Rilevazione di mutazioni Rare in CtDNA mediante sequenziamento di nuova generazione
24 agosto 2017
Questo manoscritto descrive una tecnica per la rilevazione di mutazioni di bassa frequenza in ctDNA, ER-segg. Questo metodo si differenzia per il suo uso unico di correzione degli errori di bi-direzionale, un fondo speciale filtro ed efficiente acquisizione molecolare.
L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di rilevare mutazioni di bassa frequenza nel tumore circolante o nel ctDNA per fornire ai medici clinici un potente strumento per diagnosticare i tumori e monitorare la dinamica del tumore in risposta alla terapia. Il metodo di test del ctDNA può aiutare a rispondere a domande chiave sui tipi di mutazioni di cui un paziente è portatore, come la variazione di un singolo tipo nucleare, la delezione dell'inserzione, la variazione del numero di copie e la variazione strutturale. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'elevata sensibilità e specificità che consente di rilevare con precisione le mutazioni a bassa frequenza nel ctDNA.
A dimostrare le procedure sarà Yuliang Yang, un tecnico del mio laboratorio. Per iniziare, prelevare 10 millilitri di sangue periferico in una provetta di raccolta e capovolgere delicatamente la provetta su e giù da sei a otto volte per mescolare il contenuto. Conservare i campioni di sangue nelle provette di raccolta a una temperatura compresa tra sei e 37 gradi Celsius per un massimo di 72 ore.
Centrifugare la provetta di raccolta a 1,600 volte g a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi utilizzare una pipetta per lo smaltimento per trasferire il surnatante o il plasma dalla provetta a quattro provette da centrifuga pulite da due millilitri adeguatamente etichettate senza disturbare il pellet. Utilizzare una pipetta per lo smaltimento pulita per trasferire un millilitro di cellule in una provetta da centrifuga da due millilitri adeguatamente etichettata.
Conservare le cellule a meno 20 gradi Celsius o più freddi prima dell'isolamento genomico o del gDNA. Quindi, centrifugare il plasma a 1.600 volte g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Quindi trasferire il plasma in provette da centrifuga pulite correttamente etichettate come plasma, lasciando circa 0,1 millilitri di volume residuo sul fondo per evitare contaminazioni.
Il buffy coat deve essere evitato dal plasma durante il processo di separazione. In caso contrario, grandi frammenti di DNA estratti dalle cellule potrebbero diluire il ctDNA e influenzare la sensibilità del test. Utilizzando un kit disponibile in commercio, isolare il cfDNA da tre millilitri di plasma raccolto seguendo le istruzioni del produttore.
Quindi, sempre con un kit, isolare il gDNA da 200 microlitri di globuli bianchi seguendo le istruzioni del produttore. Per frammentare il campione di controllo del gDNA mediante sonicazione, preparare un microgrammo di campione di gDNA in 100 microlitri di tampone Tris-EDTA in una provetta di sonicazione pulita. Impostare il programma di sonicazione su 30 secondi di accensione e 30 secondi di spegnimento per 12 cicli per un totale di 12 minuti.
Dopo aver confermato che il prodotto contiene da 200 a 250 frammenti di coppie di basi, trasferire tutti i prodotti di frammentazione in una nuova provetta da 1,5 millilitri contenente 150 microlitri di microsfere magnetiche e incubare il campione per cinque minuti per selezionare i frammenti corretti. Quindi, posizionare la provetta su una griglia magnetica per 30 secondi e rimuovere il surnatante. Quindi, tenendo il tubo sulla griglia, aggiungere 200 microlitri di etanolo all'80% appena preparato per lavare le perline.
Incubare le perle per 30 secondi prima di rimuovere il surnatante e ripetere il lavaggio. Tenere il tubo sulla griglia con il coperchio aperto per asciugare le perline all'aria. Quindi eluire i frammenti di DNA aggiungendo 32 microlitri di Tris-HCL da 10 millimolari alle perle.
Per eseguire la reazione di preparazione finale seguendo le istruzioni del produttore, in una provetta sterile priva di nucleasi, aggiungere sette microlitri di tampone di reazione, tre microlitri della miscela enzimatica, 30 nanogrammi di cfDNA e acqua distillata due volte per un volume totale di 60 microlitri. In una provetta separata, aggiungere gli stessi componenti ma con un microgrammo di gDNA invece di cfDNA. Incubare la miscela in un termociclatore a 20 gradi Celsius per 30 minuti seguiti da 65 gradi Celsius per 30 minuti senza il coperchio riscaldato.
Subito dopo l'incubazione, aggiungere alla provetta 30 microlitri della miscela master di legatura, un microlitro di potenziatore di legatura e quattro microlitri dell'esclusivo adattatore di sequenziamento. Incubare la reazione nel termociclatore a 20 gradi Celsius per 15 minuti senza che il coperchio sia riscaldato. Vortice per risospendere le perle magnetiche e lasciare le perle a temperatura ambiente per almeno 30 minuti.
Quindi aggiungere 87 microlitri di perle magnetiche risospese alla reazione di legatura. Mescolare bene pipettando su e giù e quindi incubare il campione a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo il lavaggio e l'asciugatura all'aria delle perle, eluire il bersaglio del DNA dalle perle aggiungendo 20 microlitri di Tris-HCL da 10 millimolari.
Aggiungere 20 microlitri di frammenti di DNA legati con adattatore, cinque microlitri di primer indice i7, 25 microlitri di master mix di amplificazione della libreria e acqua distillata due volte fino a un volume totale di 50 microlitri. La PCR amplifica il cfDNA o gDNA legato all'adattatore. Quindi aggiungere 45 microlitri di microsfere magnetiche sospese al DNA arricchito con PCR.
Miscelare il campione pipettandolo su e giù e incubarlo per cinque minuti. Dopo aver rimosso il surnatante e lavato le perle, utilizzare 30 microlitri di Tris-HCL da 10 millimolari per eluire i frammenti di DNA con gli adattatori. Per effettuare la cattura mirata del DNA, in una provetta sterile, bloccare il campione aggiungendo 1,5 microgrammi di librerie di pooling, otto microlitri ciascuno di blocco P5 100P e blocco P7 100P e cinque microlitri di un microgrammo per microlitro di un DNA.
Asciugare il contenuto della provetta utilizzando un concentratore sottovuoto impostato a 60 gradi Celsius. Ibridare le sonde di cattura del DNA con la libreria aggiungendo 8,5 microlitri di tampone di ibridazione 2X, 2,7 microlitri di potenziatore di ibridazione e 1,8 microlitri di acqua doppiamente distillata priva di nucleasi. Miscelare pipettando su e giù e incubare nel miscelatore termico a 95 gradi Celsius per 10 minuti.
Quindi aggiungere immediatamente quattro microlitri della sonda personalizzata. Incubare i campioni in un miscelatore termico a 65 gradi Celsius con il coperchio riscaldato a 75 gradi Celsius per quattro ore. Incubare il DNA bersaglio ibridato con perle di streptavidina, quindi lavare le perle per rimuovere il DNA non legato.
Utilizzare il kit commerciale secondo le istruzioni del produttore per ottenere gli ultimi 20 microlitri di perle risospese con frammenti di DNA catturati. La fase di lavaggio del DNA non legato dalle perle di streptavidina dovrebbe essere rapida. In caso contrario, l'efficienza di cattura del DNA bersaglio potrebbe essere compromessa.
Amplificare i frammenti di DNA catturati eseguendo la PCR utilizzando un kit commerciale con due oligonucleotidi micromolari della spina dorsale secondo le istruzioni del produttore. Infine, aggiungere 45 microlitri di perle sospese direttamente al prodotto PCR e arricchire i frammenti di DNA bersaglio amplificati legati alle perle mediante eluizione con 30 microlitri di Tris-HCL da 10 millimolari. Quantificare i frammenti ed eseguire il sequenziamento e l'analisi dei dati secondo il protocollo di testo.
Questa tabella illustra come ER-seq migliori la profondità di copertura del 23% rispetto al metodo tradizionale. Ciò è dovuto al suo efficiente recupero delle molecole di cfDNA, migliorando così notevolmente l'analisi delle mutazioni rare. È anche chiaro che gli esclusivi adattatori di sequenziamento utilizzati nell'ER-seq consentono una facile differenziazione delle duplicazioni naturali e indotte dalla PCR.
Come dettagliato in questa tabella sui risultati delle chiamate, l'analisi basata su ER-seq era coerente al 100% per il rilevamento di EGFR pL858R e la frequenza di rilevamento era leggermente più alta rispetto a un'analisi tradizionale. È importante sottolineare che l'analisi ER-seq ha permesso il rilevamento di altre mutazioni a frequenza relativamente bassa, tra cui l'EGFR pT790M, che non è stato riconosciuto dall'analisi tradizionale a causa dell'elevato rumore di fondo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 48 ore se eseguita correttamente.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di evitare la perdita di una quantità molto bassa di cfDNA durante l'estrazione, la preparazione della libreria e il lavaggio delle microsfere dopo l'ibridazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come il ctDNA del paziente è stato raccolto, preparato e mirato in base all'unico identificato per il sequenziamento. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biopsia liquida per esplorare pratiche migliori nel prendere decisioni cliniche.
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Panoramica
Questo manoscritto descrive una tecnica per il rilevamento di mutazioni a bassa frequenza nel DNA tumorale circolante (ctDNA) nota come ER-Seq. Questo metodo si caratterizza per la sua unica correzione dell'errore bidirezionale e per l'elevata sensibilità e specificità nel rilevamento preciso delle mutazioni.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Oncoologia
- Genomica
- Diagnostica clinica
Sfondo
- Il DNA tumorale circolante (ctDNA) è un biomarcatore prezioso per la diagnosi e il monitoraggio del cancro.
- Il rilevamento di mutazioni a bassa frequenza può fornire informazioni sulle dinamiche tumorali.
- I metodi attuali potrebbero non avere la sensibilità necessaria per un rilevamento preciso.
- ER-Seq mira a superare queste limitazioni mediante tecniche avanzate di correzione degli errori.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per rilevare mutazioni a bassa frequenza nel ctDNA.
- Fornire ai clinici uno strumento per la diagnosi dei tumori e il monitoraggio della risposta al trattamento.
- Migliorare la comprensione dei tipi di mutazione presenti nei pazienti.
Metodi Utilizzati
- I campioni di sangue vengono prelevati e mescolati in provette di raccolta.
- I campioni vengono conservati a temperature controllate per un massimo di 72 ore.
- Viene applicata una correzione dell'errore bidirezionale durante l'analisi.
- Viene utilizzato un filtro speciale per lo sfondo per migliorare l'accuratezza del rilevamento.
Risultati principali
- Sono stati raggiunti un'elevata sensibilità e specificità nella rilevazione delle mutazioni.
- Il metodo ha identificato con successo diversi tipi di mutazioni, inclusi le variazioni del singolo nucleotide e le variazioni strutturali.
- ER-Seq ha dimostrato il suo potenziale come strumento affidabile per l'uso clinico.
- Le procedure sono state efficacemente dimostrate da un tecnico di laboratorio.
Conclusioni
- ER-Seq rappresenta un notevole progresso nella rilevazione delle mutazioni del ctDNA.
- Questa tecnica può supportare il processo decisionale clinico nel trattamento del cancro.
- Sono necessarie ulteriori validazioni e applicazioni in contesti clinici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Il rilevamento di mutazioni rare nel DNA tumorale circolante (ctDNA) è fondamentale per la diagnosi precoce del cancro, il monitoraggio della risposta al trattamento e l'identificazione dei meccanismi di resistenza. Il metodo ER-Seq aumenta sensibilità e specificità grazie alla correzione bidirezionale degli errori e all'arricchimento mirato, consentendo un rilevamento affidabile di varianti a bassa frequenza. Questo approccio sostiene la presa di decisioni precliniche e cliniche migliorando l'affidabilità predittiva delle applicazioni della biopsia liquida nello sviluppo di farmaci oncologici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dell'eterogeneità tumorale rilevando mutazioni a bassa frequenza che potrebbero determinare resistenza terapeutica.
- Valore operativo: Fornisce un flusso di lavoro riproducibile per l'estrazione del ctDNA, la preparazione della libreria e l'arricchimento mirato mediante sonde di 1021 kb che coprono oltre il 95% delle mutazioni driver associate ai tumori.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Facilita la standardizzazione dei saggi distinguendo vere mutazioni da artefatti di sequenziamento mediante correzione degli errori senso/antisenso.
- Valore operativo: Permette la costruzione scalabile di librerie e il capture basato sull'ibridazione per una quantificazione costante di varianti rare tra diversi lotti di campioni.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta sistemi rilevanti per le malattie rilevando la mutazione EGFR pT790M e altre mutazioni a bassa frequenza non rilevate dai metodi tradizionali a causa del rumore di fondo.
- Valore operativo: Garantisce continuità dalla scoperta alla validazione preclinica attraverso un flusso di lavoro di 48 ore, compatibile con studi di monitoraggio longitudinale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
ER-Seq si inserisce nel percorso della scoperta consentendo la verifica di ipotesi nelle fasi iniziali della scoperta, supportando la preparazione dei saggi nello screening e fornendo dati quantitativi sulla frequenza di mutazione per la ricerca traslazionale e la validazione preclinica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi identificando mutazioni guida nel ctDNA a frequenze basse fino a 1 su 10^7 nucleotidi di tipo selvaggio.
- Screening: Garantisce prontezza dell'analisi grazie al recupero efficiente delle molecole di cfDNA e a una maggiore profondità di copertura (23% superiore rispetto ai metodi tradizionali).
- Analisi: Genera misurazioni quantitative di variabili dipendenti (frequenza dell'allele variante) che consentono il confronto tra diverse condizioni di trattamento e punti temporali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica rilevando mutazioni di resistenza come EGFR pT790M, fornendo informazioni per decisioni di avanzamento corrette in base al rischio.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità riutilizzabile grazie alla progettazione universale delle sonde e a un protocollo economico ed efficiente che richiede solo 1-2 giorni per l'esecuzione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo falsi positivi e falsi negativi grazie alla correzione bidirezionale degli errori e al filtraggio del rumore di fondo.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità mediante passaggi standardizzati di purificazione con perline, legatura degli adattatori e arricchimento PCR.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento/cessazione consentendo la rilevazione precoce di mutazioni di resistenza, riducendo i rischi biologici in fase avanzata nei percorsi oncologici.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione adeguata al rischio attraverso una quantificazione accurata della dinamica del ctDNA, informando la stratificazione dei pazienti e la progettazione degli studi clinici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'estrazione degli acidi nucleici, nella preparazione delle librerie e nell'arricchimento basato sull'ibridizzazione.
- Presuppone l'accesso a strumentazione per la sonificazione, termociclatori, rastrelliere magnetiche e concentratori a vuoto.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo ai tempi di prelievo del sangue, alle condizioni di conservazione (6–37°C per un massimo di 72 ore) e ai protocolli di separazione di plasma e cellule.
- Comporta considerazioni di adattamento nell'applicazione del pannello di sonde da 1021 kb su diversi tipi tumorali o sistemi modello.
- Comprende limitazioni pratiche, come la necessità di evitare la perdita di cfDNA durante l'estrazione, la preparazione della libreria e i lavaggi con le perle, al fine di mantenere l'elevata sensibilità.
