Analisi della fagocitosi per le cellule apoptotiche in Drosophila Embrioni

Qui descriviamo un test di fagocitosi usando le cellule embrionali disperse di Drosophila . Ci permette di quantificare con facilità e precisione i livelli di fagocitosi in vivo e di identificare nuove molecole necessarie per la fagocitosi delle cellule apoptotiche.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di misurare la fagocitosi in vivo in Drosophila per valutare il coinvolgimento di specifici geni di interesse nell'inghiottimento delle cellule apoptotiche. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia e della biologia dello sviluppo sui meccanismi coinvolti nell'inghiottimento delle cellule apoptotiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule possono essere utilizzate facilmente e misurate con precisione nei livelli di fagocitosi in vivo.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia dei disturbi infiammatori e delle malattie autoimmuni poiché le cellule apoptotiche mediante fagocitosi sono necessarie per rimuovere le cellule pericolose che causano l'infiammazione. Inizia aggiungendo 200 moscerini della frutta femmine adulte e 200 moscerini della frutta maschi adulti e un piatto di agar di succo d'uva fresco su lievito in un tubo conico da 50 millilitri. Chiudere la provetta con un tappo di spugna e incubare le mosche alla luce a 16 gradi Celsius per due o tre giorni.

Al termine dell'incubazione, spostare le mosche a 25 gradi Celsius al buio per un'ora e sostituire la vecchia piastra con una nuova piastra senza lievito. Lasciare che le mosche depongano le uova per due ore. Quindi incubare la piastra a 16 gradi Celsius per 26 ore.

Il giorno successivo, utilizzare un pennello per trasferire gli embrioni in un millilitro di PBS integrato con Triton X-100 allo 0,2%. Dopo due lavaggi, aggiungere 1,2 millilitri di soluzione di ipoclorito di sodio agli embrioni per rimuovere il corion. Dopo tre minuti, lavare gli embrioni quattro volte in PBS fresco più Triton X-100.

Trasferisci gli embrioni lavati su una piastra di agarosio di sei centimetri e posiziona la piastra sotto un microscopio da dissezione. Identifica gli embrioni allo stadio 16 utilizzando una micro punta. Utilizzare una micropipetta per trasferire circa 50 degli embrioni allo stadio 16 in una microprovetta da 1,5 millilitri.

Per isolare le cellule embrionali, prima lavare gli embrioni due volte con 150 microlitri di PBS. Trasferisci gli embrioni in una nuova microprovetta da 1,5 millilitri. Quindi aggiungere 200 microlitri di collagenasi e omogeneizzare gli embrioni 30 volte con un miscelatore di pellet.

Al termine dell'omogeneizzazione, triturare le cellule embrionali 10 volte e trasferire la sospensione cellulare in una nuova provetta da 1,5 millilitri. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per un minuto. Quindi triturare le cellule altre 10 volte e rimetterle nell'incubatore a 37 gradi Celsius per un altro minuto.

Al termine della seconda incubazione, aggiungere 800 microlitri di PBS alle cellule e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Risospendere il pellet in 200 microlitri di tripsina prima di filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micron. Arrestare l'attività enzimatica con 40 microlitri di siero fetale bovino inattivato a caldo in 800 microlitri di PBS e raccogliere le cellule per centrifugazione.

Risospendere le cellule precipitate in 200 microlitri di PBS fresco e raccogliere le cellule con un'altra centrifugazione. Risospendere il pellet in 30 microlitri di PBS e montare le celle su un vetrino rivestito di amminopropiltrietossisilano. Quando le cellule si sono attaccate, utilizzare una pipetta per rimuovere il PBS in eccesso dal vetrino e fissare le cellule con 60-70 microlitri di paraformaldeide al 4%.

Dopo 10-15 minuti, rimuovere il fissativo e lavare le cellule in PBS per un minuto. Per immunocolorare le cellule con anticorpi anti-Croquemort, immergere prima in serie il vetrino in metanolo, quindi PBS integrato con Triton X-100 allo 0,2% seguito da PBS da solo. Successivamente, bloccare il legame aspecifico con 20 microlitri di siero di suino intero al 5% in PBS più 0,2% di Triton X-100 per 20 minuti a temperatura ambiente.

Rimuovere la soluzione bloccante in eccesso ed etichettare le cellule con 20 microlitri di antisiero anti-Croquemort a quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina successiva, lavare il vetrino in PBS più Triton X-100 per cinque incubazioni di 10 minuti. Dopo l'ultimo lavaggio, sciacquare il vetrino in PBS per 10 minuti.

Quindi etichettare le cellule con 20 microlitri di IgG anti-ratto marcate con fosfatasi alcalina a temperatura ambiente per un'ora. Al termine dell'incubazione, lavare il vetrino cinque volte in PBS più Triton X-100 come dimostrato, seguito da un ammollo di 10 minuti in soluzione tampone. Quindi etichettare le cellule con una soluzione di substrato della fosfatasi e osservare le cellule al microscopio ottico.

Quando compaiono forti segnali viola nei granuli dell'emocita, rimuovere il substrato in eccesso e immergere il vetrino in un tampone integrato con EDTA per cinque-10 minuti. Al termine dell'incubazione, sciacquare le cellule con due lavaggi PBS di cinque minuti e trattarle con tampone di equilibratura per 10 minuti. Dopo aver rimosso la soluzione, etichettare le cellule con 20 microlitri di soluzione terminale di deossinucleotidiltransferasi a 37 gradi Celsius per un'ora.

Quindi rimuovere la soluzione dal vetrino e immergere le cellule in 0,5 millilitri di tampone di lavaggio in 17 millilitri di acqua per 10 minuti. Successivamente, sciacquare le cellule con tre lavaggi PBS di cinque minuti ed etichettarle con 20 microlitri di anti-digossigenina perossidasi per 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule quattro volte in PBS come dimostrato e immergere il vetrino nel substrato di perossidasi per incrementi di 30 secondi fino a quando le cellule apoptotiche diventano marroni.

Una volta ottenuta una colorazione ottimale, immergere il vetrino in acqua per arrestare la reazione della perossidasi. In queste immagini, i macrofagi di Drosophila, chiamati emociti, sono stati colorati per il marcatore emocitario Croquemort e per la presenza di cellule apoptotiche fagocitate da TUNEL in cellule embrionali disperse, come appena dimostrato. Le cellule positive al Croquemort mostrano segnali viola nei piccoli granuli delle loro cellule, mentre le cellule TUNEL positive hanno dimostrato un segnale marrone in tutto il loro corpo.

In alternativa, gli emociti possono essere colorati con un anticorpo anti-GFP che colora l'intero emocita invece che solo i granuli. In questo esperimento, è stato analizzato il rapporto tra gli emociti fagocitorizzanti e gli emociti totali in embrioni wild type o singoli mutanti, dimostrando che l'indice fagocitario era più basso in entrambi i ceppi mutanti singoli rispetto ai moscerini wild type, mentre il numero totale di emociti e cellule apoptotiche era simile, indicando la necessità dei geni mutati per l'inghiottimento delle cellule apoptotiche. Il knockdown dell'RNAi di singoli geni riduce anche l'indice fagocitario, mentre il numero totale di emociti e cellule apoptotiche è rimasto comparabile, sottolineando ulteriormente il coinvolgimento dei recettori della fagocitosi studiati nella fagocitosi cellulo-mediata apoptotica.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in circa 15 ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di evitare l'eccesso di marcatori emocitari e la colorazione TUNEL per una valutazione ottimale della capacità fagocitotica delle cellule. A seguito di questa procedura, è possibile eseguire un test di fagocitosi in situ di tutti gli embrioni di Drosophila per rispondere a ulteriori domande sul sito di inghiottimento o sulla distribuzione degli emociti.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare i meccanismi dell'inghiottimento cellulare apoptotico in Drosophila. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare la fagocitosi in vivo negli embrioni di Drosophila.