Name: Fabbricazione e validazione di un sistema di organo-on-chip con elettrodi integrati direttamente quantificare transendoteliale resistenza elettrica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Scopri come fabbricare un sistema organ-on-chip con elettrodi integrati per misurare direttamente la resistenza elettrica transendoteliale (TEER). Questo metodo consente di studiare la funzione della barriera ematoencefalica in tempo reale.

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Noi riconosciamo con gratitudine Johan Bomer per la fabbricazione della muffa e Mathijs Bronkhorst per discussioni fruttuose e assistenza con rappresentazione dei dati.
Questa ricerca è stata finanziata da: SRO microdispositivi di L.I. Segerink, MIRA istituto biomedico per ingegneria biomedica e tecnica di medicina, Università di Twente; SRO organi-on-chip di A.D. van der Meer, MIRA Istituto di ingegneria biomedica e tecnica di medicina, Università di Twente; e VESCEL, ERC Advanced Grant di A. van den Berg (grant No. 669768).

1. fabbricazione del dispositivo organo-on-chip <ol><li>fare una replica PDMS di uno stampo con i disegni di canale, fabbricato utilizzando tecniche standard di fotolitografia e ottenere le parti PDMS del chip microfluidici.
	<ol><li>Pesare circa 27 g PDMS base agente e agente indurente 2,7 g; il rapporto tra la massa deve essere di 10:1. Questo è buono per una lastra PDMS spessa 3 mm su uno stampo con diametro 130 mm (5 pollici). Mescolare questi componenti accuratamente.</li>
		<li>Degas la miscela in un essiccatore per circa 45 min per rimuovere le bolle d'aria.</li>
		<li>Nel frattempo, preparare lo stampo per la miscela liquida di PDMS da attaccare nastro adesivo trasparente intorno allo stampo o posizionare lo stampo in un supporto adatto cialda.</li>
		<li>Versare il composto PDMS degassato su stampo. Se qualsiasi aria bolle è rimasto nella miscela PDMS o presso la superficie dello stampo, degas nuovamente per circa 30 min.</li>
		<li>Curare la miscela PDMS in forno a 60 ° C per 4 h. Consenti raffreddare.</li>
		<li>In una cappa a flusso incrociato, tirare il PDMS curata dallo stampo; lo stampo può essere riutilizzato immediatamente per rendere più repliche PDMS.</li>
		<li>Tagliare la replica PDMS in separato superiore e quella inferiore del chip utilizzando linee di taglio nel PDMS.</li>
		<li>Pugno quattro fori nella parte superiore, usando un punzone per biopsia tagliente con diametro di 1 mm a modulo ingressi e uscite. Punch da interno a esterno per evitare che i detriti PDMS dalla raccolta nel chip. Coprire le parti di chip con nastro adesivo trasparente per proteggerli dalla polvere.</li>
		<li>Membrane in policarbonato da inserti di Transwell tagliata a quadrati di circa 3 × 3 mm 2.</li>
	</ol></li> <li>Montare una membrana porosa trafilamenti tra due parti PDMS al fine di montare un dispositivo di due-strato interfacciata con una membrana porosa. 
	Nota: Questo protocollo è adattato da Griep et al. 19 e Chueh et al. 26 <ol><li>preparare un mortaio PDMS/toluene utilizzando 0,7 g di agente base PDMS, 0,07 g di agente indurente e 540 µ l di toluene, risultante in un rapporto di peso di 5:3. Vortice il mortaio accuratamente.</li>
		<li>Spin-cappotto 200 µ l di mortaio sul vetrino coprioggetti a 1500 giri/min per 60 s (dilagato a 1000 giri/min/s) di acquisire un sottile strato uniforme di Malta.</li>
		<li>Trasferire un sottile strato di Malta dal coprioggetto sulla parte inferiore e una parte superiore del chip con un rullo inchiostrato. Mettere la parte inferiore in un piatto nel forno.</li>
		<li>Con un set di pinzette, immergere i bordi di una membrana nel mortaio spin-rivestito e posizionarlo attentamente nel mezzo la parte inferiore.</li>
		<li>Posizionare la parte superiore sulla parte inferiore, prestando attenzione all'allineamento. 
		Nota: Non esercitare pressione sul chip e non far scorrere la parte superiore sulla parte inferiore per evitare che la Malta da inserire i canali e intasamento della membrana.</li>
		<li>Coprire le insenature di chip con nastro adesivo trasparente per evitare che la polvere penetri il chip e cuocere in forno a 60 ° C per 3 h.</li>
	</ol></li> <li>Elettrodi integrare i canali collaterali. 
	Nota: Questo protocollo è adattato da Griep et al. 19 e Douville et al. 18 <ol><li>tagliare il filo di platino in pezzi di circa 2 cm. pulite immergendo loro in acetone per 30 min. risciacquo con acqua ed etanolo e lasciare per asciugare.</li>
		<li>In una cappa a flusso incrociato, mettere un chip su un piatto di plastica. Inserire i quattro fili di platino nei canali di elettrodo di un chip utilizzando un paio di pinzette e piegarle verso il basso sul piatto da portata in plastica per consentire la fissazione per il piatto in un passaggio successivo. Inserire i fili 0,7-1 mm nel canale cultura, superare il bivio per canale a forma di T.</li>
		<li>Applicare una goccia di colla UV-curable presso l'ingresso del canale di elettrodo e lasciare la colla riempire il canale intorno all'elettrodo di forze capillari.</li>
		<li>Accendere UV e cura la colla quando raggiunge la fine del canale elettrodo. 
		Attenzione: Non guardare la sorgente di luce UV come questo può danneggiare gli occhi.</li>
		<li>Fissare i quattro elettrodi integrati per il piatto di plastica con un adesivo epossidico bicomponente. Questo consente di più facile gestione degli elettrodi durante le misurazioni senza il rischio di tirare gli elettrodi dal chip.</li>
		<li>Coprire i chip con nastro adesivo trasparente e cuocere in forno a 60 ° C per 2 h. Consenti far raffreddare e conservare la polvere fino all'utilizzo. In questo modo possono essere tranquillamente conservato per fino a un mese.</li>
	</ol></li></ol> 2. Cultura del cervello-ha derivato le cellule endoteliali su chip <ol><li>cappotto i chip per promuovere il collegamento delle cellule.
	<ol><li>Riempimento entrambi canali con fosfato tampone salino (PBS) per bagnarle prima di introdurre i reagenti. Controllare al microscopio se ci sono eventuali bolle d'aria nei canali. In questo caso, rimuoverli sciacquando con PBS supplementare.</li>
		<li>Riempire entrambi i canali con 30 µ l di fibronectina umana di 20 µ g/mL in PBS. Incubare a 37 ° C per 3 ore. Verificare eventuali bolle d'aria e, se necessario, sciacquare i canali con PBS e riempire con soluzione di fibronectin.</li>
		<li>Lavare le patatine con il mezzo di crescita endoteliale e incubare a 37 ° C e 5% CO 2 nell'incubatrice per 2 h.</li>
		<li>Misurare il TEER dei chip vuoto come descritto nel passaggio 3 per garantire che tutti gli elettrodi sono a diretto contatto con il fluido nei canali. Nei chip vuote, i valori tipici di TEER sono 0-1 Ω cm 2.</li>
	</ol></li> <li>Cellule di semi in canale superiore.
	<ol><li>Rimuovere il terreno di coltura da una boccetta di cultura (zona di coltura di 75 cm 2) con un monostrato confluente di cellule endoteliali microvascolari cerebrali umane (hCMEC/D3).</li>
		<li>Lavare le cellule con PBS. Aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA 0,05% e incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per 2-5 minuti fino a quando le cellule hanno staccato dalla beuta cultura.</li>
		<li>Disattivare la tripsina con cultura supplementato con 20% siero bovino fetale (FBS). Contare le celle e calcolare il numero totale di cellule in sospensione.</li>
		<li>Nel frattempo, centrifugare le cellule hCMEC/D3 a 390 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare nel volume appropriato del mezzo di crescita endoteliale (EGM-2) per arrivare ad una concentrazione di 5 x 10 6 cellule/mL. Questo si traduce in una densità di semina di 2 x 10 5 cellule/cm 2 nel chip.</li>
		<li>Lentamente Pipettare 30 µ l di sospensione cellulare ben miscelato in canale superiore e rimuovere la pipetta dall'ingresso in un movimento fluente pur ancora esercitando pressione.</li>
		<li>Verifica la densità di semina sotto un microscopio. Una distribuzione uniforme delle cellule durante il canale superiore dovrebbe essere raggiunto.</li>
		<li>Incubare i chip a 37 ° C e 5% di CO 2 per almeno 1 h. scovare eventuali cellule non attaccate con terreno di coltura endoteliale.</li>
	</ol></li> <li>Mantenere la cultura endoteliale su chip.
	<ol><li>Due volte al giorno, inserire le punte di pipetta piena di terreno di coltura come serbatoi nelle insenature e sostituire il mezzo all'interno del chip di gravità flusso. 
		Nota: Per evitare bolle d'aria di entrare i microcanali e distruggendo lo strato delle cellule, assicurarsi di rendere fluido-fluido contatto tra la punta della pipetta e il fluido in cima il chip prima di inserire la punta in un'insenatura. Questo può essere facilitato con l'aggiunta di una piccola goccia presso l'in / presa prima dell'inserimento di pipetta.</li>
		<li>Anche aggiungere pipetta punta serbatoi nei punti vendita per evitare che i canali secchi.</li>
		<li>Incubare i chip a 37 ° C e 5% CO 2.</li>
	</ol></li></ol> 3. Misurazioni di TEER su chip <ol><li>impostare the apparecchi di misurazione TEER, composto di un lock-in amplifier e un circuito di cavo sonda come è stato specificato in Van der Helm et al. 16 in alternativa, potentiostats o impedenza analizzatori sono adatti anche per questi misure basate su impedenza TEER.</li>
	<li>Prendere il chip dall'incubatrice e lasciare che raggiunga la temperatura ambiente per almeno 10 min. Remove qualsiasi fluido dal piatto plastica attorno agli elettrodi per prevenire elettrodo gettare un ponte di fuori del chip.</li>
	<li>Prendere lo spettro di impedenza da 200 Hz a 1 MHz per ogni combinazione di due elettrodi, con conseguente 6 spettri di impedenza per il circuito integrato in solo 5-10 min Check se gli spettri di impedenza avere il previste grandezze e forme per convalidare la misurazione TEER, come è descritto nella sezione risultati.</li>
	<li>Mettere il chip indietro nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO 2 dopo aver terminato la misurazione.</li>
	<li>Elaborare gli spettri di impedenza ottenuti per arrivare ad un valore normalizzato di TEER.
	<ol><li>Get la misura resistenza <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq1.jpg"> tra elettrodi <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq2.jpg"> e <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq3.jpg">, come indicato in Figura 2B e D, dall'altopiano resistivo a 10 kHz negli spettri di impedenza corrispondente.</li>
		Tramite l'equazione di Figura 2 16 punti <li>Calculate TEER utilizzando le sei resistenze misurate corrisponde a un unico chip in una sola volta: 
		<img alt="Equation 20" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq20.jpg"> in questa equazione, <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq4.jpg"> è l'area di cultura attraverso la quale è stata misurata la resistenza, &lt; img alt = " L'equazione 5"src="/files/ftp_upload/56334/56334eq5.jpg "/ &gt; è la resistenza della barriera cellulare e della membrana, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq6.jpg">, <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq7.jpg">, <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq8.jpg"> e <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq9.jpg"> sono la resistenza valori misurati attraverso la barriera cellulare e <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq10.jpg"> e <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq11.jpg"> sono i valori di resistenza misurati nella canali rettilinei. 16 l'equazione è derivata dal circuito equivalente illustrato nella Figura 2.</li>
	</ol></li> <li>Sottrarre il vuoto TEER da TEER tutti gli intervalli di tempo per ottenere lo sviluppo del TEER in tempo.</li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo manoscritto, sono stati presentati la progettazione di un dispositivo di organo-on-chip e la determinazione diretta della resistenza elettrica transendoteliale (TEER) di una barriera cellulare coltivata nel dispositivo. Il metodo proposto di integrare gli elettrodi senza attrezzature per camere bianche e la determinazione diretta di TEER utilizzando quattro elettrodi è applicabile a qualsiasi dispositivo di organo-on-chip con due scomparti di microfluidica. Il layout a chip e la geometria può essere adattati per soddisfare le esigenze degli esperimenti immaginati, fintanto che i quattro elettrodi sono separati in due scomparti. Quattro elettrodi anche possono essere comodamente inseriti nelle insenature di chip esistenti, purché essi sono fissati in posizione per tutta la durata di sei misurazioni. Il metodo di incollaggio trafilamenti può essere ottimizzato per diverse membrane e canale geometrie modificando il rapporto PDMS/toluene. Un maggiore contenuto di toluene si traduce in uno strato più sottile di spin-rivestito di mortaio26 e potrebbe essere più adatto per canali meno profondi e più stretto nelle parti PDMS. Un risultati di contenuto toluene inferiori in un mortaio più spesso strato26 e potrebbe essere più adatto per racchiudere le membrane più spessore tra le parti PDMS.
Come si può vedere gli spettri di impedenza schematica in Figura 2A e gli spettri sperimentali in Figura 2E e 2F, le misure di impedenza sono influenzate dalla capacità doppio strato all'interfaccia elettrodo-medio. A causa delle piccole dimensioni degli elettrodi all'interno i microcanali, la capacità di doppio strato può dominare sopra l'altopiano resistivo della barriera cellulare negli spettri di impedenza, che complica la quantificazione del TEER. Per ovviare a questo, gli elettrodi possono essere inseriti ulteriori nei canali di cultura prima della fissazione. Ciò consentirà di aumentare la superficie dell'elettrodo esposto al terreno di coltura e con che la capacità di doppio strato aumenterà pure. Ciò provoca uno spostamento del versante capacitivo a frequenze più basse, così che l'altopiano resistivo della barriera cellulare può essere più facilmente riconosciuto e quantificati. Anche se la resistenza del percorso misurata tra due elettrodi diventerà più piccola, questo non influenzerà la quantificazione di TEER seguendo il metodo proposto.
Mentre si misura attraverso la barriera cellulare, è possibile che l'altopiano extra resistivo non può essere riconosciuto. Questo può essere il risultato di una connessione fluidico tra i due canali, ad esempio se la membrana è scarsamente racchiuso dal mortaio, che conduce a un percorso misurato intorno alla barriera cellulare. Inoltre, ci possono essere elettrici bridging fuori il chip se gli elettrodi sono collegati da una goccia di terreno di coltura. Questo è generalmente in combinazione con una bassa impedenza misurata e può essere risolto rimuovendo questo ponte di mezzo di coltura. Infine, se non c'è nessun altopiano resistivo e l'impedenza misurata è ordini di grandezza superiori al previsto, potrebbe esserci un collegamento allentato nel cablaggio elettrico o alla fonte di alimentazione.
In futuro, la rilevanza fisiologica della corrente BBB-on-chip può essere aumentata esponendo le cellule endoteliali per shear stress a livelli fisiologici, che è segnalato per promuovere la tenuta di barriera di differenziazione e aumento BBB ed è difficile da raggiungere nei modelli convenzionali in vitro . 29 il canale inferiore del dispositivo presentato fornisce inoltre un apposito alloggiamento per le cellule di cervello-derivato di co-coltura con l'endotelio. Questo prevede inoltre di aumentare la funzione di barriera ed inoltre permette lo studio delle complesse interazioni tra tipi cellulari rilevanti nelle circostanze patologiche. 29
In conclusione, il dispositivo di organo-on-chip descritto in questa pubblicazione possa essere fabbricato con normale attrezzatura da laboratorio ed è indicato per fornire misurazioni dirette di TEER utilizzando quattro elettrodi integrati che non ostacolino il controllo visivo della cella ha studiata strato. L'applicabilità di questo dispositivo nel campo organi-on-chip è stato dimostrato che imita la BBB in questo chip e monitorando il TEER durante il periodo di coltura. Un host di altri organi (barriera) può essere imitato includendo altri tipi cellulari rilevanti in questo chip. Inoltre, il metodo per la misurazione TEER può essere applicato facilmente in altri due dispositivi di organo-on-chip basati su vano per arrivare a valori TEER riproducibili e significativi che possono essere confrontati su dispositivi e sistemi.

Organi-on-chip sono rapidamente emergendo come una nuova e promettente classe di in vitro modelli di tessuto. 1 in questi modelli, le cellule sono coltivate all'interno di dispositivi microfluidici che sono progettati in modo tale che imitano il microambiente fisiologico di quelle cellule. 1 , 2 il risultato più realistico comportamento fisiologico o patologico di quelle cellule che può essere previsto dai modelli convenzionali in vitro del design semplice e funzione di base. 3 , 5 , 6 inoltre, organi-on-chip forniscono un migliore ambiente controllabile rispetto ai modelli in vivo e può incorporare sia sani che malati dei tessuti di origine umana per replicare fedelmente la patologia e fisiologia umana. I progressi recentemente riassunti nello sviluppo di sangue – cervello barriere su chip (BBBs-on-chip) mostrano che il campo sta rapidamente muovendo in avanti. 7
Un altro vantaggio di organi-on-chip è che essi consentono un monitoraggio in tempo reale e continuo del tessuto coltivato all'interno del dispositivo di microscopia, le analisi biochimiche on-line e sensori integrati. 1 , 2 ad esempio, la misura resistenza elettrica transendoteliale o transepiteliale (TEER) è un metodo potente per il monitoraggio non invasivo lo sviluppo e la rottura della barriera-formando tessuti. 8 , 9 , 10 TEER è la resistenza elettrica attraverso una barriera cellulare ed è quindi indicativo della permeabilità e l'integrità della barriera. 10 in organi-on-chip, barriere cellulari sono generalmente coltivate su una membrana che separa due canali fluidici, che rappresenta l'apicale e basolaterale scomparti di quel tessuto barriera. In questi chip, TEER misurazioni possono essere effettuate comodamente con elettrodi inseriti a Monte e a valle dei due canali. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 tuttavia, inserimento manuale e reinserimento degli elettrodi può facilmente causare errori di posizionamento e quindi variazioni nella resistenza misurata come ad esempio le differenze nella resistenza di percorsi più lunghi o più brevi tramite microcanali sono significative rispetto alla resistenza della barriera delle cellule. 16 per eliminare errori di reinserimento, dispositivi con elettrodi integrati sono stati proposti. Tuttavia, la maggior parte di questi elettrodi integrati blocca la vista quando si ispeziona le colture tissutali17,18,19,20,21 e/o richiedere specializzato Cleanroom processi per la fabbricazione. 17 , 22
Il dispositivo di organo-on-chip descritto in questa pubblicazione, in primo luogo applicata in una precedente pubblicazione,16 combina la stabilità degli elettrodi integrati con visibilità sulla strato delle cellule misurata e montaggio facile. La progettazione e la fabbricazione di questo chip è raffigurato nella Figura 1. In breve, questo dispositivo è costituito da due parti di polidimetilsilossano (PDMS) con impronte di canale che sono legati insieme privo di perdite con una membrana di policarbonato con 0,4 µm pori in mezzo. Quattro elettrodi di platino filo inseriti e fissati in posizione con un fotocurabili adesivo ben di fuori della zona di coltura. Tutti questi passaggi di fabbricazione può essere condotta con apparecchiature di laboratorio generale, senza la necessità di un ambiente di camera bianca. In cima a questo, sei misure di impedenza possono essere fatto utilizzando questi quattro elettrodi, consentendo in tal modo isolamento diretto di TEER misurato, indipendente della resistenza dei microcanali che conduce fino alla sezione trasversale e riducendo al minimo l'influenza di variazioni non biologiche nel sistema come (ri) errori di inserimento. 16
Per mostrare l'applicabilità di questo dispositivo e le misure dirette di TEER, che emato - encefalica (BBB) è stata replicata in questo chip. Questa barriera biologica è costituito da cellule endoteliali specializzate e regola il trasporto tra sangue e cervello per fornire l'omeostasi del cervello. 23 , 24 per simulare la BBB, il canale superiore del dispositivo microfluidico è stato allineato con le cellule endoteliali microvascolari cerebrali umane dalla linea cellulare hCMEC/D3 (gentilmente fornito dal Dr. P.-O. COURAUD, INSERM, Paris, France). 25 il metodo proposto è, tuttavia, più in generale applicabile a qualsiasi dispositivo di organo-on-chip con due scomparti, consentendo la determinazione diretta di TEER facilmente utilizzando integrato elettrodi.
In questo manoscritto, in primo luogo il processo di fabbricazione del dispositivo organo-on-chip con elettrodi integrati è descritto. Avanti, la procedura di semina e la cultura delle cellule endoteliali cerebrali all'interno del dispositivo è spiegato, così come le misure di TEER su chip. Nella sezione risultati, misurazioni rappresentative TEER sono mostrati e trattamento dei dati è chiarito. Infine, la funzione di barriera della BBB-on-chip, monitorato durante 3 giorni, si presenta, mostrando l'applicabilità del dispositivo presentato e metodi per monitorare TEER.

<table><tbody><tr><td><forte>Materiali</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agente base e agente indurente in polidimetilsilossano (PDMS): Sylgard 184 Kit di elastomeri siliconici</td><td>Dow Corning</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Magic tape</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punzone per biopsia, diametro 1,0 mm</td> Membrana in policarbonato <td>Integra Miltex</td><td>33-31AA-P/25</td><td></td></tr><tr><td>, 0,4 &; m dimensione dei pori</td><td>Corning</td><td>3401</td><td>Tagliato da inserti di coltura Transwell</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>filo di platino, 200 & micro; m diametro</td><td>Alfa Aesar</td><td>10287</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo polimerizzabile UV: Norland Optical Adhesive 81</td><td>Norland Products</td><td>NOA 81</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo epossidico: Loctite M-31 CL Hysol</td><td>Henkel</td><td>30673</td><td></td></tr><tr><td>cellule</td><td></td><td></td> hCMEC/D3 <td>Linea cellulare endoteliale microvascolare cerebrale umana, gentilmente fornita dal Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Parigi, Francia</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina plasmatica umana, 20 &; g/ml</td><td>Gibco</td><td>33016015</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di crescita endoteliale-2 (EGM-2)</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>Terreno basale endoteliale-2 (EBM-2) integrato con EGM-2 SingleQuots</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA, 0,05%</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda </td><td>Numero catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td>Binder</td><td>9010-0190</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater: Spin 150</td><td>Polos</td><td>SPIN150-NPP</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente di luce UV, 365 nm per 5 s a 350 mW/cm2</td><td>Prodotto internamente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga: Allegra X-12R Centrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Binder</td><td>CB E2 150</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore Boxense</td><td>LocSense</td><td></td><td>Lock-in con circuito del cavo della sonda, specializzato per misure TEER su chip</td></tr></tbody></table>

fabbricazione e validazione di un sistema di organo-on-chip con elettrodi integrati direttamente quantificare transendoteliale resistenza elettrica

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organi-on-chip, in vitro modelli che coinvolgono la cultura dei tessuti (umani) all'interno di dispositivi microfluidici, sono rapidamente emergenti e promessa di fornire utili strumenti di ricerca per lo studio della malattia e della salute umana. Per caratterizzare la funzione di barriera di strati di cellule coltivate all'interno di dispositivi organo-on-chip, è misurata spesso transendoteliale o transepiteliale resistenza elettrica (TEER). A tal fine, gli elettrodi sono solitamente integrati il chip microlavorazioni metodi per fornire misure più stabile che si ottiene con inserimento manuale degli elettrodi nelle insenature del chip. Tuttavia, questi elettrodi frequentemente ostacolano ispezione visiva dello strato delle cellule studiate o richiedono cleanroom costosi processi di fabbricazione. Per superare questi limiti, il dispositivo descritto qui contiene quattro elettrodi facilmente integrati che vengono inseriti e fissati all'esterno dell'area di cultura, rendendo possibile il controllo visivo. Utilizzando questi quattro elettrodi che la resistenza dei sei percorsi di misurazione può essere quantificata, da cui il TEER può essere direttamente isolato, indipendente della resistenza dei microcanali riempiti di terreno di coltura. La barriera emato - encefalica è stata replicata a questo dispositivo e sua TEER è stato monitorato per mostrare l'applicabilità del dispositivo. Questo chip, gli elettrodi integrati e il metodo di determinazione di TEER sono generalmente applicabili in organi-on-chip, sia per imitare altri organi o per essere incorporati nei sistemi esistenti di organo-on-chip.

I risultati schematici di spettroscopia di impedenza elettrica attraverso un chip senza cellule (linea continua) e attraverso una barriera cellulare (linea tratteggiata) sono mostrati nella Figura 2A. Possono essere identificate quattro principali regioni, ciascuna dominata da un componente elettrico specifico. Sotto circa 1 kHz, la capacità di doppio strato all'interfaccia elettrodo-cultura media dominante, caratterizzata da una pendenza negativa per grandezza di impedenza e di sfasamento si avvicina-90 °. La frequenza in cui domina la capacitanza di doppio strato, dipende dalla zona dell'elettrodo esposta al mezzo di coltura. Il resistivo altopiano sopra 1 (senza cellule) o 100 kHz (con cellule) con uno spostamento di fase vicina a 0 °, corrisponde alla resistenza del terreno di coltura all'interno dei canali microfluidici, a seconda della lunghezza del canale e area della sezione trasversale e dentro il membrana, a seconda della porosità e spessore. Quando si misura attraverso una barriera cellulare, un altopiano extra resistivo tra 1 e 10 kHz è visto così come un massimo locale del diagramma di fase. Questa regione è di importanza critica per la determinazione della TEER come un chiaro aumento nei risultati di impedenza quando le cellule sono presenti nel percorso misurato e viene pertanto definite la "regione di interesse". Il pendio supplementare tra 10 e 100 kHz corrisponde la capacità della barriera delle cellule, che nasce dalle membrane bilayer del lipido elettricamente isolante e dipende l'area totale dello strato delle cellule. 27 i confini di queste regioni, come pure le magnitudini di impedenza dipendono dal sistema in fase di studio e modificare con, tra l'altro, dimensioni canale, conducibilità del terreno di coltura, posizionamento degli elettrodi e tipo delle cellule. Per ulteriori approfondimenti sulla teoria e la pratica di spettroscopia di impedenza elettrica su barriera-formando tessuti consiglia l'articolo di recensione di Benson et al . 28
Dati rappresentativi delle misurazioni TEER sono indicati per un chip vuoto sia un chip con uno strato di cellule endoteliali hCMEC/D3 cervello in Figura 2E e 2F, rispettivamente. In breve, la spettroscopia di impedenza è stata effettuata usando sei misurazioni con quattro elettrodi: due misurazioni attraverso canali riempiti di terreno di coltura delle cellule (linee continue) e quattro misurazioni attraverso i canali così come la membrana e - se presente - il barriera cellulare (linee tratteggiate). Questi percorsi di sei misura possono essere identificati nel circuito resistivo equivalente di Figura 2B, che è derivato dalla sezione trasversale schematica (Figura 2) e vista dall'alto (Figura 2D). Le misurazioni di chip vuoto (Figura 2E) mostrano la tipica forma degli spettri di impedenza senza cellule, come illustrato nella Figura 2A. Le misurazioni attraverso la barriera cellulare (linee tratteggiate in Figura 2F) ricordano gli spettri di impedenza tipica con le cellule nella Figura 2A. Nota che sia la grandezza di impedenza e la fase di spostamento aumento verso 1 MHz. Questa è la risposta tipica del setup di misura alle alte frequenze e non è di origine sperimentale.
Per determinare la TEER utilizzando questi spettri di impedenza sperimentale, in primo luogo la resistenza chip misurate è determinata, che è la resistenza totale di cella layer, canali e membrana. A tal fine, è stata scelta una frequenza di lettura adatto nella regione di interesse, che è al massimo locale nella fase trama con cellule, nei pressi di spostamento di fase di 0 ° senza cellule: 10 kHz. Con le sei resistenze misurate a 10 kHz, misurata tra i quattro elettrodi, il TEER è direttamente calcolata usando l'equazione Figura 2F.
Per indicare che il dispositivo presentato è adatto a determinare TEER in organi-on-chip, la BBB è stata replicata all'interno del chip e sua TEER è stato monitorato durante 3 giorni di cultura. In Figura 3A che media TEER ± errore standard della media (SEM) è indicato per quattro BBBs-on-chip, risultante in un altopiano di 22 ± 1,3 Ω cm2, che è paragonabile a TEER di questa linea cellulare come riportato in letteratura. 29 inoltre, dopo la cessazione dell'esperimento e fluorescenza la macchiatura dei nuclei, si vede che l'endotelio cerebrale formata un monostrato continuo all'interno del dispositivo (Figura 3B). Colorazione di immunofluorescenza della proteina di giunzione stretta Zonula Occludens-1 (ZO-1) ha mostrato che le cellule endoteliali cerebrali mantenuto loro fenotipo specifico BBB e formano complessi giunzionali stretti.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56334/56334fig1.jpg"> 
Figura 1: Progettazione e assemblaggio del dispositivo organo-on-chip con elettrodi integrati. 
(A) vista esplosa del chip microfluidici, costituito da una parte superiore di PDMS con canale superiore (TC), una membrana (M) e un fondo parte PDMS con il canale inferiore (BC). Quattro elettrodi filo di platino (E1-4) inseriti e fissati nei canali laterali. Nel canale superiore e sulla parte superiore della membrana, le cellule endoteliali del cervello hCMEC/D3 sono state coltivate per replicare la BBB. (B) assemblati chip, fissato ad un piatto di plastica. Ristampato e adattato con permesso da Elsevier. 16 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56334/56334fig2.jpg"> 
Figura 2: Dati di impedenza rappresentativo e determinazione di TEER. 
(A) impedenza schematica dello spettro visualizzando impedenza grandezza (Ω) e sfasamento (°) vs frequenza (Hz), tipico per la spettroscopia di impedenza elettrica sui chip senza cellule (linea continua) e con le cellule (linea tratteggiata). Ci sono quattro principali regioni, ciascuna dominata da: la capacità di doppio strato presso gli elettrodi, la resistenza del terreno di coltura, la resistenza di barriera delle cellule e la capacità della membrana cellulare. La "regione di interesse" indica dove il contributo dello strato delle cellule possa essere quantificata (freccia rossa). (B) circuito resistivo equivalente del chip, mostrando il canale superiore resistenze R1 e R3, il fondo canale resistori R2 e R4 e la membrana e CE barriera resistore Rm. (C) sezione trasversale schematica mostrando le cellule endoteliali (CE) coltivate in canale superiore. (D) vista schematica superiore della BBB chip mostrando la configurazione degli elettrodi e la zona di coltura di 0,25 mm2 attraverso il quale l'impedenza è misurata. (E) spettri di impedenza rappresentativo di un chip vuoto riempito con terreno di coltura cellulare. (F) tra gli spettri di impedenza rappresentativo di un chip in cui hCMEC/D3 cervello cellule endoteliali erano coltura per 3 giorni. (G) Formula per calcolare TEER dalle resistenze misurate tra tutte le sei combinazioni di quattro elettrodi. Ristampato e adattato con permesso da Elsevier. 16 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334fig2large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare un vers più grandi</a>ione di questa figura.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56334/56334fig3.jpg"> 
Figura 3: Sviluppo di TEER rappresentativo di BBB-on-chip. 
(A) TEER media ± errore standard della media (SEM) dei quattro BBBs-on-chip durante un periodo di cultura di tre giorni, raggiungendo un plateau a 22 ± 1,3 Ω cm2 (media ± SEM). Per confronto, dati di chip vuoto sono inclusi, mostrando variazione marginale e deviazione da 0 Ω cm2 nello stesso periodo rispetto alla variazione e il valore delle chip TEER alle cellule. (B) microscopia di fluorescenza dei nuclei macchiati ha rivelato un continuo monostrato di endotelio, sia il PDMS e la membrana nella posizione indicata nella rientranza. (C) l'immunofluorescenza ha rivelato la presenza di proteina di giunzione stretta Zonula Occludens-1, che indica che il giunzioni strette BBB-specifiche tra le cellule danno luogo al TEER misurato. Ristampato e adattato con permesso da Elsevier. 16 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questa pubblicazione descrive la realizzazione di un dispositivo di organo-on-chip con elettrodi integrati per quantificazione diretta della resistenza elettrica transendoteliale (TEER). Per la convalida, la barriera emato - encefalica è stata imitata all'interno di questo dispositivo microfluidico e sua funzione di barriera è stata controllata. I metodi presentati per integrazione di elettrodo e diretto TEER quantificazione sono generalmente applicabili.

Fabbricazione e validazione di un sistema di organo-on-chip con elettrodi integrati direttamente quantificare transendoteliale resistenza elettrica

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

L'obiettivo generale di questo video è mostrare come fabbricare e utilizzare chip microfluidici con elettrodi integrati per misure di resistenza elettrica transendoteliale o transepiteliale, o misure TEER. Ciò è dimostrato utilizzando una barriera emato-encefalica nel chip microfluidico. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo degli Organs-on-Chip, consentendo la misurazione diretta della funzione di barriera, ad esempio, del tessuto barriera emato-encefalico utilizzando elettrodi integrati.Il vantaggio principale della nostra tecnica è che gli elettrodi sono facilmente integrati nei sistemi Organ-on-Chip e che i risultati di questo possono essere confrontati tra i diversi sistemi. Le implicazioni di questa tecnologia si estendono alla comprensione della funzione della barriera emato-encefalica in salute e malattia, alla scoperta di farmaci e alla medicina personalizzata. Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per fornire informazioni sulla funzione della barriera emato-encefalica, può anche essere utilizzato nel contesto di altri sistemi Organ-on-Chip come il Lung-on-Chip e il Gut-on-Chip.Per iniziare questa procedura, mescolare accuratamente 27 grammi di agente base PDMS e 2,7 grammi di agente indurente. Quindi degassare la miscela in un essiccatore per circa 45 minuti per rimuovere le bolle d'aria. Nel frattempo, preparare lo stampo per la miscela PDMS liquida attaccando del nastro adesivo trasparente attorno allo stampo, oppure posizionare lo stampo in un apposito supporto per wafer.Versare la miscela PDMS degassata sullo stampo. Quindi, polimerizzare la miscela PDMS in forno a 60 gradi Celsius per quattro ore e lasciarla raffreddare in seguito. In una cappa a flusso incrociato, estrarre il PDMS polimerizzato dallo stampo.Tagliare la replica del PDMS in parti separate del chip superiore e inferiore utilizzando le linee di taglio nel PDMS. Successivamente, praticare quattro fori nelle parti superiori utilizzando un punzone per biopsia affilato con un diametro di un millimetro per formare ingressi e uscite. Perforare dall'interno verso l'esterno per evitare che i detriti del PDMS si accumulino nel chip.Quindi, coprire le parti del chip con del nastro adesivo trasparente per proteggerle dalla polvere. Successivamente, tagliare le membrane in policarbonato dagli inserti del transwell in quadrati di circa tre per tre millimetri quadrati. Successivamente, assemblare una membrana porosa priva di perdite tra due parti PDMS per assemblare un dispositivo a due strati interfacciato con una membrana porosa.A tal fine, preparare una malta di toluene PDMS utilizzando 0,7 grammi di agente base PDMS, 07 grammi di agente indurente e 540 microlitri di toluene. Agitare accuratamente la malta, quindi ricoprire 200 microlitri di malta su un vetrino coprioggetti a 1500 giri/min per 60 secondi per acquisire uno strato sottile e uniforme di malta. Quindi trasferisci un sottile strato di malta dal vetrino coprioggetti sulla parte inferiore del chip con un rullo inchiostratore.Mettere la parte inferiore in una pirofila da forno e poi trasferire il mortaio sulla parte superiore della patatina. Con una serie di pinzette, immergi i bordi di una membrana nella malta filata e posizionala con cura al centro della parte inferiore. Successivamente, posizionare con cura la parte superiore sulla parte inferiore prestando attenzione all'allineamento.Copri gli ingressi dei trucioli con del nastro adesivo trasparente per evitare che la polvere entri nel truciolo e cuocili a 60 gradi Celsius per tre ore. Fare attenzione è molto importante in questo passaggio. Non esercitare pressione sul truciolo e non far scorrere la parte superiore sulla parte inferiore, per evitare che la malta entri nei canali e ostruisca la membrana.Per integrare gli elettrodi nei canali laterali, tagliare un filo di platino in pezzi lunghi due centimetri. Quindi, immergili nell'acetone per 30 minuti. Quindi sciacquateli con acqua ed etanolo e lasciateli asciugare.In una cappa a flusso incrociato, metti un chip su un piatto di plastica. Inserisci quattro fili di platino nei canali degli elettrodi del chip usando un paio di pinzette e piegali verso il basso sulla piastra di plastica per consentire il fissaggio alla piastra nel passaggio successivo. Inserire i fili da 0,7 a un millimetro nel canale di coltura oltre la giunzione del canale a forma di T.Successivamente, applicare una goccia di colla polimerizzabile ai raggi UV all'ingresso del canale dell'elettrodo e lasciare che la colla riempia il canale con forze capillari. Quindi, accendi l'UV e polimerizza la colla quando raggiunge la fine del canale dell'elettrodo. Fissato i quattro elettrodi integrati alla piastra di plastica con un adesivo epossidico bicomponente.Successivamente, coprite le patatine con del nastro adesivo trasparente e cuocetele a 60 gradi Celsius per due ore. Lasciarli raffreddare e conservarli senza polvere fino al momento dell'uso. Per rivestire i chip e favorire l'adesione delle cellule, riempire entrambi i canali con PBS prima di introdurre i reagenti.Controllare al microscopio se ci sono bolle d'aria nei canali. In tal caso, rimuovili sciacquandoli con PBS extra. Successivamente, riempire entrambi i canali con 30 microlitri di 20 microgrammi per millilitro di fibronectina umana in PBS.Incubarli a 37 gradi Celsius per tre ore. Quindi sciacquare le patatine con un terreno di coltura endoteliale e incubarle a 37 gradi Celsius per due ore. Successivamente, misurare il TEER dei chip bianchi per assicurarsi che tutti gli elettrodi siano a diretto contatto con il fluido nei canali.Per fare ciò, prendi un chip dall'incubatrice e lascialo raggiungere la temperatura ambiente per almeno dieci minuti. Rimuovere il liquido dalla piastra di plastica attorno agli elettrodi per evitare la formazione di ponti elettrolitici all'esterno del chip. Quindi, prendi lo spettro di impedenza da 200 hertz a un megahertz per ogni combinazione di due elettrodi, ottenendo sei spettri di impedenza per chip in cinque-dieci minuti, da cui è possibile determinare direttamente il TEER.Verificare se gli spettri di impedenza hanno le grandezze e le forme previste per convalidare la misurazione TEER. A questo punto, preparare una sospensione cellulare da inserire nel canale superiore rimuovendo il terreno di coltura da un pallone di coltura con monostrato confluente di cellule hcMEC/D3. Successivamente, lavare le celle con PBS.Rimuovere il PBS e quindi aggiungere due millilitri di tripsina EDTA allo 05% e incubare a 37 gradi Celsius per due-cinque minuti fino a quando le cellule non si sono staccate dal pallone di coltura. Quindi, disattivare la tripsina con terreno di coltura integrato con il 20% di FBS. Conta le celle e calcola il loro numero totale in sospensione.Nel frattempo, centrifugare le cellule hcMEC/D3 a 390 volte g per cinque minuti. Successivamente, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare nel volume appropriato di terreno di crescita endoteliale per ottenere una concentrazione di cinque milioni di cellule per millilitro corrispondente a una densità di semina di 200 mila cellule per centimetro quadrato nel chip. Quindi, pipettare lentamente 30 microlitri della sospensione cellulare ben miscelata nel canale superiore e rimuovere la pipetta dall'ingresso con un movimento fluido pur continuando a esercitare pressione.Controllare la densità di semina al microscopio. Dovrebbe essere ottenuta una distribuzione uniforme delle cellule in tutto il canale superiore. Quindi incubare le patatine a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica per almeno un'ora.Successivamente, sciacquare tutte le cellule non attaccate con terreno di coltura endoteliale. Tenere presente che il TEER viene monitorato durante il periodo di coltura. Questi sono i tipici intervalli di impedenza schematica che mostrano l'ampiezza dell'impedenza e lo sfasamento rispetto alla frequenza per la spettroscopia di impedenza elettrica su chip senza celle e con celle.Ci sono quattro regioni principali che sono dominate dalla capacità a doppio strato sugli elettrodi, dalla resistenza del mezzo di coltura, dalla resistenza della barriera cellulare o dalla capacità della membrana cellulare. La regione di interesse indica dove può essere quantificato il contributo dello strato cellulare. E questa è la formula per calcolare il TEER dalle resistenze misurate tra tutte e sei le combinazioni di quattro elettrodi.Qui è mostrato il TEER medio di quattro BBB sui chip durante il periodo di coltura di tre giorni, raggiungendo un plateau di 22 più o meno 1,3 ohm centimetro quadrato. Per confronto, sono inclusi i dati dei chip vuoti, che mostrano la variazione marginale e la deviazione dal centimetro quadrato di zero ohm nello stesso periodo rispetto alla variazione del valore TEER dei chip con celle. La microscopia a fluorescenza dei nuclei colorati ha rivelato un monostrato continuo di endotelio sia sul PDMS che sulla membrana nella posizione indicata nel riquadro.L'immunofluorescenza ha rivelato la presenza di una proteina a giunzione stretta zonula occludens, indicando che le giunzioni strette specifiche per la BBB tra le cellule danno origine al TEER misurato. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione della fabbricazione e dell'uso di chip con elettrodi integrati per le misure TEER in Organs-on-Chips. Questa tecnica può essere utilizzata nel campo della ricerca sulla barriera emato-encefalica per studiare la somministrazione diretta e le caratteristiche della malattia, ad esempio, nel morbo di Alzheimer.Seguendo questa procedura, la funzione di barriera dell'endotelio cerebrale differenziato dalle cellule staminali pluripotenti indotte di origine umana può anche essere monitorata per applicazioni nella medicina personalizzata.

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Questo video mostra un metodo per valutare la resistenza elettrica transendoteliale (TEER) nelle cellule endoteliali microvascolari cerebrali di topo in vitro. Un valore TEER elevato indica giunzioni di cellule endoteliali intatte, mentre l'aggiunta di cellule T attivate abbassa il valore TEER, riflettendo la rottura della barriera giunzionale.

Valutazione della resistenza elettrica transendoteliale in un modello di barriera emato-encefalica in vitro

Il Transistor elettrochimica organica è integrato con cellule vive e utilizzato per monitorare il flusso di ioni attraverso la barriera epiteliale intestinale. In questo studio, un aumento di flusso di ioni, correlate a rottura di giunzioni strette, indotta dalla presenza del chelante calcio EGTA (etilenglicole-bis (beta-amminoetil etere)-N, N, N ', N'-tetra acetico acido), viene misurata.

Rilevamento di Barriera tessuto Turbativa con una Transistor elettrochimica biologico

Qui, presentiamo un protocollo che descrive la fabbricazione di estensibile, bicanale, dispositivi organo chip microfluidici cella cultura per ricapitolare la funzionalità a livello dell'organo in vitro.

Fabbricazione scalabile di Stretchable, Dual Channel, organo di Microfluidic chip

Qui, dimostriamo come impostare un mitemetro a volt poco costoso con frequenza di uscita programmabile che può essere utilizzato con elettrodi bacchette disponibili in commercio per misurazioni transepiteliali/endoteliali di resistenza elettrica.

Un approccio semplice per eseguire misurazioni TEER utilizzando un Amperemetro Volt-Amperemeter self-made con frequenza di uscita programmabile

La barriera emato-encefalica (BBB) è un'unità neurovascolare multicellulare che regola strettamente l'omeostasi cerebrale. Combinando gli iPSC umani e le tecnologie organ-on-chip, abbiamo generato un chip BBB personalizzato, adatto per la modellazione delle malattie e le previsioni di penetrazione dei farmaci del SNC. Viene descritto un protocollo dettagliato per la generazione e il funzionamento del chip BBB.

Generazione di un chip di barriera emato-encefalica basata sull'iPSC umano

Questo protocollo descrive le tecniche di microfabbricazione necessarie per costruire un dispositivo di elettroporazione microfluidica lab-on-a-chip. La configurazione sperimentale esegue trasfezioni controllate a livello di singola cellula in un flusso continuo e può essere estesa a portate più elevate con controllo basato sulla popolazione. Viene fornita un'analisi che mostra la capacità di monitorare elettricamente il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare in tempo reale.

La fabbricazione e il funzionamento di un sistema di micro-elettroporazione a flusso continuo con rilevamento di permeabilizzazione

Gli organoidi intestinali derivati dalla biopsia e le tecnologie organ-on-a-chips sono combinati in una piattaforma microfisiologica per ricapitolare la funzionalità intestinale specifica della regione.

Combinazione di organoidi umani e tecnologia Organ-on-a-Chip per modellare la funzionalità specifica della regione intestinale

L'integrazione di organoidi intestinali canini e di un sistema microfluidico Gut-on-a-Chip offre modelli traslazionali rilevanti per le malattie intestinali umane. I protocolli presentati consentono la morfogenesi 3D e la modellazione dinamica in vitro dell'intestino, aiutando nello sviluppo di trattamenti efficaci per le malattie intestinali nei cani e negli esseri umani con One Health.

Morfogenesi tridimensionale nell'intestino su chip canino utilizzando organoidi intestinali derivati da pazienti con malattie infiammatorie intestinali

Questo studio delinea un protocollo per la generazione di monostrati 2D di organoidi suini derivati dall'intestino tenue e crasso. La crescita di questi monostrati è contrassegnata da valori TEER crescenti, che indicano una robusta integrità epiteliale. Inoltre, questi monostrati mostrano risposte secretorie fisiologiche negli esperimenti della camera di Ussing dopo l'applicazione della forskolina.

Organoidi intestinali suini bidimensionali che riflettono le proprietà fisiologiche dell'intestino nativo

Qui, presentiamo un protocollo per fabbricare un dispositivo microfluidico a due strati unico per studiare la regolazione elettromeccanica dell'omeostasi del tessuto epiteliale. Il dispositivo applica correnti elettriche fisiologiche statiche perpendicolari al piano del tessuto, influenzando l'adesione, la proliferazione e l'estrusione cellula-cellula. L'imaging su cellule vive e le misurazioni dello stress meccanico rivelano i meccanismi di questi processi.

Rivelazione del controllo elettromeccanico dell'omeostasi tissutale utilizzando un dispositivo microfluidico a due strati

Scopri come fabbricare un sistema organ-on-chip con elettrodi integrati per misurare direttamente la resistenza elettrica transendoteliale (TEER). Questo metodo consente di studiare la funzione della barriera ematoencefalica in tempo reale.

Fabbricazione e validazione di un sistema di organo-on-chip con elettrodi integrati direttamente quantificare transendoteliale resistenza elettrica (Video) | JoVE Journal

Fabbricazione e validazione di un sistema di organo-on-chip con elettrodi integrati direttamente quantificare transendoteliale resistenza elettrica

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