizionare lo stampo in un apposito supporto per wafer

Versare la miscela PDMS degassata sullo stampo. Quindi, polimerizzare la miscela PDMS in forno a 60 gradi Celsius per quattro ore e lasciarla raffreddare in seguito. In una cappa a flusso incrociato, estrarre il PDMS polimerizzato dallo stampo.

Tagliare la replica del PDMS in parti separate del chip superiore e inferiore utilizzando le linee di taglio nel PDMS. Successivamente, praticare quattro fori nelle parti superiori utilizzando un punzone per biopsia affilato con un diametro di un millimetro per formare ingressi e uscite. Perforare dall'interno verso l'esterno per evitare che i detriti del PDMS si accumulino nel chip.

Quindi, coprire le parti del chip con del nastro adesivo trasparente per proteggerle dalla polvere. Successivamente, tagliare le membrane in policarbonato dagli inserti del transwell in quadrati di circa tre per tre millimetri quadrati. Successivamente, assemblare una membrana porosa priva di perdite tra due parti PDMS per assemblare un dispositivo a due strati interfacciato con una membrana porosa.

A tal fine, preparare una malta di toluene PDMS utilizzando 0,7 grammi di agente base PDMS, 07 grammi di agente indurente e 540 microlitri di toluene. Agitare accuratamente la malta, quindi ricoprire 200 microlitri di malta su un vetrino coprioggetti a 1500 giri/min per 60 secondi per acquisire uno strato sottile e uniforme di malta. Quindi trasferisci un sottile strato di malta dal vetrino coprioggetti sulla parte inferiore del chip con un rullo inchiostratore.

Mettere la parte inferiore in una pirofila da forno e poi trasferire il mortaio sulla parte superiore della patatina. Con una serie di pinzette, immergi i bordi di una membrana nella malta filata e posizionala con cura al centro della parte inferiore. Successivamente, posizionare con cura la parte superiore sulla parte inferiore prestando attenzione all'allineamento.

Copri gli ingressi dei trucioli con del nastro adesivo trasparente per evitare che la polvere entri nel truciolo e cuocili a 60 gradi Celsius per tre ore. Fare attenzione è molto importante in questo passaggio. Non esercitare pressione sul truciolo e non far scorrere la parte superiore sulla parte inferiore, per evitare che la malta entri nei canali e ostruisca la membrana.

Per integrare gli elettrodi nei canali laterali, tagliare un filo di platino in pezzi lunghi due centimetri. Quindi, immergili nell'acetone per 30 minuti. Quindi sciacquateli con acqua ed etanolo e lasciateli asciugare.

In una cappa a flusso incrociato, metti un chip su un piatto di plastica. Inserisci quattro fili di platino nei canali degli elettrodi del chip usando un paio di pinzette e piegali verso il basso sulla piastra di plastica per consentire il fissaggio alla piastra nel passaggio successivo. Inserire i fili da 0,7 a un millimetro nel canale di coltura oltre la giunzione del canale a forma di T.

Successivamente, applicare una goccia di colla polimerizzabile ai raggi UV all'ingresso del canale dell'elettrodo e lasciare che la colla riempia il canale con forze capillari. Quindi, accendi l'UV e polimerizza la colla quando raggiunge la fine del canale dell'elettrodo. Fissato i quattro elettrodi integrati alla piastra di plastica con un adesivo epossidico bicomponente.

Successivamente, coprite le patatine con del nastro adesivo trasparente e cuocetele a 60 gradi Celsius per due ore. Lasciarli raffreddare e conservarli senza polvere fino al momento dell'uso. Per rivestire i chip e favorire l'adesione delle cellule, riempire entrambi i canali con PBS prima di introdurre i reagenti.

Controllare al microscopio se ci sono bolle d'aria nei canali. In tal caso, rimuovili sciacquandoli con PBS extra. Successivamente, riempire entrambi i canali con 30 microlitri di 20 microgrammi per millilitro di fibronectina umana in PBS.

Incubarli a 37 gradi Celsius per tre ore. Quindi sciacquare le patatine con un terreno di coltura endoteliale e incubarle a 37 gradi Celsius per due ore. Successivamente, misurare il TEER dei chip bianchi per assicurarsi che tutti gli elettrodi siano a diretto contatto con il fluido nei canali.

Per fare ciò, prendi un chip dall'incubatrice e lascialo raggiungere la temperatura ambiente per almeno dieci minuti. Rimuovere il liquido dalla piastra di plastica attorno agli elettrodi per evitare la formazione di ponti elettrolitici all'esterno del chip. Quindi, prendi lo spettro di impedenza da 200 hertz a un megahertz per ogni combinazione di due elettrodi, ottenendo sei spettri di impedenza per chip in cinque-dieci minuti, da cui è possibile determinare direttamente il TEER.

Verificare se gli spettri di impedenza hanno le grandezze e le forme previste per convalidare la misurazione TEER. A questo punto, preparare una sospensione cellulare da inserire nel canale superiore rimuovendo il terreno di coltura da un pallone di coltura con monostrato confluente di cellule hcMEC/D3. Successivamente, lavare le celle con PBS.

Rimuovere il PBS e quindi aggiungere due millilitri di tripsina EDTA allo 05% e incubare a 37 gradi Celsius per due-cinque minuti fino a quando le cellule non si sono staccate dal pallone di coltura. Quindi, disattivare la tripsina con terreno di coltura integrato con il 20% di FBS. Conta le celle e calcola il loro numero totale in sospensione.

Nel frattempo, centrifugare le cellule hcMEC/D3 a 390 volte g per cinque minuti. Successivamente, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare nel volume appropriato di terreno di crescita endoteliale per ottenere una concentrazione di cinque milioni di cellule per millilitro corrispondente a una densità di semina di 200 mila cellule per centimetro quadrato nel chip. Quindi, pipettare lentamente 30 microlitri della sospensione cellulare ben miscelata nel canale superiore e rimuovere la pipetta dall'ingresso con un movimento fluido pur continuando a esercitare pressione.

Controllare la densità di semina al microscopio. Dovrebbe essere ottenuta una distribuzione uniforme delle cellule in tutto il canale superiore. Quindi incubare le patatine a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica per almeno un'ora.

Successivamente, sciacquare tutte le cellule non attaccate con terreno di coltura endoteliale. Tenere presente che il TEER viene monitorato durante il periodo di coltura. Questi sono i tipici intervalli di impedenza schematica che mostrano l'ampiezza dell'impedenza e lo sfasamento rispetto alla frequenza per la spettroscopia di impedenza elettrica su chip senza celle e con celle.

Ci sono quattro regioni principali che sono dominate dalla capacità a doppio strato sugli elettrodi, dalla resistenza del mezzo di coltura, dalla resistenza della barriera cellulare o dalla capacità della membrana cellulare. La regione di interesse indica dove può essere quantificato il contributo dello strato cellulare. E questa è la formula per calcolare il TEER dalle resistenze misurate tra tutte e sei le combinazioni di quattro elettrodi.

Qui è mostrato il TEER medio di quattro BBB sui chip durante il periodo di coltura di tre giorni, raggiungendo un plateau di 22 più o meno 1,3 ohm centimetro quadrato. Per confronto, sono inclusi i dati dei chip vuoti, che mostrano la variazione marginale e la deviazione dal centimetro quadrato di zero ohm nello stesso periodo rispetto alla variazione del valore TEER dei chip con celle. La microscopia a fluorescenza dei nuclei colorati ha rivelato un monostrato continuo di endotelio sia sul PDMS che sulla membrana nella posizione indicata nel riquadro.

L'immunofluorescenza ha rivelato la presenza di una proteina a giunzione stretta zonula occludens, indicando che le giunzioni strette specifiche per la BBB tra le cellule danno origine al TEER misurato. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione della fabbricazione e dell'uso di chip con elettrodi integrati per le misure TEER in Organs-on-Chips. Questa tecnica può essere utilizzata nel campo della ricerca sulla barriera emato-encefalica per studiare la somministrazione diretta e le caratteristiche della malattia, ad esempio, nel morbo di Alzheimer.

Seguendo questa procedura, la funzione di barriera dell'endotelio cerebrale differenziato dalle cellule staminali pluripotenti indotte di origine umana può anche essere monitorata per applicazioni nella medicina personalizzata.