Name: Massa isolamento e coltivazione In Vitro delle fasi Intramolluscan del trematode umano sangue Schistosoma Mansoni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: Scopri il protocollo per l'isolamento su larga scala di miracidi di Schistosoma mansoni e la loro coltivazione in vitro. Questo metodo supporta la ricerca sulla schistosomiasi e il controllo della malattia.

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Finanziato in parte dalla concessione NIH RO1AI015503. Topi infettati di schistosome erano forniti dal NIAID schistosomiasi Resource Center presso l'Istituto di ricerca biomedica (Rockville, MD) attraverso NIH-NIAID contratto HHSN272201000005I per la distribuzione attraverso le risorse della BEI.

Tutti cura degli animali e procedure sperimentali sono state approvate dal comitato di uso della University of Wisconsin-Madison sotto protocollo istituzionale Animal Care e non. V005717. Il seguente protocollo comporta lavorare in una struttura di livello 2 di biosicurezza (BSL2) per agenti patogeni umani, anche se nessuna delle fasi di schistosome raffigurate in questo protocollo sono infettiva per l'uomo o altri mammiferi. Seguire politiche istituzionali per la gestione degli agenti patogeni umani del gruppo di rischio 2 (RG2).
Nota: Usiamo topi femmina Swiss-Webster (6 - settimana vecchi) a causa della loro maggiore suscettibilità all'infezione10, ottenendo quindi più grandi oneri di uovo. Tucker et al. descrivere i protocolli di infezione mouse e lumaca utilizzati in questo modello sistema11. La Tabella materiali elenca tutte le attrezzature specifiche, materiali, reagenti e fonti animali necessari per svolgere questo protocollo sperimentale.
1. il trattamento dei fegati infetti
<ol><li>Eutanasia topi, post-infezione 6-7 settimane, da asfissia di CO2 (tasso di 10-30% del volume della camera al minuto). Topi di monitor per la cessazione della respirazione e battito cardiaco. Nota: In genere fino a 20 topi possono essere elaborati in un dato momento.</li>
	<li>Dopo aver trasferito eutanasizzati topi una cappa di biosicurezza, posizionare il mouse sulle loro spalle e spruzzare loro superfici ventrale con etanolo al 70%. Lasciate macerare per 1 min.</li>
	<li>Pizzicare e tirare la pelle dell'addome più basso e tagliare tutta la base della pelle pizzicata più vicina all'addome con forbici chirurgiche sterili. Tirare la pelle tagliata anteriormente (cioè, verso la testa) per rivelare il fegato. Si noti che il fegato dovrebbe essere ampliato e screziato dovuto una risposta granulomatosa indotta da uovo (Figura 2A).</li>
	<li>Rimuovere il fegato e posizionarlo in un becher contenente 200 mL di sterile 1,2% NaCl soluzione contenente pen/strep.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 1.3 e 1.4 con topi restanti. Nota: Venti topi sono generalmente trattati in un solo raccolto.</li>
	<li>Posizionare i fegati in una capsula di Petri sterile e rimuovere non-fegato grasso/connettivo con pinze sterili.</li>
	<li>Trasferimento fegatini tagliati/puliti in una bottiglia sterile 250 mL Centrifuga contenente ~ 200 mL di soluzione sterile di NaCl 1,2% con penna/strep.</li>
	<li>Vigorosamente agitare il flacone contenente i fegati e, utilizzando una pipetta monouso sterile, rimuovere la superficie in eccesso schiuma/detriti galleggianti. Lentamente versare fuori la soluzione salina rimanente in un contenitore o affondare contenenti candeggina 1% (disinfettante).</li>
	<li>Aggiungi ~ 200 mL di soluzione salina fresca per i fegati e ripetere il passaggio 1.8 tre volte di più.</li>
</ol>2. fegato isolamento di estrazione e miracidial
<ol><li>Inserire i fegatini in una tazza piccola sterili in acciaio inox frullatore e aggiungere ~ 2 mL di soluzione di 1,2% di NaCl (Figura 2B).</li>
	<li>Coprire la tazza con un foglio e una capsula di Petri di evitare fuoriuscite e mescolare per 1 min dall'alternarsi di bassa e alta velocità (20 s bassa velocità/10 s ad alta velocità; ripetizione) (Figura 2).</li>
	<li>Distribuire uniformemente la sospensione del fegato blended in bottiglie sterili 250 mL centrifuga (per 20 fegati utilizzano 4 bottiglie).</li>
	<li>Aggiungere soluzione fisiologica sterile con antibiotici a ~ 200 mL bottiglia/volume totale. Pesare/equilibrio bottiglie prima della centrifugazione.</li>
	<li>Centrifugare i fegati mescolati a 290 x g per 15 min a 4 oC. delicatamente versare i surnatanti in un contenitore con candeggina prima dello smaltimento.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 2.4-2.5 una volta. Essere sicuri Risospendere accuratamente sedimento del fegato prima della centrifugazione.</li>
	<li>Dopo aver scartato l'ultima soluzione fisiologica lavare (passo 2,6), aggiungere 200 mL di acqua sterile stagno con penna/strep al tessuto del fegato pellettato, agitare per risospendere il sedimento e trasferire la sospensione in un pallone volumetrico da sterilizzata a 1-L che è stato completamente rivestito di alluminio lamina, fatta eccezione per la parte superiore 3 cm del collo (Figura 2D). Nota: Utilizzare due bottiglie (= 10 fegati) per 1-L fiaschetta. Laghetto d'acqua simula l'ambiente d'acqua dolce naturale necessaria per stimolare miracidial Cova da uova.</li>
	<li>Utilizzando acqua sterile dello stagno, riempire il matraccio a circa 3 cm sopra la lamina che copre il collo. Poi, senza ritardo (come miracidia presto cominciano a covare), rimuovere la schiuma residua e tessuto del fegato galleggiante alla superficie pipettando rapidamente fino ~ 12 mL di acqua di stagno contenente detriti e scartando in un separato scartare il tubo. Sostituire con acqua fresca e sterile dello stagno.</li>
	<li>Ripetere la pulizia passo 2.8, altre tre volte, verificare presenza di miracidia nel tubo di scartare. Cessare la ripetizione della fase di pulizia se miracidia appaiono nella soluzione di lavaggio.</li>
	<li>Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere lentamente ~ 12 mL di acqua calda sterile stagno (pre-riscaldato a 30 oC) per creare un gradiente di temperatura con acqua tiepida pulita e sterile sulla parte superiore. Nota: Ciò avviene meglio scaricando lentamente l'acqua lungo il lato del collo per evitare di miscelare boccetta.</li>
	<li>Posizionare una piccola capsula di Petri copertura sopra l'apertura della boccetta e brillare una luce brillante nella parte superiore del pallone sopra la pellicola di copertura per illuminare la superficie superiore dell'acqua. Nota: In genere, entro 5-10 min, nuoto miracidia, attirata dalla luce, si concentrerà in gran numero entro i primi 2-3 cm di acqua di stagno (Figura 3A).</li>
</ol>3. Miracidial raccolta e coltivazione
<ol><li>Quando miracidia hanno accumulato sulla superficie dopo 10 min, utilizzando una pipetta da trasferimento sterile, rimuovere ~ 8 mL di acqua di stagno e trasferirlo in una provetta sterile 15 mL centrifuga. Collocare la provetta contenente miracidia sul ghiaccio.</li>
	<li>Aggiungere posteriore 8 mL di acqua calda sterile stagno lungo l'interno del matraccio tarato e attendere altri 10 min.</li>
	<li>Utilizzando tubi di nuovi ogni volta, ripetere i passaggi da 3.1 e 3.2 altre tre volte. Dopo la raccolta dith 4, tenere il tubo finale in ghiaccio per 10 minuti consentire la miracidia a stabilirsi. Questo set di tubi comprende il primo raccolto.</li>
	<li>Centrifugare le provette contenenti miracidia a 290 x g per 1 min a 4 oC in una centrifuga refrigerata pre-raffreddata.</li>
	<li>Rimuovere immediatamente la maggior parte del surnatante (~ 7 mL) facendo attenzione a non disturbare il pellet di parassita (Figura 3B).</li>
	<li>Piscina tutti la miracidia da questo primo raccolto in un unico tubo, quindi sciacquare tutti i tubi originali con ~ 1 mL di acqua sterile stagno e aggiungere alla provetta del "pool".</li>
	<li>Consentire i parassiti a stabilirsi sul ghiaccio per ~ 5 min e centrifugare nuovamente i parassiti a 290 x g per 1 min a 4 oC.</li>
	<li>Con attenzione rimuovere il supernatante e aggiungere che 6-8 mL sterile Chernin equilibrata soluzione salina (CBSS +; Vedi tabella materiali) contenente pen/strep.</li>
	<li>Delicatamente sospendere la miracidia e aliquota in una piastra di coltura 24 pozzetti (1 mL per pozzetto), seguita dal tubo di risciacquo in 6-8 mL CBSS + e aggiungendo 1 mL di risciacquo in ciascun pozzetto. Incubare i parassiti a 26 oC in condizioni di normossia. Concentrazioni di miracidia isolato potranno variare, ma generalmente in media ~ 7000/mL.</li>
	<li>Se i parassiti sono ancora concentrato presso la sorgente di luce, ripetere i passaggi 3.1 a 3.9 per continuare la raccolta tardiva-cova miracidia ma aumentare l'intervallo di tempo tra le raccolte per 15-20 min. Nota: Questo nuovo set di tubi rappresenta la seconda raccolta. Tuttavia, poiché i numeri miracidial sono in genere Bassi, larve da tutte le provette di solito sono raggruppate in un'unica cultura ben contenenti 2 mL CBSS +.</li>
	<li>Alle 24 ore post-raccolta e coltivazione, Risospendere delicatamente sporocisti nei loro pozzi di pipettaggio.</li>
	<li>Attendere qualche minuto per consentire i parassiti a depositarsi sul fondo dei pozzetti. Una volta che si sono insediati, rimuovere con cautela il surnatante (~1.5 mL), che conterrà la maggior parte delle piastre epidermiche ciliate capannone da miracidia durante la trasformazione larvale. Questa "trasformazione" supernatante può essere scartata o incorporata in studi di follow-up di prodotti secretivi larvali.</li>
	<li>Aggiungere 1,5 mL di fresco CBSS + in ciascun pozzetto e delicatamente pipetta per risospendere sporocisti. Ripetere il passaggio 3.12 se si desidera ulteriore lavaggio o cambiando in un supporto diverso.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Miracidia di S. mansoni, isolato e manipolato come descritto nel presente documento, può infettare solo l'ospite intermedio di lumaca e pertanto non rappresentano un rischio biologico umano durante questa fase di sviluppo larvale. Tuttavia, per evitare l'accidentale esposizione/infezione di lumache, dovrebbe prestare attenzione per eseguire gli isolamenti miracidial in una posizione diversa dalle zone dove la specie di lumaca Biomphalaria sensibili possono essere presente o mantenuto. Una stanza separat...

L'essere umano sangue flukes Schistosoma spp., sono gli agenti causali della schistosomiasi, una malattia tropicale trascurata che affligge un stimato 230 milioni di persone in tutto il mondo1. La specie più diffusa, Schistosoma mansoni, è geograficamente distribuita in Sud America, l'arcipelago dei Caraibi, Medio Oriente e Africa sub-sahariana2. Il ciclo di vita di S. mansonie altri schistosomes, è complesso, che coinvolge un mammifero ospite definitivo e lumache d'acqua dolce del genere Biomphalaria che fungono da ospiti intermedi obbligati.
S. mansoni adulto maschio e femmina a vite senza fine coppie vivono nelle vene mesenteriche posteriore di riprodurre il mammifero ospite, determinando il rilascio di uova embrionate (ovuli) che sono alloggiati in piccole venule della mucosa intestinale. Uova quindi rotture attraverso le pareti del vaso, migrano attraverso il tessuto mucoso e alla fine inserire il lume intestinale dove essi sono annullate con le feci. Quando gli ovuli digitare tratteggio di larve d'acqua dolce e liberamente natante (miracidia), devono, in breve tempo, trovare una lumaca Biomphalaria adatta per infettare al fine di continuare il suo ciclo di vita. Questo processo di infezione coinvolge miracidial attaccamento alla superficie esterna di lumaca seguita da penetrazione attiva e voce della larva nell'ospite. Presto dopo l'entrata, il miracidium inizia a capannone relative piastre epidermiche ciliati esterni come si forma un sincizio che diventerà la nuova superficie esterna (tegumento) della prossima fase larvale, lo sporociste primario o madre. Attraverso la riproduzione asessuata, ogni sporociste primario produce e rilascia una seconda generazione di sporocisti, definiti secondari o sporocisti di figlia, che a sua volta, generano e rilasciare grandi quantità di intramolluscan fase finale, le cercarie di Fasciolopsis3 . Al momento della fuga dall'host lumaca, liberamente natante cercarie sono capaci di associare a e direttamente penetrando la pelle di un uomo o altri host mammiferi adatto. All'entrata in loro nuovo ospite, cercarie trasformano alla fase schistosomula parassitarie e invadono il sistema vascolare. Essi, a loro volta, migrare al polmone e quindi alla vena epatica dove maturano in vermi adulti, formano coppie maschili e femminile e viaggiare a vene mesenteriche per completare il loro ciclo di vita.
Successo intramolluscan o "fase di lumaca" sviluppo larvale schistosomes è essenziale per la continuazione del ciclo di trasmissione interumana host-to-host. Di fondamentale importanza è la seguente voce periodo del miracidium liberamente natante in host lumaca e la sua trasformazione iniziale alla fase primaria sporociste. A seconda della compatibilità fisiologica e immunologica tra ospite e parassita, è durante questa fase di sviluppo larvale che iniziale successo o il fallimento di stabilire infezioni è determinato4,5,6 . Lo sviluppo successivo di sporocisti primari in grado di produrre asessualmente sporocisti secondari, che quindi generano cercarie umani-infettivo, ulteriormente richiedono un ambiente di host fisiologico permissiva che fornisce per tutta crescita del parassita e riproduttiva ha bisogno.
Fin qui, piccolo è conosciuto circa il sottostante fisiologici, biochimici e processi molecolari controllare interazioni di schistosome-lumaca, soprattutto le molecole e vie coinvolte nella regolazione della riproduzione e sviluppo larvale o modulante risposta immune dell'ospite. Pronto accesso a un gran numero di questi stadi larvali in vitro condizioni di coltura che permettono la manipolazione sperimentale faciliterebbe notevolmente alla scoperta delle vie di sviluppo e meccanismi di fondo della crescita cellulare, differenziazione e riproduzione. Percorsi critici parassita o meccanismi, identificati attraverso la sperimentazione in vitro , quindi potrebbero essere utilizzati per interrompere la crescita/riproduzione larvale nell'host di lumaca, o per identificare meccanismi immuni dell'ospite lumaca coinvolti nel riconoscimento e nell'eliminazione di fasi miracidial o sporociste.
In questo articolo e il video di presentazione, forniamo una descrizione dettagliata di un metodo per isolare un numero elevato di nuotare liberamente S. mansoni miracidia per introduzione nella cultura in vitro che poi può essere sottoposto a follow-up sperimentale manipolazione (vedere la Figura 1 per una descrizione schematica del flusso di lavoro di protocollo). Anche se le procedure simili sono state descritte in precedenza7,8,9, abbiamo sentito che un protocollo dettagliato sarebbe utile per i ricercatori che desiderano impiegare questo modello per affrontare domande ancora senza risposta legate alla lo sviluppo larvale intramolluscan, proliferazione cellulare e interazioni immuni di schistosome-lumaca. Inoltre, questo approccio potrebbe essere facilmente adattato per l'isolamento delle uova da altri trematodi medicamente importanti quali vescica-dimora S. haematobium, distomi del fegato o trematodi del polmone.

<table><tbody><tr><td><forte>Soluzione salina bilanciata di chernin (CBSS+)</forte></td><td></td><td></td><td><forte>Per 1 litro di soluzione</forte></td></tr><tr><td>2,8 g di cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Sciogliere i sali, tranne il cloruro di calcio, e&nbsp;</td></tr><tr><td>0,15 g di cloruro di potassio</td><td>Zuccheri Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>in 800 mL ddH2O</td></tr><tr><td>0,07 g di fosfato di sodio, bibasico anidro</td><td>Fisher</td><td>Scientific S374-500</td><td>Sciogliere separatamente il cloruro di calcio in 200&nbsp;</td></tr><tr><td>0,45 g di solfato di magnesio eptaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td>mL ddH2O</td></tr><tr><td>0,53 g cloruro di calcio diidrato&nbsp;</td><td>Mallinckrodt</td><td>4160</td><td>Aggiungere lentamente il soln di calcio al soln di sale/zucchero con&nbsp;</td></tr><tr><td>0,05 g di bicarbonato di sodio&nbsp; &nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td>con miscelazione costante</td></tr><tr><td>1 g di glucosio</td><td>MP Biomedicals</td><td>152527</td><td>Regolare a pH 7,2 e sterilizzare con filtro</td></tr><tr><td>1 g trealosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td>0,22 &micro; m filtro monouso per flaconi</td></tr><tr><td>10 mL 100X penicillina/streptomicina</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Aggiungere penicillina filtrata e streptomicina soln&nbsp; uso precedente</td></tr><tr><td><forte>Incompleto Bge&nbsp; medium (Ibge)</td><td></td><td></td><td>Per 900 mL di soluzione</td></tr><tr><td>220 mL Schneider' s Terreno di coltura Drosophila modificato</td><td>Lonza</td><td>04-351Q</td><td>Miscelare il terreno di Schneider con 680 mL di ddH2O</td></tr><tr><td>4,5 g di idrolizzato enzimatico di lattoalbumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9010</td><td>Aggiungere idrolizzato di lattoalbumina e galattosio</td></tr><tr><td>1,3 g di galattosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0625</td><td>Regolare a pH 7,2 e sterilizzare con un filtro 0,22 &; m Filtro monouso pre-sterilizzato per flaconi</td></tr><tr><td><forte>Terreno Bge completo (cBge)</forte><</td><td></td><td></td><td>forte>Per 100 mL di soluzione</forte></td></tr><tr><td>90 mL Terreno</td><td></td><td></td> Bge incompleto <td>Per inattivare a caldo FBS: Incubare FBS scongelato in&nbsp;</td></tr><tr><td>9 mL di siero fetale bovino (FBS) (Optima)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>bagnomaria a 60 gradi; C per 1 ora mentre delicatamente</td></tr><tr><td>1 mL di 100X penicillina/streptomicina</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>agitando il flacone ogni 10 min Aliquot FBS inattivato a caldo in provette da 15 mL. e conservare a -20 gradi C. Miscelare il terreno + FBS e filtro, sterilizzare utilizzando un 0,22 & micro; m pre-sterilizzato&nbsp; filtro monouso per flaconi&nbsp; Aggiungere penicillina e streptomicina prima dell'uso</td></tr><tr><td><forte>Acqua di stagno (soluzione madre)</forte></td><td></td><td></td><td><forte>1 litro di soluzione madre</forte></td></tr><tr><td>12,5 g di carbonato di calcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C64-500</td><td>Mescolare tutti i sali in 1 litro di ddH2O</td></tr><tr><td>1,25 g di carbonato di magnesio</td><td>Fisher Scientific</td><td>M27-500</td><td>Si noti che i sali non avranno completamente&nbsp;</td></tr><tr><td>1,25 g di cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>disciolto. Agitare energicamente per sospendere&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>0,25 g di sali di cloruro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>prima di effettuare la lavorazione &nbsp;</td></tr><tr><td><forte>Acqua del laghetto (soluzione di lavoro)</forte></td><td></td><td></td><td><forte>1,5 L di soluzione</forte></td></tr><tr><td>0,8 ml di acqua madre del laghetto (agitare prima dell'uso) in&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td>Miscelare il brodo con ddH2O</td></tr><tr><td>1500 mL di ddH2O</td><td></td><td></td><td>Sterilizzare l'acqua del laghetto mediante sterilizzazione in autoclave (lento&nbsp; </td></tr><tr><td>1,5 ml di penicillina/streptomicina 100X</td>...<td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Aggiungere penicillina e streptomicina prima dell'uso</td></tr><tr><td><soluzione salina forte> (1,2% NaCl)</forte></td><td></td><td></td><td><forte>1,5 L di soluzione</forte></td></tr><tr><td>18 g di cloruro di sodio in 1500 mL di ddH2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Soluzione salina per autoclave per sterilizzare</td></tr><tr><td>1,5 mL di penicillina/streptomicina 100X</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Aggiungere penicillina e streptomicina prima dell'uso</td></tr><tr><td><forte>Attrezzature e materiali aggiuntivi:&nbsp; Camera</td> di eutanasia per topi <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7-L</td><td>A seguito del protocollo IACUC approvato n. V001551</td>Topi Taconic Biosciences Swiss-Webster, femmina, 6 settimane, murina&nbsp;<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> &nbsp;</td></tr><tr><td>Serbatoio e regolatore</td><td></td><td></td> CO2 piastra per <td></td></tr><tr><td>coltura tissutale a 24 pozzetti</td> priva di agenti patogeni <td>TPP</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>Palloni</td><td></td><td></td><td></td>volumetrici da 1 L</tr><tr><td>Sorgente luminosa (150W)</td><td>Chiu Tech Corp</td><td>Modello F0-150</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga, refrigerata, secchio oscillante</td><td>Centrifuga Eppendorf</td><td>Modello 5810R</td><td></td></tr><tr><td> flaconi (250 mL)</td>Provette da centrifuga <td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>da 15 mL, sterili</td><td>Corning</td><td>430053</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento monouso sterili&nbsp;</td><td>Fisher Scientific 1371120</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 & micro; m filtro monouso pre-sterilizzato per flaconi&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPS05RE</td><td></td></tr><tr><td>Frullatore in acciaio inossidabile</td><td>Waring Commercial</td><td>Model 51BL31</td><td></td></tr><tr><td>Tazza frullatore, capacità 100 mL</td><td>Waring Commercial</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio composto invertito</td><td>Nikon Instruments&nbsp;</td><td>Eclipse TE300</td><td></td></tr></tbody></table>

massa isolamento e coltivazione in vitro delle fasi intramolluscan del trematode umano sangue schistosoma mansoni

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Umani sangue trematodi, Schistosoma spp., hanno un ciclo di vita complesso che coinvolge fasi dello sviluppo sessuale e asessuale all'interno di un lumaca intermedi e di mammifero ospite finale, rispettivamente. La capacità di isolare e sostenere le fasi del ciclo di vita diverso in condizioni di coltura in vitro ha notevolmente facilitato le indagini dei meccanismi cellulari, biochimici e molecolari che regolano l'host, la sviluppo e la crescita del parassita interazioni farmacologiche. Trasmissione della schistosomiasi richiede la riproduzione asessuata e lo sviluppo di più stadi larvali all'interno dell'host lumaca; dal miracidium infettiva, attraverso sporocisti primarie e secondarie, alla fase finale cercarial che è infettivo agli esseri umani. In questa carta presentiamo un protocollo passo-passo per massa schiusa e isolamento di Schistosoma mansoni miracidia da uova ottenute dai fegati di topi infetti e la loro successiva introduzione in coltura in vitro . Si prevede che il protocollo dettagliato incoraggerà nuovi ricercatori per partecipare e ampliare questo importante settore della ricerca di schistosome.

La stragrande maggioranza dei miracidia in genere vi sono state raccolte nei primi due "raccolti". Incubazione di miracidia isolato in CBSS + innesca il processo di trasformazione di miracidium-a-sporociste (Figura 4A- C). Entro la prima ora seguente trasferimento alla cultura pozzetti contenente CBSS +, la maggior parte di cessare miracidia nuoto (Figura 4A). A 6 h nella cultura, miracidia stanno attivamente spa...

Questo articolo descrive un protocollo per l'isolamento axenica su larga scala e la raccolta di nuotare liberamente miracidia del trematode umano sangue Schistosoma mansoni e la loro successiva elaborazione per l'introduzione in coltura in vitro .

Massa isolamento e coltivazione In Vitro delle fasi Intramolluscan del trematode umano sangue Schistosoma Mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

In questo video, descriviamo un protocollo dettagliato per la schiusa e l'isolamento su larga scala di Schistosoma mansoni miracidia che nuota liberamente e la successiva introduzione in coltura in vitro. Lo Schistosoma mansoni è una delle quattro principali specie di trematodi del sangue che infettano oltre duecento milioni di persone in tutto il mondo, causando la malattia tropicale trascurata nota come schistosomiasi. Il ciclo di vita dello schistosoma è complesso e coinvolge le lumache come ospiti intermedi e i mammiferi, compreso l'uomo, come ospiti definitivi.La coltivazione in vitro di schistosomi larvali e adulti rappresenta uno strumento inestimabile per far avanzare la ricerca verso il controllo e l'eliminazione di questa malattia parassitaria. In questo video, utilizzando un modello murino per produrre uova di S. mansoni contenenti lo stadio miracidiale infetto da lumaca, illustriamo una procedura passo dopo passo per l'isolamento di massa di miracidia nate da uova recuperate da fegati e la loro coltivazione in vitro. Ad assistermi in questa dimostrazione ci sono Nathalie Dinguirard e Codie Heinemann.Di seguito è riportato un diagramma del flusso di lavoro che illustra i tre passaggi principali da trattare nel video di accompagnamento. Nel primo segmento, illustriamo la lavorazione dei fegati infetti. Utilizzando topi infettati da adulti di Schistosoma mansoni, descriveremo come rimuovere i loro fegati infetti e i passaggi utilizzati per prepararli alla miscelazione dei tessuti, inclusa la rimozione di un tessuto non epatico e il successivo lavaggio in soluzione salina sterile.Nel secondo segmento, mostreremo come vengono estratte le uova dai fegati e vengono isolate le miracidie. Gli ovuli vengono rilasciati dai fegati mediante miscelazione meccanica seguita dal lavaggio ripetuto del tessuto epatico omogeneizzato in soluzione salina mediante centrifugazione. Il tessuto epatico pellettato contenente le uova viene quindi sospeso in acqua sterile di laghetto artificiale e trasferito con cura in matracci tarati ricoperti di alluminio.L'eccesso di schiuma e i detriti epatici galleggianti vengono eliminati mediante la rapida rimozione sequenziale e l'aggiunta di circa 12 mulini di acqua di stagno al pallone. Dopo l'ultimo lavaggio, l'acqua del laghetto preriscaldata viene aggiunta delicatamente al pallone, seguita dall'illuminazione dei pochi centimetri superiori del collo del pallone con la fonte di luce intensa per attirare i miracidi. Una volta che i miracidi si sono accumulati alla fonte di luce, nel terzo e ultimo segmento del video, dimostreremo la raccolta di queste larve e la loro coltivazione.I miracidia vengono trasferiti dal pallone a provette da centrifuga da 15 millilitri. Quindi immobilizzato su ghiaccio e concentrato mediante centrifugazione. Nelle fasi finali, i miracidi vengono inseriti in un unico tubo.L'acqua del laghetto viene sostituita con la soluzione salina bilanciata di Chernin e i miracidi vengono assegnati nei pozzetti della piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti per la coltivazione in vitro a 26 gradi centigradi. Dopo l'eutanasia dei topi infetti seguendo i protocolli istituzionali approvati per la cura degli animali, vengono posizionati sulla schiena e il 70% di etanolo viene spruzzato sulle superfici ventrali. Per rimuovere il fegato, pizzicare e tirare su la pelle del basso addome e tagliare la pelle pizzicata con forbici chirurgiche sterili.Tirare la pelle verso l'alto per rivelare il fegato e rimuoverla delicatamente a mano. I fegati dei topi infetti appaiono ingrossati e maculati a causa di una risposta granulomatosa indotta dall'uovo. Una volta rimosso il fegato, metterlo in un becher contenente 200 mulini di soluzione salina sterile all'1,2% contenente Pen Strep e procedere alla rimozione dei fegati dai topi rimanenti.I fegati vengono quindi trasferiti in una capsula di Petri sterile e il grasso non epatico e i tessuti connettivi vengono rimossi con una pinza sterile. Una volta completato il rifilatura, i fegati vengono trasferiti in flaconi da centrifuga sterili da 250 millilitri contenenti circa 200 mulini di soluzione fisiologica sterile e agitati energicamente per sospendere i tessuti estranei e il sangue in eccesso. Utilizzando una pipetta sterile monouso, rimuovere la schiuma superficiale e gli eventuali detriti di tessuto galleggianti.Richiudere il flacone e agitare energicamente una seconda volta, quindi rimuovere nuovamente la schiuma e i detriti e quindi decantare e scartare accuratamente la soluzione salina di lavaggio. Aggiungere 200 millilitri di soluzione salina fresca ai fegati e ripetere il processo altre tre volte. Dovresti vedere una notevole eliminazione della soluzione di lavaggio scartata.Metti i fegati lavati in una piccola tazza sterile del frullatore in acciaio inossidabile e aggiungi circa due macinatori di soluzione salina con antibiotici. Coprite la tazza con un foglio di alluminio e una capsula di Petri per evitare fuoriuscite e frullate per un minuto alternando velocità basse e alte. Dopo la miscelazione, distribuire uniformemente la sospensione epatica in flaconi centrifugati sterili da 250 millilitri.In genere, vengono utilizzate quattro bottiglie per la lavorazione di 20 fegati. Riempire ogni flacone con circa 200 millilitri di soluzione fisiologica sterile. Pesare o bilanciare le bottiglie e agitarle prima di centrifugare i fegati frullati.Dopo la centrifugazione, decantare delicatamente ed eliminare la soluzione salina di lavaggio. Dovresti osservare il sedimento epatico pellettato contenente le uova sul fondo della bottiglia e poi ripetere questo passaggio ancora una volta aggiungendo 200 millilitri di soluzione salina fresca a ciascuna bottiglia e agitando energicamente per risospendere completamente il sedimento epatico prima della centrifugazione. Durante la fase di centrifugazione, preparare due matracci tarati sterili da un litro coprendoli completamente con un foglio di alluminio ad eccezione dei tre centimetri superiori.Utilizzare pezzi di carta stagnola separati per coprire il corpo e il collo del pallone per facilitare le fasi di lavaggio che verranno descritte nel segmento successivo. Ok, torniamo ai fegati. Dopo la centrifugazione e l'eliminazione dell'ultimo lavaggio salino, aggiungere 200 millilitri di acqua sterile di laghetto artificiale contenente Pen Strep al tessuto epatico pellettato e agitare nuovamente per risospendere completamente il sedimento.Trasferire con cura la sospensione di fegato d'acqua del laghetto nei matracci volumetrici che ora sono coperti con un foglio di alluminio. Utilizzando acqua sterile per laghetto, riempire il pallone, compreso il collo e, senza indugio, rimuovere la schiuma residua e il tessuto epatico galleggiante pipettando rapidamente circa 12 mulini di acqua per laghetto contenente detriti e gettandola in un tubo separato. Sostituire l'acqua fresca del laghetto e ripetere questa fase di pulizia altre tre volte verificando la presenza di miracidia nel tubo di smaltimento.Adottare ulteriori passaggi di pulizia se compaiono miracidie che nuotano nel tubo di scarto o quando non si osservano più detriti di tessuto. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere lentamente otto millilitri di acqua sterile preriscaldata per creare un gradiente di temperatura nella parte superiore del pallone. Il modo migliore per ottenere questa operazione è scaricare lentamente l'acqua lungo il lato del collo del pallone per evitare la miscelazione.Metti una piccola capsula di Petri per coprire l'apertura del pallone e fai brillare una luce intensa sulla parte superiore del collo sopra il coperchio della carta stagnola per illuminare la superficie superiore dell'acqua. In genere, entro 5-10 minuti, i miracidi nuotatori attratti dalla luce si concentreranno in gran numero all'interno dei primi due o tre centimetri della superficie dell'acqua dello stagno. Quando i miracidi si sono accumulati in superficie, utilizzando una pipetta sterile, rimuovere e trasferire circa otto mulini di acqua di stagno in una provetta centrifugata sterile da 15 mulini.Mettere il tubo contenente miracidia sul ghiaccio. Aggiungere otto macinatori di acqua calda e sterile lungo il lato del matraccio tarato e attendere altri 10 minuti. Ripetere la raccolta di miracidia altre tre volte utilizzando ogni volta nuovi tubi da 15 mulini.Dopo la quarta raccolta, tenere l'ultimo tubo sul ghiaccio per 10 minuti per consentire ai miracidi immobilizzati di depositarsi. Questo primo gruppo di parassiti isolati rappresenta in genere circa l'80% del raccolto totale di miracidi. Pellet miracidia centrifugando le provette per un minuto in una centrifuga refrigerata pre-raffreddata.Dopo la centrifugazione, rimuovere immediatamente la maggior parte del surnatante, facendo attenzione a non disturbare i pellet del parassita. Questo passaggio dovrebbe essere fatto rapidamente poiché la miracidia inizierà presto a nuotare. Risospendere delicatamente i miracidia e trasferirli in un unico tubo da 15 mulini.Sciacquare ciascuno dei tubi originali con circa un macinacaffè di acqua sterile per laghetto e aggiungerli al tubo in piscina. Lasciare che i parassiti si depositino sul ghiaccio per circa cinque minuti e di nuovo, pellettarli mediante centrifugazione. Rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare il pellet e aggiungere da sei a otto millilitri di soluzione salina bilanciata sterile di Chernin o antibiotici contenenti CBSS.Risospendere delicatamente i miracidi in CBSS e allocarli in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. Incubare i parassiti a 26 gradi centigradi in condizioni normossiche. Come si può vedere, i miracidi nuoteranno attivamente nei pozzetti dopo l'incubazione iniziale e la maggior parte inizierà a depositarsi sul fondo del pozzo per iniziare a trasformarsi nello stadio primario di sporocisti.Le larve inizieranno a liberarsi delle placche epidermiche ciliate dopo due o tre ore in coltura CBSS. Dopo 24 ore, la stragrande maggioranza dei miracidia avrà perso le placche e completato la trasformazione in sporocisti. La coltivazione in vitro di elementi parassitari, in particolare quelli di importanza medica e veterinaria, rappresenta uno strumento di ricerca inestimabile, non solo per identificare e caratterizzare percorsi unici, regolando la crescita, lo sviluppo, la riproduzione e le interazioni immunitarie dell'ospite, ma anche fornendo metodi pratici per lo screening di molecole e percorsi identificati per un potenziale intervento terapeutico.Guardando al futuro, con lo sviluppo e il continuo perfezionamento degli strumenti attualmente disponibili per la manipolazione dei geni e l'espressione genica in vitro attraverso l'interferenza dell'RNA transgenico e gli approcci di editing del genoma, si prevede che saranno necessari metodi efficienti per l'isolamento e la coltivazione su larga scala di miracidia da altre importanti specie di schistosomi, ad esempio i trematodi epatici o polmonari, per ulteriori progressi della ricerca in questo campo. Prevediamo che l'approccio di base per l'isolamento degli schistosomi larvali qui presentato potrebbe essere facilmente adattato per accogliere queste e altre specie di elmin.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

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