Divisione delle cellule dei mammiferi in matrici 3D tramite microscopia confocale quantitativa di riflessione

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare la divisione cellulare dei mammiferi e le interazioni della matrice cellulare in un ambiente 3D fisiologicamente rilevante. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un approccio efficiente e generale per studiare la divisione cellulare dei mammiferi e le interazioni della matrice cellulare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia cellulare, come le basi molecolari dello sviluppo del tessuto normale e della malattia.

Un giorno prima della trasfezione, preparare cinque milioni di cellule T HEK-293 in una piastra di coltura cellulare da 100 millilitri in 10 millilitri di normale terreno di coltura cellulare. Incubare queste cellule a 37 gradi Celsius per 24 ore in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, poco prima di iniziare le trasfezioni, rimuovere una fiala del reagente di trasfezione da quattro gradi Celsius e lasciarla fuori a temperatura ambiente.

Quindi, per iniziare, aggiungere un millilitro di siero ridotto a un tubo sterile per microfuge. A questo, aggiungere quantità specificate di plasmidi vettori lentivirali utilizzati per la trasfezione e miscelare mediante pipettaggio. Incubare la provetta a temperatura ambiente per cinque minuti.

Dopo cinque minuti, aggiungere 48 microlitri di reagente di trasfezione in questa provetta e mescolare delicatamente pipettando. Successivamente, incubare questa miscela a temperatura ambiente per almeno 15 minuti. Una volta completata l'incubazione, rimuovere la piastra con le cellule T HEK-293 dall'incubatore.

Aggiungere la miscela di reagenti per trasfezione del DNA preparata, goccia a goccia, sulle cellule e agitare delicatamente la piastra per garantire una distribuzione uniforme nella piastra. Riposizionare la piastra nell'incubatrice. Circa sei ore dopo la trasfezione, rimuovere la piastra e aspirare il terreno.

Aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura fresco e trasferire nuovamente la piastra nell'incubatrice. In più punti temporali, 24, 48 e 72 ore dopo la trasfezione, raccogliere il terreno di coltura contenente le particelle lentivirali in provette separate. Quindi, filtrare il terreno di coltura raccolto attraverso un filtro sterile da 0,45 micron per rimuovere i detriti cellulari.

Sostituire con terreno di coltura fresco dopo ogni raccolto. Il filtrato contenente le particelle lentivirali può essere utilizzato immediatamente per la trasduzione o può essere conservato a meno 80 gradi Celsius. Piastra le cellule di carcinoma mammario umano MDA-MB-231 in una piastra di coltura da 35 millimetri in terreno di coltura normale.

Incubare queste cellule a 37 gradi Celsius per 24 ore in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, aspirare il terreno di coltura dalla piastra e aggiungere un millilitro di particelle lentivirali insieme a un millilitro di terreno di coltura fresco. Incubare le cellule nell'incubatore per circa 16 ore.

Al termine dell'incubazione con particelle virali, rimuovere la piastra per aspirare il terreno. Quindi aggiungere due millilitri di terreno fresco e trasferire nuovamente nell'incubatrice per 24-72 ore. Controllare l'espressione di H2B-mCherry in queste cellule trasdotte utilizzando un microscopio a epifluorescenza.

Per iniziare gli esperimenti di sincronizzazione, la prima piastra MDA-MB-231 esprime cellule H2B-mCherry al 50-60% di confluenza in una piastra a 24 pozzetti. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore. Il giorno successivo, sostituire il terreno di coltura con 0,5 millilitri di terreno contenente due millimolari di timidina.

Lasciare la piastra nell'incubatrice per 24 ore. Una volta completata l'incubazione, lavare le cellule tre volte con PBS per liberarle dal trattamento con Timidina. Quindi lasciare le cellule in 0,5 millilitri di normale terreno di coltura per cinque ore nell'incubatore.

Successivamente, per bloccare queste cellule in mitosi, aggiungere il nocodazolo al terreno di coltura. Lasciare le cellule nell'incubatore per 12 ore. Al termine del trattamento con nocodazolo, estrarre la piastra e, utilizzando un agitatore orbitale, agitare le cellule per 45 secondi a un minuto per rilasciare le cellule mitotiche.

Successivamente, trasferire il terreno contenente le cellule mitotiche estratte in una nuova provetta da centrifuga. Quindi aggiungere 0,5 millilitri di terreno fresco a ciascun pozzetto. Successivamente, ripetere l'agitazione e l'estrazione delle cellule altre due volte.

Raggruppare il mezzo totale raccolto e quindi centrifugarlo per pellettare le celle mitotiche. Dopo la centrifuga, risospendere il pellet cellulare in 0,25 millilitri di terreno di coltura cellulare fresco. Utilizzando un emocitometro, contare il numero di cellule.

All'inizio di questa fase, preparare 50 millilitri di soluzione DMEM 10x e sterilizzarla con filtro. Successivamente, determina i volumi di tutti i componenti che verranno utilizzati per realizzare la matrice di collagene 3D come specificato nel protocollo di testo. Pre-raffreddare tutti questi componenti su ghiaccio per rallentare la gelificazione del collagene.

Ora, a una provetta da centrifuga pre-raffreddata da 1,5 millilitri, aggiungere il numero richiesto di cellule nel terreno, quindi 10x DMEM, FBS, acqua deionizzata, collagene e infine idrossido di sodio. Mescolare accuratamente utilizzando una pipetta da un millilitro. Una volta che la soluzione è ben miscelata, aggiungere 500 microlitri della miscela in ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti.

Posizionare la piastra a 24 pozzetti in un incubatore a 37 gradi Celsius. Dopo 30 minuti, estrarre la piastra e aggiungere 500 microlitri di terreno di coltura preriscaldato sopra il gel. Prima dell'imaging, accendere le unità di cellule vive dei microscopi a contrasto di fase e confocali.

Per catturare le cellule in divisione, posizionare la piastra a 24 pozzetti contenente le cellule incorporate nelle matrici di collagene nell'unità di cellule vive del microscopio a fluorescenza. Utilizzando l'obiettivo 10X, trovare il fondo della lastra e poi spostarla verso l'alto fino a quando il microscopio non mette a fuoco a circa 500 micrometri dal fondo della lastra. Sposta il tavolino per trovare le cellule nelle diverse fasi della mitosi e seleziona più posizioni per l'imaging.

Imposta l'esperimento timelapse con intervalli di due minuti. Successivamente, per visualizzare la rete di collagene, configurare il microscopio confocale in modo da catturare solo la luce riflessa dal laser a 488 nanometri. Quindi posizionare la piastra contenente le cellule nelle matrici di collagene nell'unità cellulare viva di questo microscopio.

Trova la parte inferiore della lastra e quindi sposta la lente dell'obiettivo verso l'alto fino a quando non mette a fuoco a circa 100 micrometri dal fondo della lastra. Sposta lo stage per trovare le celle e selezionare più posizioni per l'imaging. Imposta l'esperimento timelapse con intervalli di cinque minuti.

Di seguito sono mostrate le immagini fluorescenti di una cellula MDA-MB-231 che esprime H2B-mCherry in divisione incorporata nella matrice di collagene. Diverse fasi della mitosi sono prontamente osservate come previsto. La distribuzione delle fibre di collagene nel bianco visualizzato simultaneamente utilizzando la microscopia a riflessione confocale cambia molto poco durante il corso della mitosi.

La fase G2-M sincronizzata con le cellule e incorporata in una matrice di collagene completa la divisione cellulare nelle prime due ore, mentre le cellule asincrone di controllo si dividono in modo casuale. La quantificazione della distribuzione delle fibre di collagene durante le fasi interfasiche e mitotiche suggerisce che la deformazione della matrice è minima durante la divisione cellulare e maggiore nelle cellule interfasiche. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in sette giorni a partire dalla generazione della linea cellulare stabile fino all'analisi della divisione cellulare video in una matrice 3D.

Dopo aver visto questo video, si spera che tu abbia una buona comprensione di come sincronizzare e monitorare la divisione cellulare dei mammiferi in matrici 3D utilizzando l'imaging di cellule vive e come determinare la deformazione della matrice utilizzando la microscopia a riflessione confocale e le tecniche di analisi dell'imaging quantitativo.