Name: Multimateriali di cartilagine e pelle tessuto analoghi utilizzando un romanzo passivo unità tecnica di miscelazione per Bioink Precellularization (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Scopri la pre-cellularizzazione di bioinchi per la biostampa utilizzando un'unità di miscelazione passiva con bioinchi a base di nanocellulosa-alginato. Questo metodo garantisce alta vitalità cellulare e cellularizzazione uniforme.

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Gli autori non hanno nessun ringraziamenti.

Questo protocollo segue le linee guida del comitato etico di Chalmers University ricerca umana.
Nota: Tutti i passaggi sono eseguiti in una cappa di biosicurezza sterile.
1. preparazione dei materiali di consumo, Bioink e cellule
<ol>
	<li>Ottenere due siringhe, una siringa (Figura 1a) per la sospensione delle cellule, mentre altre la siringa è per il bioink (Figura 1b).</li>
	<li>Ottenere un'unità di miscelazione passiva (Figura 1c) sterile che può essere accoppiata con siringhe dual tramite un raccordo Luer lock.</li>
	<li>Ottenere un gruppo erogatore (Figura 1d) che può estrudere un volume da due siringhe sterili simultaneamente a velocità controllata. Nota: Il rapporto di miscelazione utilizzato in questo studio è di 10:1. Pertanto, utilizzare una siringa 12 mL e una siringa da 1 mL come richiesto dalle unità di miscelazione 10:1.</li>
	<li>Ottenere una cartuccia sterile (Figura 1e) e un sterile Luer lock femmina a femmina-femmina direttamente miscelare la sospensione delle cellule e bioink in.</li>
	<li>Ottenere o preparare il bioink per la miscelazione con una sospensione cellulare. Nota: In questo protocollo, è stato utilizzato un bioink nanocellulose/alginato basato. Questo bioink è con collegamenti incrociati attraverso l'aggiunta di una soluzione sterile 100 mM CaCl2 post stampa.</li>
	<li>Staccare le cellule utilizzando una soluzione di tripsina/EDTA 0.5% e contare il numero totale di celle utilizzando il metodo di esclusione blu trypan17. Nota: In questo protocollo, fibroblasti umani venivano utilizzati.</li>
	<li>Determinare quali densità cellulare è voluta nel costrutto finale stampato. Calcolare utilizzando le equazioni seguenti la concentrazione delle cellule raccolte che deve essere diluito per raggiungere questa densità di cella finale di destinazione. Nota: Nel presente protocollo, una densità di cella finale di 5 x 106 cellule/mL è stata utilizzata.<ol>
		<li>Selezionare una cella desiderata concentrazione per gli esperimenti: Cdelle cellule (cellule/mL).</li>
		<li>Calcolare la quantità di bioink necessario, Vbioink, basato sul numero totale dei costrutti desiderato: 
		Vbioink = Vcostruire × NContructs Nota: per esempio, il volume di bioink al costrutto è 100 µ l. Se 30 costrutti vengono stampate, il volume di bioink necessario è da 3 mL.</li>
		<li>Calcolare il numero di cellule necessarie: 
		Ncelle = Ccell (1,1 × Vbiolink)</li>
		<li>Risospendere le cellule (celluledi N) in 1/10th il volume della bioink: 
		Vsospensione cellulare = 0,1 × Vbiolink Nota: per esempio, se Vbioink = 3 mL, allora Vsospensione cellulare = 0,1 × 3 mL = 0,3 mL</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. miscelazione della sospensione cellulare e Bioink
<ol>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare nella siringa di sospensione cellulare.</li>
	<li>Trasferire la bioink un'altra siringa o ottenere una siringa contenente la bioink.</li>
	<li>Tirare indietro lo stantuffo della siringa bioink e inserire la siringa nel gruppo erogatore. Posizionare l'apparecchio verticalmente con il Luer lock femmina verso l'alto (Figura 1f1).</li>
	<li>Tirare indietro lo stantuffo della siringa delle cellule ad una lunghezza simile come la siringa di bioink e inserire il gruppo erogatore (Figura 1f2).</li>
	<li>Inserire due siringhe per l'unità di miscelazione ruotandolo i connettori Luer lock (Figura 1f3).</li>
	<li>Innescare il sistema di miscelazione spingendo il gruppo erogatore per estrudere l'aria nella siringa. Interrompere l'innesco prima la soluzione raggiungendo Luer lock (Figura 1g4).</li>
	<li>Dopo l'innesco, è necessario allegare la cartuccia di riempimento alla fine dell'unità di miscelazione tramite il raccordo luer lock (Figura 1g5). Assicurarsi che lo stantuffo della cartuccia di riempimento sia nella parte inferiore prima dell'attacco.</li>
	<li>Lentamente comprimere (Figura 1h6) il gruppo erogatore per mescolare la sospensione delle cellule e bioink insieme nella cartuccia (Figura 1i7).</li>
	<li>Spingere lo stantuffo verso il basso la cartuccia di riempimento con una punta di pipetta sterilizzata per contattare la miscela di bioink-cellula dopo la miscelazione. Mantenere l'erogazione fino a comprimere per assicurare che la miscela delle cellule/bioink non viene estruso in unità di miscelazione.</li>
	<li>Tappo della cartuccia e picchiettare delicatamente sulla superficie di lavoro per spostare eventuali bolle d'aria nella parte superiore della cartuccia (fine del pistone). Nota: A questo punto, l'impasto di cella/bioink è pronto per la stampa. Le sezioni seguenti illustrerà applicazioni specifiche e procedure di stampa.</li>
</ol>
3. la determinazione della vitalità cellulare utilizzando un'unità di miscelazione rispetto al manuale spatola miscelazione
<ol>
	<li>Scollegare i fibroblasti umani (passaggio 7) con una soluzione di tripsina/EDTA 0,5% a 80% confluenza, contare il numero e risospendere in terreno di coltura ad una densità di cellule sufficiente per ottenere una concentrazione finale dopo la fusione con il bioink (01:10 cella: bioink ratio) di 5 x 10 6 cellule/mL.</li>
	<li>Frullare le cellule in bioink utilizzando sia il passivo unità tecnica (passaggio 2) di miscelazione o tramite spatola per valutare l'effetto di entrambe le tecniche sulla vitalità cellulare.</li>
	<li>Le cellule si fondono il bioink utilizzando il passivo unità tecnica 1, 2, o 3 volte prima dell'erogazione in uno stampo per cross-linking con 100 mM di CaCl2di miscelazione. Nota: Per eseguire ulteriori miscele, mescolare il cellulare/bioink direttamente in una siringa, piuttosto che una cartuccia. Quindi remix la miscela attraverso l'unità di miscelazione seguendo il protocollo precedente, ma senza la componente di siringa delle cellule.</li>
	<li>Le cellule si fondono in un bioink separato utilizzando manuale meccanica miscelazione tramite una spatola per durate di 30, 60 o 90 s. trasferimento delle miscele (per ogni tempo di miscelazione) in uno stampo per cross-linking utilizzando 100 mM CaCl2.</li>
	<li>Trasferire i campioni ad una piastra ben dopo il completamento del cross-linking e cultura in condizioni standard.</li>
	<li>Dopo 1 giorno di cultura, lavare i costrutti (n = 3-4 per ogni gruppo) nel mezzo di coltura privo di siero cellulare per 30 min. macchiare le cellule nei costrutti con una soluzione colorante (4 µM calceina, 1 µM etidio omodimero-1) per 30 min.<ol>
		<li>Lavare due volte e incubare i campioni nel mezzo di coltura privo di siero cellulare per un totale di 1 h a 37 ° C.</li></ol></li></ol>Trasferire i campioni a una soluzione di imaging di cellule vive.
	
	
	<li>Acquisire immagini tramite una telecamera digitale a colori a 10 ingrandimenti utilizzando un microscopio invertito con filtri FITC e Texas Red e analizzare utilizzando software di analisi di immagine.</li>
	<li>Selezionare casualmente tre immagini da ogni costrutto per la quantificazione di attuabilità delle cellule.</li>
	<li>Calcolare la redditività sulla base del rapporto di cellule vive al numero totale di cellule. Analizzare i dati tramite un one-way ANOVA seguita da test di confronti multipli di Tukey.</li>

4. multimateriali di cartilagine analoghi con un tipo di cellula
<ol>
	<li>Disegnare un modello 3D del tessuto desiderato analogico. Convertire un file Gcode per multimateriali e caricare il file Gcode sul bioprinter1. Nota: Nel presente protocollo, una struttura quadrata con dimensioni 4.8 x 4.8 x 0,9 mm3 è stata esportata come file STL. È stato generato un file Gcode della struttura della grata utilizzando le seguenti impostazioni: spessore dello strato, 0,3 mm; pattern di riempimento, rettilinee; densità di riempimento, 25%; velocità, 10 mm/s.</li>
	<li>Isolare e crioconservare chondrocytes nasale umano primario (hNC) dai pazienti che seguono il protocollo di riferimento1.</li>
	<li>Scongelare ed espandere hNCs crioconservati e una volta nella cultura dello strato monomolecolare utilizzando standard di coltura a 37 ° C. Staccare le cellule alla confluenza di 80-90% con una soluzione di tripsina/EDTA 0.5% e contare utilizzando un protocollo di esclusione del blu di trypan. Tutti gli esperimenti sono stati condotti utilizzando hNCs al passaggio 2.</li>
	<li>Risospendere il hNCs a 100 x 106 cellule/mL entro 300 µ l di terreno di coltura completato con 10% siero bovino fetale, 1% di penicillina-streptomicina e l'acido ascorbico 50 µ g/mL, in preparazione per la fusione con il bioink.</li>
	<li>Miscela la sospensione cellulare hNC in un nanocellulose/alginato basato bioink segue il passivo protocollo di unità a un rapporto di 10:1 bioink:cell sospensioni per ottenere una concentrazione di cella finale di 9 x 106 cellule/mL di miscelazione.</li>
	<li>Assicurarsi che il bioprinter è sterilizzata tramite esposizione ai raggi UV e pulire con etanolo al 70%. Mantenere la sterilità inserendo in un flusso laminare mobile.</li>
	<li>Allegare sterili stampa ugelli per le cartucce che contengono le miscele di sospensione bioink/cellulare e inserire il bioprinter.</li>
	<li>Calibrare il bioprinter manualmente o mediante i protocolli specifici per la stampante.</li>
	<li>Bioprint il reticolo-strutturato, costrutti carichi di cella utilizzando i seguenti parametri di stampa: ugello conico 25G ad una pressione di 25 kPa. Bioprint cellulare privo di costrutti (mescolati con mezzo cellulare non contenente nessuna cellula) come controllo.</li>
	<li>I costrutti del legame incrociato con l'aggiunta di una soluzione ionica di 100 mM CaCl2 per 5 min, sciacquare i costrutti e procedere all'incubazione in terreno di coltura in condizioni di coltura standard (37 ° C, 5% CO2e 95% di umidità relativa). Modificare i media ogni secondo o terzo giorno.</li>
	<li>Raccogliere i campioni per l'analisi istologica alle settimane 2 e 4. Macchiare i campioni per la produzione di GAG con una macchia blu di Alcian18.</li>
</ol>
5. multimateriali di analoghi di pelle con due tipi di cellule
<ol>
	<li>Disegnare un modello 3D del tessuto desiderato analogico e convertire in un file Gcode per multimateriali. Caricare il file Gcode sulla bioprinter. Nota: Nel presente protocollo, una struttura quadrata con dimensioni 4.8 x 4.8 x 0,9 mm3 è stata esportata come file STL. È stato generato un file Gcode della struttura della grata utilizzando le seguenti impostazioni: spessore dello strato, 0,3 mm; pattern di riempimento, rettilinee; densità di riempimento, 25%; velocità, 10 mm/s.</li>
	<li>Preparare le celle per frullare in bioink per multimateriali. Per la realizzazione di analoghi di pelle, sono stati utilizzati due tipi di cellule. I due tipi cellulari sono stati miscelati nella bioink e multimateriali.<ol>
		<li>Ottenere HDF primario. Mantenere queste cellule in coltura DMEM completati con 10% siero bovino fetale, 1% di penicillina-streptomicina e 50 µ g/mL di acido ascorbico. Staccare le cellule alla confluenza di 80-90% con una soluzione di tripsina/EDTA 0,5% e il conteggio.</li>
		<li>Isolare e crioconservare hNC primarie da pazienti che seguono il protocollo di riferimento1. Scongelare ed espandere crioconservati hNCs nella cultura dello strato monomolecolare. Staccare le cellule alla confluenza di 80-90% con una soluzione di tripsina/EDTA 0,5% e il conteggio.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Risospendere entrambi i tipi cellulari a 100 x 106 cellule/mL all'interno dei media di crescita. Mescolare le sospensioni di cella insieme a un rapporto di 1:1 per ottenere una concentrazione finale totale di 100 x 106 cellule/mL a 300 µ l di media.</li>
	<li>Miscela la sospensione cellulare di 50: 50 di HDF e hNC in un nanocellulose/alginato basato bioink segue il passivo protocollo di unità a un rapporto di 10:1 bioink:cell sospensioni per ottenere una concentrazione di cella finale di 9 x 106 cellule/mL di miscelazione.</li>
	<li>Assicurarsi che il bioprinter è sterilizzato o viene inserito in un flusso laminare mobile per mantenere la sterilità.</li>
	<li>Allegare sterili stampa ugelli per le cartucce che contengono le miscele di sospensione bioink/cellulare e inserire il bioprinter.</li>
	<li>Calibrare manualmente il bioprinter sia o i protocolli specifici per la stampante.</li>
	<li>Bioprint il reticolo-strutturato, costrutti carichi di cella utilizzando i seguenti parametri di stampa: ugello conico 25G ad una pressione di 25 kPa. Bioprint cellulare privo di costrutti (mescolati con mezzo cellulare non contenente nessuna cellula) come controllo.</li>
	<li>I costrutti del legame incrociato con l'aggiunta di una soluzione ionica di 100 mM CaCl2 per 5 min, sciacquare i costrutti e procedere all'incubazione in terreno di coltura in condizioni di coltura standard (37 ° C, 5% CO2e 95% di umidità relativa). Modificare i media ogni secondo o terzo giorno.</li>
	<li>Raccogliere i campioni per l'analisi istologica alle settimane 2 e 4. Macchiare i campioni per il collagene produzione utilizzando tricromica19 di un Masson.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori di questo manoscritto sono dipendenti di CELLINK LLC.

Come dimostrato in questo manoscritto, pre-cellularized bioinks erano bioprinted per fabbricare o cartilagine o pelle analoghi che sono stati coltivati per fino a 4 settimane. Vitalità cellulare dopo fusione utilizzando il passivo unità tecnica di miscelazione era più alta rispetto ai tradizionali metodi di miscelazione. Inoltre, la semplificazione del processo di fusione utilizzando l'unità di miscelazione riduce al minimo il numero di passaggi di gestione e consente maggiore coerenza nella misura di miscelazione. In definitiva, il risultato migliore riproducibilità in entrambi distribuzione delle cellule all'interno del bioink e tra costrutti e gruppi sperimentali. Deposizione di specifici componenti di ECM del tessuto come gag e collagene stavo osservai per la cartilagine e la pelle analoghi, rispettivamente dopo 4 settimane di cultura. Questo indica che la flessibilità sia la tecnica di miscelazione e la geometria di costrutto selezionate per fabbricare gli obiettivi differenti del tessuto. La fabbricazione degli analoghi della cartilagine e la pelle hanno esibito la flessibilità di entrambi l'uso di un bioink di nanocellulose-alginato e la tecnica di multimateriali per obiettivi distinti tessuto ingegnerizzato. Si discuterà di due componenti dello studio qui sotto: (1) il passivo di miscelazione tecnica di unità e (2) il comportamento delle cellule all'interno della cartilagine e pelle analoghi.
Lo sviluppo e l'ottimizzazione di una tecnica per la miscelazione di una sospensione cellulare in un bioink è stato fondamentale per la realizzazione di questi costrutti. A differenza di materiali di idrogel tradizionali a bassa viscosità, l'elevata viscosità della bioinks ha provocato difficoltà nel pre-cellularization di un bioink prima della stampa. In alternativa al tradizionale metodo di incorporazione delle cellule in un bioink, un protocollo per la miscelazione di One-Step di una sospensione cellulare in un viscoso bioink fu sviluppato e discusso. Inoltre, l'applicazione pratica di questa tecnica di miscelazione nella fabbricazione di costrutti di tessuto è stata valutata. Questo approccio di miscelazione di One-Step ha diversi vantaggi rispetto ai tradizionali tecniche incluse controllata miscelazione rapporto di miscelazione, minimizzazione degli sforzi di taglio elevati e irregolare, e un sistema chiuso per eliminare campione chiudere in vasi di miscelazione. Tuttavia, ci sono diversi passaggi critici in questa tecnica per assicurare i suoi vantaggi rispetto ai metodi tradizionali per la fusione delle cellule/bioink. È fondamentale per garantire che le cellule nella siringa cella sono sospesi e ben miscelate prima della miscelazione. Troppo grande di un intervallo di tempo tra il sollevamento e il trasferimento delle cellule nella siringa e partenza il processo di miscelazione può causare le cellule a sedimenti, che si tradurrà in miscelazione irregolare e distribuzione in un filamento stampato. Se sedimentazione è osservata, semplice inversione (2 - 3 volte) dell'assemblaggio del gruppo miscelazione passiva immediatamente prima della miscelazione è sufficiente per risospendere le cellule e garantire una distribuzione uniforme prima della miscelazione. È anche fondamentale che bolle d'aria nelle siringhe vengono eliminate o minimizzati priore per assicurare che il rapporto di miscelazione rimanga costante. Se le bolle d'aria grandi rimangono nella cartuccia bioink prima della fusione, è consigliabile che la soluzione essere eseguita attraverso l'unità di miscelazione un tempo aggiuntivo per garantire la completa miscelazione. Se rimangono bolle d'aria, picchiettando la cartuccia di stampa/siringa può spostare le bolle d'aria residua. Inoltre, se più materiale fusione (parecchie unità di miscelazione o materiali) è necessario per i costrutti più complessi, le concentrazioni delle sospensioni bioinks/cella per essere miscelato devono essere regolate per garantire che dopo diluizione attraverso la miscelazione, il corretto concentrazione finale è ancora raggiunto.
In confronto ad altre tecniche di miscelazione, l'unità di miscelazione passiva è un nuovo approccio alla cellularize bioinks. A differenza di altre tecniche di miscelazione come siringa doppia miscelazione, o mescolando con una spatola o un altro strumento, l'unità di miscelazione passiva permette maggiore coerenza nel mescolamento tra lotti e gli utenti. La natura delle tecniche di miscelazione manuale, ad esempio una spatola miscelazione, si traduce in maggiore user-to-user variazione nella misura di e tasso di miscelazione. Inoltre, sistemi chiusi come il gruppo di miscelazione e siringa doppia miscelazione passiva non hanno poca o nessuna perdita di campione rispetto al manuale di miscelazione all'interno di una capsula di Petri o tubo.
Entrambi gli analoghi di tessuto fabbricati in questo manoscritto è costituito da un unico tipo di bioink e uno o due tipi di cellule. Tuttavia, i multimateriali di analoghi di tessuto che consistono di architetture che contengono regioni di bioinks distinti con tipi distinti delle cellule potrebbero essere necessario per la realizzazione di più fisiologico tessuto costrutti20,21, 22. Più specializzata bioinks con composizioni uniche o funzionalità possono essere generate attraverso la miscelazione di diversi tipi di bioinks esistenti insieme per creare bioinks multimateriale che hanno distinte composizioni o funzionalità23, 24. Questo può essere particolarmente importante alle regioni in transizione dei tessuti come la pelle a livello sottocutaneo o la cartilagine all'osso regione di un tessuto dove una sfumatura del bioink composizione25,26 può essere necessaria per garantire lo sviluppo di queste regioni critiche trovate in tessuti nativi27. Inoltre, un'unità di miscelazione potrebbe essere utilizzata per unire i fattori di crescita e morfogeni in bioinks prima del multimateriali. L'eliminazione della perdita del campione con il sistema di miscelazione chiuso è attraente per l'uso di fattori bioattivi costosi e bassa concentrazione, dove la perdita del campione può provocare un cambiamento alla loro concentrazione finale all'interno del costrutto di bioprinted, in particolare quando le sfumature sono coinvolti.
Una limitazione con qualsiasi tecnica di miscelazione, tra cui il passivo utilizzato in questo studio, unità di miscelazione è il rischio di danni ai tipi cellulari meccanicamente sensibili. Ad esempio isolato cellule staminali tali quelli dal midollo osseo o embrione o cellule staminali pluripotenti indotte sono più suscettibili al danno meccanico28,29. L'atto di miscelazione impartisce anomale sollecitazioni meccaniche sulle cellule dovuto le forze di taglio coinvolte nel processo di miscelazione, e deve essere bilanciate per preservare la vitalità30. Mentre l'uso dei fibroblasti primari e condrociti in questo studio è provocato da buona redditività (Figura 2), ulteriori studi sono necessari per determinare le frequenze di miscelazione sicuro e rapporti per i tipi di cellule più sensibili. Fino ad allora, è consigliabile che la miscelazione essere eseguita sotto un tasso lento costante per massimizzare la redditività. Inoltre, la densità delle cellule selezionata in questo studio è stata determinata basato su precedenti studi1. Questa densità di cella potrebbe non essere ideale per tutti i tipi di cellule.In particolare, le cellule ad una concentrazione superiore di fusione può provocare contatti cellula-cellula aumentata che possono migliorare la vitalità delle cellule e dei tessuti formazione31,32. In una vena simile, l'unità di miscelazione passiva potrebbe essere applicabile per la fusione di sferoidi cellulare o altri aggregati di cellule33 in bioinks.
Come proposto e dimostrato in questo studio, un passivo sistema di unità di miscelazione può rapidamente si fondono con una sospensione cellulare un viscoso bioink. Mentre rimane ancora il rischio di danni meccanici alle cellule, l'approccio consente maggiore coerenza nella miscelazione all'interno di un singolo studio e tra gli utenti. Pre-cellularized bioinks che utilizzano questo approccio sono stati utilizzati per fabbricare entrambi cartilagine e pelle analoghi che sono state coltivate per fino a 4 settimane e ha dimostrato il deposito di marcatori specifici di ECM del tessuto. Gli studi futuri si concentreranno sull'utilizzazione del passivo unità sistema per fondere specializzato bioinks da bioinks standardizzato per la fabbricazione di più complessi analoghi di tessuto di miscelazione.

Negli ultimi anni, la tecnologia tridimensionale (3D) multimateriali è diventata più accessibile ai ricercatori, permettendo la tecnica per diventare più ampiamente utilizzata per la fabbricazione di analoghi del tessuto. Multimateriali promette di rivoluzionare la ricerca biomedica facilitando la realizzazione rapida e ripetibile di costrutti di tessuto multiforme. Il punto cruciale della tecnologia multimateriali depone nella capacità di controllare con precisione la deposizione dei biomateriali (conosciuto come bioinks) in tre dimensioni. Questo permette la generazione di ponteggi complessi con distinte regioni di composizioni di matrice, fattori bioattivi e cellule che possono ricapitolare più accuratamente la struttura del tessuto nativo.
Multimateriali sono stato utilizzato per la realizzazione di costrutti per molte applicazioni di tessuto compreso cartilagine1, pelle2, muscolo3e osso4. Questi tessuti sono attraenti per multimateriali a causa della loro intrinseche striati micro-architetture che sono adatti per ricapitolazione tramite deposizione strato dopo strato. In particolare, la pelle possiede una ben definita struttura multistrato5, che è adatto a fabbricazione mediante tecniche di deposizione a strati come multimateriali. Inoltre, multimateriali possono essere utilizzate per generare costrutti che possiedono le necessarie dimensioni anatomiche e difetto di forme per riparare il tessuto. La capacità di generare biomateriali con paziente-specifiche dimensioni e la forma6 può iniziare ad affrontare la domanda di riparazione parziale di molti tessuti compreso ma non limitato a difetti ossei, danno della cartilagine e lesioni cutanee in cui il limite varia da paziente--paziente.
In questo studio, due analoghi di tessuti (pelle e cartilagine articolare) furono fabbricati attraverso il multimateriali di pre-cellularized bioinks. Miscelazione adeguata di un bioink con sospensione di cellule che possa garantire la distribuzione uniforme delle cellule mentre conservando la vitalità cellulare può essere una sfida. Bioinks adatto per multimateriali tramite estrusione sono spesso altamente viscosi e richiedono pertanto estesa di miscelazione per garantire una miscela omogenea. Danni meccanici alle cellule possono verificarsi in condizioni gravose di miscelazione e influenzare negativamente la vitalità. Gli studi hanno indicato che la maggior parte morte delle cellule durante il processo di stampa a getto d'inchiostro si verifica durante la preparazione come miscelazione7,8. Mentre miscelazione tradizionale con agitazione9 può essere sufficiente per bioinks di bassa viscosità adatto per stampa a getto d'inchiostro10, miscelazione di cellule in un bioink ad alta viscosità più adatto per estrusione multimateriali è più difficile. Affrontare questa esigenza, l'utilizzo di ugelli di miscelazione è diventato più popolare per la miscelazione di bioinks durante il processo stampa11. Questi miscelatori sono state anche ampiamente utilizzati nella ricerca di microfluidica dove la miscelazione di fluidi con basso numero di Reynolds è importante12. L'utilizzo di un continuo processo di miscelazione per fondere una sospensione cellulare in un bioink consentirebbe di uniformità durante il processo di stampa. Tuttavia, poiché le sospensioni delle cellule possiedono bassa viscosità rispetto ad un bioink, sorgeranno difficoltà nel prevenire la sedimentazione delle cellule durante la stampa processo9,13,14. In alternativa, la miscelazione delle cellule in un bioink prima della stampa potrebbe risolvere questo problema.
Per ridurre al minimo la morte delle cellule durante la fusione in un bioink, abbiamo sviluppato una tecnica basata su un'unità di miscelazione passiva per fondere le cellule in un bioink in un numero minimo di passaggi. Il mescolamento caotico generate attraverso il flusso dei materiali attraverso l'unità di miscelazione è sufficiente riproducibile miscela due componenti insieme15,16. Questo metodo è stato sviluppato principalmente per semplificare l'assemblaggio di qualsiasi sospensione cellulare con qualsiasi bioink che adatta per estrusione multimateriali. Il numero di passaggi nel processo di miscelazione è stato minimizzato per eliminare utente per variazione di miscelazione. Passaggi di miscelazione eccessiva possono essere che richiede tempo e non applicabili a tutti i bioinks, in particolare quando sono coinvolte le cellule. Secondario, abbiamo mirato a sviluppare un processo di miscelazione che era autosufficiente sia preservare la sterilità e minimizzare la perdita di campione.
In questo manoscritto, dimostriamo che la fusione di una sospensione cellulare con un bioink utilizzando un passivo unità tecnica che minimizza la gestione ed i risultati in cella ad alta redditività e uniforme distribuzione di miscelazione. Questi bioinks pre-cellularized sono poi utilizzate per bioprint pelle o cartilagine costruire con uno o due tipi di cellule, rispettivamente che vengono coltivati per fino a 6 settimane. La bioink utilizzata è una miscela di alginato-nanocellulose, che in precedenza ha dimostrato l'idoneità per multimateriali1.

<table><tbody><tr><td>Kit STARTINK</td><td>CELLINK</td><td>SK0001</td><td>Kit che conteneva tutti gli elementi per la procedura CELLMIXER</td></tr><tr><td>Live/Dead Kit</td><td>Life Technologies</td><td>L3224</td><td>Kit per l'analisi della vitalità cellulare dopo la miscelazione</td></tr><tr><td>Trichrome</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT15-1KT</td><td>Kit per l'analisi della deposizione di collagene I nei costrutti cutanei</td></tr><tr><td>Alcian Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B8438-250ML</td><td>Kit per l'analisi della deposizione di glicosaminoglicani nei costrutti cutanei Bioprinter</td></tr><tr><td>INKREDIBLE+</td><td>CELLINK</td><td>Gen1+</td><td>Stampante utilizzata nello studio</td></tr><tr><td>DMEM con Glutamax</td><td>Thermofisher</td><td>10566016</td><td>Media per la coltura delle cellule</td></tr><tr><td>10% siero fetale bovino</td><td>Thermofisher</td><td>A3160402</td><td>Media integratore</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td>Integratore multimediale</td></tr> Soluzione di <tr><td>imaging su cellule vive</td><td>Thermofisher</td><td>A14291DJ</td> componente utilizzato utilizzando il microscopio invertito <td>per imaging vivo/morto</td></tr><tr><td></td><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>IX73</td> utilizzato</tr><tr><td>una fotocamera digitale a colori</td><td>Fotocamera per microscopio Olympus</td><td></td> <td>XC10</td> utilizzata</tr><tr><td>software di imaging cellSens</td><td>Olympus</td><td>n/a</td><td>software stock con il microscopio</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>n/a</td><td>software di analisi delle immagini open source</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 7</td><td>GraphPad</td><td>n/a</td><td>software per l'analisi statistica</td></tr><tr><td>Software Slic3r (v1.2.9)</td><td>Slic3r</td><td>n/a software</td><td>open source per convertire il file .stl in gcode</td></tr><tr><td>dermico umano adulto primario fibroblasti</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-012</td><td>fonte cellulare per fibroblasti</td></tr></tbody></table>

multimateriali di cartilagine e pelle tessuto analoghi utilizzando un romanzo passivo unità tecnica di miscelazione per bioink precellularization

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Multimateriali sono una potente tecnica per la realizzazione rapida e riproducibile di costrutti per applicazioni di ingegneria tissutale. In questo studio, gli analoghi di pelle e cartilagine sono stati fabbricati dopo bioink pre-cellularization utilizzando un romanzo passivo unità tecnica di miscelazione. Questa tecnica è stata sviluppata con l'obiettivo di semplificare i passaggi coinvolti nella miscelazione di una sospensione cellulare in un bioink altamente viscosi. La risoluzione di filamenti depositati attraverso multimateriali richiede la garanzia di uniformità nella distribuzione delle cellule prima della stampa per evitare la deposizione delle regioni senza cellule o ritenzione dei cespi di grandi cellule che possono ostruire l'ago. Dimostriamo la capacità di fondere rapidamente una sospensione cellulare con un bioink prima multimateriali di analoghi di pelle e cartilagine. Entrambi gli analoghi del tessuto potrebbero essere coltivati per fino a 4 settimane. L'analisi istologica ha dimostrato sia la vitalità cellulare e deposizione di tessuto specifica matrice extracellulare (ECM) marcatori come collagene e glicosaminoglicani (gag) sono rispettivamente.

Risultati in questo manoscritto sono divisi in due sezioni. In primo luogo, l'attuabilità delle cellule è stata analizzata dopo miscelazione con il metodo meccanico o l'unità di miscelazione passiva. Successivamente, i costrutti di cartilagine e pelle sono stati coltivati ed analizzati per marcatori istologici pertinenti.
Distribuzione delle cellule è apparso omogenea in entrambi i casi. Tuttavia, l'azione di miscelazione a mano con una spatola (Figura 2b) ha più varianza che di miscelazione con un'unità miscelazione passiva (Figura 2a). La misura, la velocità e la tecnica di miscelazione con una spatola dipende fortemente l'utente. Tuttavia, miscelazione di cellule in un bioink con un'unità di miscelazione passiva standardizza la miscelazione e minimizza la variazione in batch. Inoltre, il 30, 60 e 90 s miscelazione tempo può non essere sufficiente per la miscelazione di una grande quantità di cellule in una grande quantità di bioink. Miscelazione più rigorosa through mescolando con una spatola può essere necessario. In confronto, meglio utilizzando un'unità di miscelazione passiva mantiene il rapporto di miscelazione delle cellule di bioink durante la miscelazione e assicura che una miscelazione omogenea viene eseguita. Inoltre, perdita del campione è una preoccupazione con tradizionali tecniche di miscelazione dove bioink può essere lasciato nelle capsule di Petri, tubi e strumenti di miscelazione a causa della loro alta viscosità. L'attuabilità delle cellule era alto per miscelazione con un'unità di miscelazione (&gt; 90%) 1, 2 o 3 volte. Quando l'unità di miscelazione passiva è stato utilizzato, miscelazione ha preso circa 1 min a una velocità di miscelazione costante lenta. Mentre mescolando con una spatola ha esibito ad alta redditività dopo la miscelazione per 30 e 60 s, maggiore di 90 s di miscelazione ha provocato una diminuzione significativa nell'attuabilità rispetto agli altri gruppi (77,9 ± 14%, p &lt; 0.05) (Figura 2c). Questo può essere dovuto eccessiva mescolazione che provoca danni alle cellule. A lungo termine live/dead colorazione dopo 14 giorni e 28 giorni di cultura è mostrato in complementare figura 1. Cellule iniziano diffusione di giorno 14 e sono altamente distribuite dal giorno 28 ed indicano la buona redditività.
Dopo la cultura, gli analoghi di tessuto di pelle e cartilagine sono stati analizzati attraverso l'istologia. Analisi dei costrutti di cartilagine ai giorni 0, 14 e 28 evidenzia un aumento della quantità e copertura di gag come dimostrato attraverso una macchia blu di Alcian (Figura 3a-3_c). L'assenza della macchia è notato al giorno 0, mentre al giorno 14 di macchiatura è limitato ai percorsi prossimale per le cellule. Tuttavia, dal giorno 28 di cultura, il blu di Alcian è trovato in tutto il costrutto, che dimostra la formazione di un chondrocytic ECM. Costrutti di pelle di Bioprinted sono stati analizzati attraverso la macchiatura istologica di collagene che utilizzando la colorazione tricromica di Masson, un (Figura 3d-3f). Simili ai costrutti della cartilagine, campioni di giorno 0 non esposto deposizione di collagene. Da giorno 14 di cultura, cospicui depositi di collagene sono stati notati intorno alle cellule e lungo la superficie del costrutto. Questa è stata ulteriormente migliorata dal giorno 28, come strati di collagene denso sono stati trovati sulla superficie del costrutto e all'interno della massa.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56372/56372fig1.jpg"> 
Figura 1 : Sistema di unità di miscelazione passiva. (un) siringa da 1 mL di sospensione cellulare, (b) 12 mL siringa con gruppo erogatore (c), (d) unità di miscelazione passiva, bioink, (e) di riempimento cartuccia, (f) montaggio della siringa bioink (1) e delle cellule siringa di sospensione (2) nel gruppo erogatore, allegato del gruppo miscelazione passiva alla fine di siringhe (3), allegato (g) del connettore femmina-femmina Luer lock (4) sia allegato della cartuccia di riempimento (5) viene completato il montaggio, (h ) comprimere il gruppo erogatore per adescare la miscelazione unità (6), (io) continuano a spingere verso il gruppo erogatore di mescolare la sospensione cellulare con il bioink e dispensare nella cartuccia di riempimento (7). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56372/56372fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56372/56372fig2.jpg"> 
Figura 2 : Immagini di fattibilità e analisi delle cellule. Immagini rappresentative, mostrando dal vivo (verde) e fibroblasti umani morti (rosso) dopo la miscelazione con il passivo unità 1, 2 o 3 tempi di miscelazione (un) o spatola per 30, 60 o 90 secondi (b) e cultura 3D per 1 giorni. Immagini con un ingrandimento 4x sono indicate. Barre della scala indicano 200 µm. (c) percentuale media vitalità dei fibroblasti umani dopo la miscelazione con il passivo gruppo di miscelazione o spatola e cultura 3D per 1 giorni. Barre di errore indicano la deviazione standard della media, * 0,005. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56372/56372fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56372/56372fig3.jpg"> 
Figura 3: deposizione di matrice extracellulare specifico tessuto. Costrutti di cartilagine Bioprinted macchiato per glicosaminoglicani che utilizzano Alcian blu a (un) giorno 0, (b), 14 e (c), 28. Immagini catturate a 5 ingrandimenti. Costrutti di pelle Bioprinted macchiati per il collagene I utilizzando Trichrome di Masson (d) giorno 0, (e), 14 e (f), 28. Immagini catturate a 5 ingrandimenti. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56372/56372fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/56372/56372supfig1.jpg"> 
Complementare figura 1: la vitalità cellulare al giorno 14 (una) e il giorno 28 (b). Barra della scala è di 200 µm, verde si riferisce per cellule vive, rosso si riferisce le cellule morte. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56372/56372supfig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Cartilagine e pelle analoghi erano bioprinted utilizzando un bioink nanocellulose-alginato basato. Il bioinks erano cellularizzati prima della stampa tramite un'unità di miscelazione passiva di passaggio singolo. I costrutti sono stati dimostrati per essere uniformemente cellularizzati, hanno alta attuabilità e mostre favorevoli marcatori di differenziazione.

Multimateriali di cartilagine e pelle tessuto analoghi utilizzando un romanzo passivo unità tecnica di miscelazione per Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di facilitare la pre-cellularizzazione rapida e riproducibile di bioink per applicazioni di bioprinting, preservando al contempo la vitalità cellulare. Questo metodo può aiutare a semplificare e migliorare la riproducibilità quando si mescola una sospensione cellulare con un bioink per garantire la stampa di cellule vitali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che elimina la nostra capacità di miscelazione miscelando le cellule con un bioink in un sistema chiuso con una manipolazione minima e il rischio di perdita del campione.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, in quanto esiste il rischio di una miscelazione impropria se l'assemblaggio viene eseguito in modo errato. Per iniziare, procurati due siringhe. Una siringa è per la sospensione cellulare mentre l'altra siringa è per il bioink.Il rapporto di miscelazione utilizzato in questo studio è di 10 a uno. Pertanto, utilizzare una siringa da 12 millilitri e una siringa da un millilitro, come richiesto dall'unità di miscelazione 10 a uno. Inoltre, è possibile ottenere un'unità di miscelazione passiva sterile che può essere accoppiata con siringhe doppie tramite una connessione luer lock e un connettore luer lock femmina-femmina sterile.Recupera un'unità di dispensazione in grado di estrudere un volume da due siringhe sterili contemporaneamente a una velocità controllata. Infine, procurati una cartuccia sterile in cui miscelare direttamente il bioink e la sospensione cellulare. In questo protocollo viene utilizzato un inchiostro biologico a base di alginato di nanocellulosa, che viene reticolato attraverso l'aggiunta di una soluzione di cloruro di calcio dopo la stampa.Per preparare le cellule, staccarle utilizzando una soluzione di EDTA allo 0,5% di tripsina. In questo protocollo vengono utilizzati fibroblasti umani. Quindi, conta il numero totale di celle utilizzando il metodo di esclusione del blu di tripano.Determinare la densità cellulare desiderata nel costrutto stampato finale. Calcolare la concentrazione delle cellule raccolte che devono essere diluite per raggiungere questa densità cellulare finale target. In questo protocollo, è stata utilizzata una densità cellulare finale di cinque milioni di cellule per millilitro.Trasferire la sospensione cellulare nella siringa di sospensione cellulare. Trasferire anche il bioink nell'altra siringa. Quindi, tirare indietro lo stantuffo della siringa bioink e inserire la siringa nell'unità di erogazione.Assicurarsi che almeno la metà del volume nelle siringhe estraibili sia aria sterile proveniente dall'interno della cabina di sicurezza biologica. È importante che le posizioni degli stantuffi della siringa siano mantenute durante l'inserimento nell'unità di erogazione. Posizionare l'unità verticalmente con il connettore luer lock rivolto verso l'alto.Quindi tirare indietro lo stantuffo della siringa cellulare a una lunghezza simile a quella della siringa bioink e inserirla nell'unità di erogazione. Assicurarsi che non vi siano scariche accidentali della sospensione cellulare o del bioink assicurandosi che l'unità di miscelazione sia fissata uniformemente alle due siringhe. Ricontrolla prima di mescolare.Collegare entrambe le siringhe all'unità di miscelazione ruotando i connettori luer lock. Quindi adescare il sistema di miscelazione spingendo sull'unità di erogazione per estrudere l'aria nella siringa. Arrestare l'adescamento prima che la soluzione raggiunga il luer lock.Dopo l'adescamento, collegare la cartuccia di riempimento all'estremità dell'unità di miscelazione tramite il connettore luer lock. Assicurarsi che lo stantuffo nella cartuccia di riempimento sia nella parte inferiore prima del fissaggio. Comprimere lentamente l'unità di erogazione per miscelare l'inchiostro biologico e la sospensione cellulare nella cartuccia.Spingere lo stantuffo nella cartuccia di riempimento verso il basso con una punta di pipetta sterile per entrare in contatto con la miscela di cellule bioink dopo la miscelazione. Mantenere l'unità di erogazione compressa per garantire che la miscela di bioink cellulare non venga estrusa nuovamente nell'unità di miscelazione. Chiudere la cartuccia e picchiettare delicatamente sulla superficie di lavoro per spostare eventuali bolle d'aria verso la parte superiore della cartuccia.A questo punto, la miscela di bioink cellulare è pronta per la stampa. In questo protocollo, una struttura quadrata con dimensioni di 4,8 x 4,8 x 0,9 millimetri cubi è stata esportata come file di stereolitografia. È stato generato un file g-code della struttura reticolare utilizzando le impostazioni presenti nel protocollo di testo.Isolare e crioconservare i condrociti nasali umani primari, o HNC, dai pazienti, seguendo il protocollo di riferimento. Scongelare ed espandere gli HNC crioconservati ed espanderli una volta in una coltura monostrato utilizzando un terreno di coltura standard a 37 gradi Celsius. Staccare le cellule all'80%-90% di confluenza con una soluzione di EDTA di tripsina allo 0,5% e contare utilizzando un protocollo di esclusione del blu di tripano.Tutti gli esperimenti sono stati condotti utilizzando HNC al passaggio due. Sospendiamo gli HNC a 100 milioni di cellule per millilitro entro 300 microlitri di terreno di coltura, integrati con il 10% di siero fetale bovino, l'1% di penicillina streptomicina e 50 microgrammi per millilitro di acido ascorbico in preparazione per la miscelazione con il bioink. Miscelare la sospensione cellulare HNC in un bioink a base di alginato di nanocellulosa, seguendo il protocollo dell'unità di miscelazione passiva con un rapporto di 10 a uno tra bioink e sospensione cellulare, per ottenere una concentrazione cellulare finale di nove milioni di cellule per millilitro.Assicurarsi che la biostampante sia sterilizzata tramite esposizione ai raggi UV e pulirla con etanolo al 70%. Mantenere la sterilità posizionando la biostampante nella cabina a flusso laminare. Quindi collegare gli ugelli di stampa sterili alle cartucce contenenti le miscele di sospensione cellulare bioink e inserirle nella biostampante.Dopo aver calibrato la biostampante, biostampare i costrutti carichi di cellule strutturate a reticolo utilizzando l'ugello conico calibro 25 a una pressione di 25 kilopascal. Costrutti privi di cellule Bioprint come controllo. Reticolare i costrutti aggiungendo una soluzione ionica di 100 millimer o cloruro di calcio.Dopo cinque minuti, risciacquare i costrutti. Quindi incubare i costrutti nel terreno di coltura in condizioni di coltura standard, cambiando il terreno ogni due o tre giorni. Raccogli campioni per l'analisi istologica alla seconda e alla quarta settimana.Colorare i campioni per la presenza di glicosaminoglicani, o produzione di GAG, utilizzando una colorazione blu alciana. Di seguito è illustrata la vitalità cellulare 24 ore dopo la miscelazione con l'unità di miscelazione passiva o con una tecnica di miscelazione manuale. L'unità di miscelazione passiva ha mostrato una migliore vitalità, poiché l'entità della miscelazione è stata aumentata.Questo è importante perché potrebbero essere necessari tempi di miscelazione più lunghi quando si preparano grandi lotti di bioink precellularizzati. Qui è mostrata la vitalità cellulare al giorno 14 e al giorno 28 della coltura. Viene visualizzata una buona vitalità cellulare, che mostra la sopravvivenza cellulare a lungo termine quando viene utilizzata questa tecnica.I glicosaminoglicani sono visualizzati in costrutti di cartilagine biostampati, colorati con blu alciano, ai giorni zero, 14 e 28. Queste immagini dimostrano la formazione di neocartilagine all'interno di questi costrutti biostampati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti se eseguita correttamente.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare un sistema di unità di miscelazione passivo per cellularizzare i bioink. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del bioprinting per cellularizzare rapidamente e uniformemente i bioink con una tecnica di miscelazione delicata.

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