Name: Seconda generazione di armoniche segnali coniglio sclera come strumento per la valutazione del tessuto terapeutico reticolazione (TXL) per la miopia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Impara la microscopia di seconda armonica per visualizzare il cross-linking del collagene nel tessuto sclerale del coniglio. Questo metodo non invasivo valuta gli effetti dell'agente rilasciante formaldeide con calorimetria differenziale a scansione.

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Gli autori ringraziano Tongalp Tezel, MD, per la consultazione per quanto riguarda sT iniezione; Theresa Swayne, PhD, di consultazione in proposito SHG microscopia; e Jimmy Duong dal Design e Biostatistica risorsa e la funzione di memoria di biostatistica dell'Irving Institute presso la Columbia University Medical Center.
Supportato in parte dalla ricerca per prevenire la cecità e da istituti nazionali di salute sovvenzioni NCRR UL1RR024156, nia P30 EY019007, NCI P30 CA013696 e NEI R01EY020495 (DCP). Columbia University possiede proprietà intellettuale correlati: US rilasciati brevetti no: 8.466.203 e no: 9.125.856. In attesa di brevetto internazionale: PCT/US2015/020276.
Immagini sono state raccolte nel confocale e specializzata di microscopia Shared Resource di Herbert Irving Comprehensive Cancer Center presso la Columbia University, supportato da NIH concedere #P30 CA013696 (National Cancer Institute). Il microscopio confocale è stato acquistato con NIH concedere #S10 RR025686.

Tutte le procedure sono state effettuate utilizzando gli occhi dei conigli cadaverico all'interno di teste di coniglio nazionali intatto. Sono state seguite tutti istituzionale e nazionale le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. preparazione delle soluzioni
<ol><li>Preparazione di SMG per TXL:<ol>
<li>Preparare 1 mL di concentrazione di 0,2 M di soluzione di bicarbonato di sodio soluzione (NaHCO3) utilizzando 0,0165 g di NaHCO3 polvere disciolta in 1 mL di acqua distillata.</li>
		<li>Sciogliere 0,1016 mg di sodio in polvere hydroxymethylglycinate (SMG) in 1 mL di acqua distillata per ottenere una concentrazione finale di 800 mM SMG. Regolare la soluzione di bicarbonato di sodio ad una concentrazione finale di 0.1 M NaHCO3 e 400mm SMG. Concentrazioni di SMG secondo l'effetto di cross-linking desiderato. Nel protocollo descritto qui abbiamo usato 40, 100 e 400 mM SMG.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. iniezione di del subTenon per TXL utilizzando SMG
<ol><li>Riempire due siringhe da insulina 1 mL (aghi 25g) con 400 µ l controllo e soluzione SMG, rispettivamente.</li>
	<li>Posizionare testa del coniglio su un piano di profilo con l'aiuto di un cuscino. Schiuma di stirolo o una pila di carta può essere utilizzata per fissare la testa in una posizione ottimale.</li>
	<li>Ritirare le palpebre con uno speculum oculare pediatrica.</li>
	<li>Misurare l'iniziale pressione intraoculare (IOP) utilizzando un dispositivo di tonometria ad applanazione.</li>
	<li>Segnare il sito di iniezione desiderato nella parte centrale superiore del limbus con un indicatore del tessuto.</li>
	<li>Ritrarre la congiuntiva che circondano il sito di iniezione con un forcipe congiuntiva (o qualsiasi pinza con punta tonda seghettata) e inserire l'ago attraverso la congiuntiva, entrando la capsula di tenone solo leggermente oltre il sito di limbal contrassegnato (cioè, 2-3 mm dal limbus). Una piccola incisione nel conjunctiva può essere fatta anche con forbici iris al fine di facilitare il passaggio dell'ago attraverso la capsula di tenone.</li>
	<li>Una volta all'interno della capsula di tenone, assicurarsi che l'ago sia liberamente mobile spostandolo laterale. Durante questo tempo, il mondo non deve muoversi. Questo conferma il corretto posizionamento dell'ago sopra la sclera nel sub-Tenon (sT) spazio.</li>
	<li>Iniettare la soluzione dalla siringa e gettare l'ago. Immediatamente dopo l'iniezione, il fluido si accumula nello spazio sT creando un rigonfiamento anteriore visto attraverso la congiuntiva (cioè, la chemosi).</li>
	<li>Ripetere la misura dello IOP al fine di confermare che non è cambiato a causa di una perforazione eventuale del globo.</li>
	<li>Rimuovere lo speculum coperchio ed eseguire massaggio digitale attraverso le palpebre chiuse per circa 2-3 min.</li>
	<li>Lasciare la testa per un periodo di incubazione di 3,5 h (temperatura = 18 ° C), prima di passare al passaggio successivo.</li>
</ol>3. tessuto preparazione
<ol><li>Ritirare le palpebre utilizzando lo speculum palpebra al fine di ottimizzare l'accesso al globo. Selezionare lo speculum in modo ottimale dimensione secondo la dimensione dell'occhio.</li>
	<li>Separare la congiuntiva che circondano il limbus. Se è già stata incisa nei pressi del sito di iniezione, lungo la circonferenza di espandere i confini in modo conterrebbe una dimensione di inoculo di circa 1 x 1 cm.</li>
	<li>Tagliare i muscoli extra-oculari presso i loro siti d'inserzione sclerale.</li>
	<li>Elevare il bulbo oculare con il forcipe, spingendola dal lato posteriore. Questo fornisce l'accesso a globo posteriore e faciliterà il taglio del nervo ottico con arteria oftalmica e la vena che si trova vicino al polo posteriore del globo.</li>
	<li>Ritagliare il corneoscleral complesse, con il bordo esterno, compreso il sito di iniezione contrassegnato. La macchia dovrebbe essere ancora visibile sulla parte restante della sclera.</li>
	<li>Rimuovere il corpus vitreus e tutti gli strati attaccati al lato interno della sclera applicando trazione con pinze. Nota: Ulteriori passi dipendono le seguenti procedure in corso: 4. - analisi DSC, 5. - microscopia SHG.</li>
</ol>4. per analisi DSC regionale
<ol><li>
Per occhio trattato: tagliato quattro settori scleral dalla tazza scleral rimanente con le forbici, affinché il sito di iniezione è situato nel settore superiore e allineato centralmente. Tagliare i rimanenti 3 settori da entrambi i lati (cioè, nasale e temporale) e il fondo. Nota: la numerazione dei settori (1-4) che sono ulteriormente divisi in squadre (1-16) è illustrata nella Figura 1A.</li>
	<li>I settori sclerali (1-4) tagliate a quadrati più piccoli (1-16) di circa 4 x 4 mm. Settore 1 dovrebbe essere diviso in 9 quadrati (rendere il luogo esatto dell'iniezione un'individuale dalla piazza [2]). Dividere i settori 2 e 3 in 2 quadrati ciascuno (piazze 10-11 e 12-13) e 4 in 3 piazze (quadrati 14-16).</li>
	<li>Assegnare un numero a ogni quadrato, come mostrato in Figura 1A, allo scopo di localizzare la distanza del tessuto analizzato dalla posizione del sito di inoculo.</li>
	<li>
Per l'occhio di controllo: dopo dividere il tessuto in quattro settori scleral (simile al tessuto trattato) tagliato a pezzi quadrati di tessuto dai seguenti percorsi: 3 piazze dal top del settore (settore 1), 1 da ogni lato (settori 2 e 3) e 1 dalla settore di fondo (settore 4).</li>
	<li>Raschiare i restanti strati della retina e della coroide e lavare due volte con PBS fresco ogni volta, lasciando i pezzi immersi nella soluzione per circa 10 s alla volta.</li>
</ol>5. per l'Imaging di SHG
<ol><li>Tagliare la parte superiore della sclera con le forbici per creare un'area di 1 x 1 cm con il sito di iniezione allineate centralmente.</li>
	<li>Raschiare i restanti strati della retina e coroidico e lavare due volte con PBS fresco ogni volta lasciando i pezzi nella soluzione per circa 10 s.</li>
	<li>Posizionare il tessuto in provette da 1 mL riempite con soluzione di PBS per il trasporto al centro di imaging. Tutte le procedure, seguendo il tempo di incubazione e cominciando con la dissezione del bulbo oculare devono essere eseguite entro un'ora.</li>
</ol>6. microscopia protocollo
Nota: Questo protocollo per imaging segnale SHG retro-sparsi da collagene del tessuto di sclera è su misura per il microscopio a scansione laser.
<ol><li>
Impostare la microscopia
	<ol>
<li>Per massimizzare il segnale e risoluzione quando eseguire la microscopia SHG utilizza una lente obiettiva ottimizzare per trasmettere all'infrarosso, leggera e con un'apertura numerica elevata (NA). Il nostro obiettivo è Nikon Apo LWD 25 x / NA1.1 acqua immersione.</li>
		<li>Regolare il collare di correzione della lente per abbinare la profondità del campione, in questo caso che è lo spessore del vetrino coprioggetto, 0,17 millimetri.</li>
		<li>Montare la lente dell'obiettivo 25X e aggiungere una generosa quantità di gel a base acquosa per coprire la superficie di imaging prima di montare il campione di lubrificazione. Il gel a base acquosa non evapora durante l'esperimento e quindi manterrà la qualità dell'immagine.</li>
		<li>Posizionare il tessuto sclerale da una provetta 1 mL con PBS senza seccare tra due lamelle rotondo 25 mm (lato episcleral giù) fornendo massima di contatto tra l'episclera e la superficie del vetrino coprioggetti. Nota: Il tessuto posizionabile anche scoperto il coprivetrino. Una buona quantità di PBS dovrebbe mantenere i tessuti idratati durante la formazione immagine. In questo caso, aggiungere il pezzo di tessuto e il PBS dopo il montaggio del cellchamber.</li>
		<li>Assemblare la camera cellulare inserendo un coprioggetto rotondo 25 mm, singolo o in una tecnica sandwich, sulla parte inferiore dell'alloggiamento e avvitare la parte superiore al fine di creare un contenitore sigillato tondo camera. Non avvitare strettamente quando una lamella superiore è usata, per evitare l'appiattimento artificialmente e danneggiare il tessuto.</li>
		<li>Montare la camera di cella con il campione di tessuto sul tavolino del microscopio.</li>
		<li>Impostare il microscopio per la vista con luce trasmessa.</li>
		<li>Posizionare il tavolino e regolare l'altezza dell'obiettivo in modo che la superficie inferiore del campione è a fuoco, come determinato dalla ispezione in campo luminoso attraverso l'oculare.</li>
		<li>Spegnere tutte le luci tranne il monitor del computer e blocco quanta più luce dal monitor possibile con fogli di lamina di alluminio drappeggiati sul tavolino del microscopio. Riducendo al minimo qualsiasi luce parassita raggiungendo i rivelatori garantirà acquisizione basso rumore, come i rilevatori di GaAsP NDD hanno alta sensibilità.</li>
		<li>Nel pannello Ti Pad del software, controllare che la definizione di lente è corretta.</li>
		<li>Nel pannello A1 Compact GUI, scegliere il laser IR per l'imaging, selezionare i rilevatori NDD e scegliete il canale DAPI che è dotato di un filtro passa-banda di 400-450 nm.</li>
		<li>Nel pannello A1 MP GUI, impostare la lunghezza d'onda del laser infrarosso a 860 nm e aprire l'otturatore.</li>
		<li>Impostare come segue le condizioni nel pannello A1 Compact GUI di scansione laser. Selezionare: (a) Galvano scanner, scansione (b) unidirezionale, (c) Pixel dwell tempo 6.2 µs, (d) struttura dimensioni 1.024 x 1.024 pixel, (e) linea una media di 2 x Nota: Lo scanner di Galvano e scansione unidirezionale assicura un allineamento preciso punto per punto. Una dimensione pari a 1.024 x 1.024 per tutto il campo visivo si traduce in una dimensione di pixel di 0,5 μm /pixel. Con una media di linea ridurrà il rumore shot nell'immagine.</li>
		<li>Condizioni impostate imaging nel pannello A1 Compact GUI regolando la potenza del laser e rilevatore di guadagno. Aprire il pannello di Look Up Table (LUT) che visualizza un istogramma dei valori di intensità di pixel nell'immagine corrente. Girare su formazione immagine dal vivo in modalità "Trovare" e massimizzare la gamma rilevata dei valori dei pixel regolando il guadagno di potenza e rilevatore laser. Evitare la saturazione. I valori tipici sono 2,5% potenza del laser, da un totale di 2,35 W a 860 nm e 100 HV (rivelatore guadagno).</li>
		<li>Nota: Per questa configurazione, la potenza del laser misurata con un misuratore di potenza interno è di 5,2 mW. Ogni volta che viene eseguito un esperimento, ri-regolare la percentuale di laser tale che la misura di alimentazione interna è costante a 5.2 mW tra le sessioni di formazione immagine. Deve prestare attenzione quando si imposta la potenza del laser. Il laser di camaleonte II è un laser 3 W a 800 nm e un 10% o maggiore potenza potrebbe potenzialmente indurre danni ai tessuti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Acquisizione di immagini
	<ol>
<li>In modalità anteprima, scan l'area di tessuto utilizzando lo strumento Panoramica XYZ.</li>
		<li>Impostare la formazione immagine a bassa risoluzione (256 x 256 pixel e non in linea media) per accelerare l'acquisizione di immagini in questa modalità.</li>
		<li>Cattura 5 x 5, 3x3 o singoli campi di vista per coprire tutta la superficie del tessuto. In ogni località, prima della cattura di panoramica, attivare la modalità "Scan" dal vivo e mettere il tessuto a fuoco. Si noti che diverse regioni del tessuto avranno posizioni leggermente diverse in direzione assiale.</li>
		<li>Trovare una zona pianeggiante, dove le fibre di collagene sono visti nell'intero campo visivo e fare doppio clic su tale posizione nello strumento per spostare il palco in quella particolare posizione panoramica.</li>
		<li>Attivare la modalità "Scan" live, regolare la posizione Z dell'obiettivo in modo che il piano inferiore è a fuoco e, nel riquadro Ti, è necessario utilizzare unità Z per spostare il piano ottico 10-15 μm sopra questo strato di fondo.</li>
		<li>Acquisire un'immagine ad alta risoluzione con 1.024 x 1.024 pixel e 2 x linea, in media, utilizzando il pulsante "Cattura".</li>
		<li>Salvare la posizione nella panoramica XYZ utilizzando il pulsante "+". Questo assicura che la stessa area del tessuto non è riconquistata.</li>
		<li>Per ogni pezzo di tessuto catturare 10 immagini non sovrapposte campi di vista.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. DSC protocollo
Nota: Procedere a questo passo come preparazione dei tessuti è completa, per analisi DSC regionale, o dopo tessuto imaging quando SHGM viene eseguita.
<ol><li>Preparare padelle DSC, pesati ed etichettati. Nota: Questo passaggio deve essere effettuato prima della dissezione del tessuto al fine di minimizzare il loro disseccamento dei tessuti.</li>
	<li>Asciugare ogni quadrato scleral con un panno assorbente e adagiarlo piatta sul fondo di una padella di DSC utilizzando forcipe dentato.</li>
	<li>Pesare la padella con il tessuto all'interno e il coperchio aggraffato e coperto per ottenere il tessuto bagnato peso (massa dei campioni dovrebbe essere nella gamma di mg 5 a 11). Nota: Ogni guarnizione vaschetta utilizzando il piegatore prima di procedere con il prossimo campione di tessuto. Le pentole sono ermeticamente sigillate, per prevenire ogni perdita di acqua prima dell'analisi termica.</li>
	<li>Una volta che il campione è aggraffato, collocarlo sulla sua sede indicata sul vassoio DSC. Ci dovrebbe essere 6 campioni per il controllo e 16 per occhio trattato.</li>
	<li>Creare un metodo utilizzando strumento software di gestione, specificando il peso del tessuto, ed eseguire l'analisi termica utilizzando i seguenti parametri: gamma di Temperature di 40-80 ° C, velocità di riscaldamento: 1 ° C/min, flusso di calore: 17,37 mW, il flusso di Gas (N2): 19,8 mL/min, Pressione del gas: 2,2 bar.</li>
	<li>Una volta completato, è possibile analizzare i dati per ciascun campione estraendo il picco di temperatura di transizione a cui denaturazione termica si verifica utilizzando lo strumento di gestione del software.</li>
</ol>8. image Analysis
<ol><li>
Segnale SHG
	<ol>
<li>Selezionare almeno 5-10 delle immagini più rappresentative di ogni trattamento e relativo controllo, tale che l'area dell'immagine è occupata da principalmente fibre di collagene.</li>
		<li>Caricare ogni immagine nel software ImageJ e misurare l'intensità di pixel medi selezionando Analyze > misura per l'immagine attiva.</li>
		<li>I valori estratti vengono segnalati come l'intensità media pixel e possono essere mostrati anche tracciando l'istogramma dell'intensità selezionando dal menu Analyze > istogramma.</li>
		<li>Utilizzando un foglio di Excel, creare una tabella per documentare tutti i dati misurati in conseguenza all'ID del campione.</li>
		<li>Calcolare la media e la deviazione standard di intensità di pixel per ogni condizione di trattamento e controllo.</li>
		<li>Utilizzo dello studente t-test, confrontare le differenze per tutti i confronti a coppie delle concentrazioni (cioè, 40 millimetri SMG contro 0 e 400 mM SMG vs 0). [P ≤ 0,05].</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ondulazione
	<ol>
<li>Selezionare un'immagine che visualizza le fibre di collagene. Almeno 10 immagini al campione devono essere analizzati (compreso un campione di controllo per ciascuna concentrazione - almeno 40 in totale).</li>
		<li>Aperto ImageJ > Plugins > NeuronJ. NeuronJ richiede l'installazione preventiva.</li>
		<li>Caricare tutti i imagesby trascinando in una finestra aperta di NeuronJ .</li>
		<li>Creare linee di tracciatura lungo le fibre, seguendo il profilo della fibrilla con il mouse (penna tavolette grafiche potrebbe essere utilizzata), fare clic su M per misurare la distanza della lunghezza totale della fibra.</li>
		<li>Selezionare "Opzione" per disegnare una linea retta tangente e collegare l'inizio e la fine del contorno della fibra precedentemente disegnato. Ora fare clic su M per misurare la lunghezza di end-to-end.</li>
		<li>Ripetere la stessa procedura su almeno 10 fibrille per immagine.</li>
		<li>Raccogliere quei due misurazioni da ciascuno dei 10 fibrille e inserire i dati in un foglio di calcolo excel, esprimendo la lunghezza totale della fibra (contorno) ed end-to-end (rette di connessione linea) come lunghezza [curva] e [lineare], rispettivamente.</li>
		<li>Calcolare l'indice di ondulazione (W) utilizzando la formula: W = Lunghezza [curva] / Lunghezza [lineare].</li>
		<li>Calcolare la % di ondulazione confrontando dati dalle immagini di samples(SMG) trattata con le immagini da campioni di controllo utilizzando la formula: (W [SMG] - 1) / (W [controllo] - 1)</li>
		<li>Eseguire un test t pairwise per indice di ondulazione (W) al fine di determinare le differenze statistiche (valori di p) della morfologia delle fibre collagene tra diverse condizioni di trattamento e controllo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Esperimenti condotti hanno dimostrato la prova sostiene l'uso di microscopia SHG segnale come un metodo per la valutazione di cross-linking effetti sclera, sollevando la possibilità futura di usare questa tecnica come strumento di monitoraggio per trattamenti di cross-linking del collagene che destinazione proteine del collagene. Della nota, uno strumento è già in uso clinico che potenzialmente in grado di catturare questo segnale SHG. Anche se questo strumento è stato progettato principalmente per imaging derma di pelle...

Miopia progressiva è postulata per essere curabile attraverso reticolazione scleral non enzimatici (fotochimica e/o chimica), che ha un senso dato che bloccando la reticolazione del collagene enzimatica può aumentare la privazione di forma sperimentale (FD)-indotta miopia1. ElSheikh e Phillips2 recentemente discusso la fattibilità e il potenziale di utilizzo standard irradiazione ultravioletta-A (UVA)-riboflavina mediata reticolazione fotochimica (noto anche come il protocollo di Dresda), abbreviato qui come (riboflavina CXL) per stabilizzazione scleral posteriore fermare allungamento assiale nella miopia. Questo metodo fotochimico è stato utilizzato con successo per il trattamento di destabilizzazione della superficie anteriore del globo (cioè, la cornea sporgente) vista in keratectasia cheratocono e alberino-LASIK. Tuttavia, applicazione del presente protocollo CXL per la sclera è ostacolata da questioni legate alla difficoltà di accesso alla sclera posteriore con una sorgente di luce ultravioletta (UV), come pure la necessità di modificare una molto tessuto superficie maggiore. Che essendo detto, l'approccio CXL è stato utilizzato per fermare allungamento assiale visivamente modulo privato conigli (da tarsorrhaphy), anche se le regioni multiple di sclera posteriore richiesto più zone di irradiazione separati in quello Studio3. Al contrario, l'iniezione di un agente chimico di stabilizzazione (cioè, agente reticolante) tramite lo spazio di sT potrebbe rappresentare un modo più semplice per modificare la sclera posteriore, evitando la necessità di introdurre una fonte di luce UV. Questa tecnica di iniezione è ben nota come un modo utile di indurre anestesia oculare durante le procedure oftalmologiche ad esempio cataratta chirurgia4,5,6. WOLLENSAK7 ha descritto in precedenza l'uso di un'iniezione di sT utilizzando gliceraldeide (un cross-linking agente chimico simile nel concetto alla formaldeide distaccanti (FARs) descritti in questo studio) per irrigidire il coniglio sclera e Genipina ha dimostrato di limitare la lunghezza assiale in FD cavie8,9. Questi ricercatori hanno dimostrato un chiaro vantaggio dell'utilizzo di un agente chimico solubile rispetto la tecnica CXL fotochimica. Così, scleral reticolazione utilizzando un agente chimico iniettabile di qualche tipo, tra cui la FARs (cioè, TXL)10, potrebbe fornire un metodo di trattamento fattibile per arrestare la progressione dell'allungamento scleral visto nella miopia.
Nei protocolli presentati qui, usiamo una soluzione reticolazione chimica di sodio hydroxymethylglycinate (SMG), consegnata tramite iniezione sT allo sclera degli occhi di coniglio cadaverico. Abbiamo implementato protocolli simili precedentemente per la reticolazione chimica d'attualità nella cornea. In particolare in quegli studi precedentemente segnalati, concentrazione-dipendente di cross-linking effetti poteva essere ottenuta utilizzando SMG, con un intervallo di effetto che si estende ben superiore a quella ottenibile con CXL fotochimica, come determinato mediante analisi di denaturazione termica11 .
Qui descriviamo protocolli per valutare l'effetto di cross-linking di SMG consegnati tramite iniezioni di sT al tessuto sclerale, denaturazione termica mediante calorimetria a scansione differenziale (DSC) e la seconda armonica generazione microscopia (SHGM).
Mediante calorimetria a scansione differenziale (DSC), noto anche come analisi termica, una transizione di denaturazione termica è misurata, che per il tessuto sclerale è prevalentemente guidato dalle proprietà di collageni fibrillari, poiché essi costituiscono la maggioranza di massa della proteina. Questo metodo consente di valutare la stabilità della struttura molecolare del collagene e i legami cross-linked che stabilizzano le fibrille di collagene, la struttura principale e terziaria della proteina. Durante il riscaldamento nel DSC, si raggiunge una temperatura di transizione critica che provoca la denaturazione della molecola del collagene, con conseguente srotolamento della tripla elica, un processo che forma ciò che è comunemente noto come gelatina. La denaturazione termica interrompe legami idrogeno lungo la molecola di collagene e può essere spostata a temperature più elevate attraverso indotta cross-linking metodi12,13. Questo metodo è stato utilizzato per molti decenni, in particolare nel settore dei biomateriali e per i processi che includono cuoio-fare. Tuttavia, questo metodo richiede l'estrazione del tessuto sclera e pertanto può essere solo utile come tecnica di ex vivo .
Microscopia di generazione di seconda armonica (SHGM) si basa sulle proprietà ottiche non lineari di materiali particolari, con ambienti molecolare non-centrosimmetrici. In tale materiale, luce intensa, ad esempio luce prodotta dai laser, genera segnali SHG, in cui la luce incidente è raddoppiata in frequenza. Materiali biologici che sono noti per creare segnali SHG sono collagene, microtubuli e miosina muscolare. Ad esempio, collagene eccitato con una luce infrarossa di lunghezza d'onda di 860 nm emette un segnale SHG nel campo visibile con lunghezza d'onda di 430 nm. Seconda generazione armonica (SHG) segnale imaging è un promettente metodo per valutare la reticolazione del collagene terapeutico. Esso è stato conosciuto per più di 30 anni che le fibrille di collagene nei tessuti emettono SHG segnali14. Tuttavia, solo recentemente immagini ad alta risoluzione si otteneva15 in una varietà di tessuti, compreso il tendine16, pelle, cartilagine17, vasi sanguigni18e in collagene gel19.
Basati su questa conoscenza, questo studio valuta i cambiamenti del segnale SHG indotti nella sclera attraverso SMG chimicamente indotta cross-linking del collagene. I risultati indicano che SMG modifica dello sclera aumenta i segnali SHG prodotti da fasci di fibre collagene del tessuto (il più alto ordine struttura quaternaria composta da fibrille collagene) e produce anche un cambiamento morfologico strutturale del collagene rete in fibra ottica, riflessa in fibra bundle "raddrizzare".

<table><tbody><tr><td>SINTESI MILLI-Q A10 120V</td><td>EMD Millipore, Massachusetts, USA</td><td></td><td>Acqua deionizzata a doppia distillazione. - fase del protocollo 1.1.1</td></tr><tr><td>Idrossimetilglicinato di sodio&nbsp;</td><td>Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA</td><td></td><td>Reagente reticolante - fase del protocollo 1.1.2</td></tr><tr><td>Ago per iniezione con siringa luer-lock</td><td>BD Eclipse, NJ, USA</td><td></td><td>Siringa per iniezione di subtenone. - fase del protocollo 2.1</td></tr><tr><td>Testa di coniglio</td><td>Pollame La Granja</td> Testa di coniglio <td>di razza separata</td><td>e consegnata entro 1 ora post mortem. - fase del protocollo 2.2</td></tr><tr><td>Tono-pen&nbsp;</td><td>Reichter Technologies Depew, NY</td><td></td><td>Misure IOP - fase del protocollo 2.4</td></tr><tr><td>Autocampionatore DSC 6000</td><td>Perkin-Elmer Waltham, MA, USA</td><td></td><td>Analizzatore di denaturazione termica - fase del protocollo 7.4</td></tr><tr><td>Software Piris&nbsp;</td><td>Perkin-Elmer, Waltham, MA, Stati Uniti</td><td>Ver 11.0</td><td>&nbsp; passo del protocollo 7.5</td></tr><tr><td>CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td><td></td><td>Un obiettivo a immersione in acqua con elevata trasmittanza IR con una distanza di lavoro di 2,0 mm - passo del protocollo 8.1.1.</td></tr><tr><td>GenTeal&nbsp;</td><td>Alcon, Fort Worth, Texas.</td><td>B000URVDQ8</td><td>Gel a base d'acqua utilizzato come mezzo di immersione oggettivo al posto dell'acqua per prevenire l'evaporazione - 8.1.1</td></tr><tr><td>Chameleon Vision II&nbsp;</td><td>Coherent, Santa Clara, CA, USA</td><td></td><td>Laser pulsato Ti:Zaffiro con una larghezza di impulso di 140 fs a 80 MHz e un intervallo di regolazione da 680 nm a 1080 nm. - fase del protocollo 8.1.11</td></tr><tr><td>Camera cellulare AttoFluor</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>A7816</td><td>Fissazione del vetrino coprioggetto - fase del protocollo 8.1.3</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti rotondi da 25 mm, #1.5</td><td>Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, Protocollo USA</td><td>GG-25-1.5</td><td>passaggio 8.1.3</td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY, passaggio del protocollo USA</td><td></td><td>8.1.4.</td></tr><tr><td>Rivelatore GaAsP non descansionato (NDD)</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td><td></td><td>Dotato di un filtro passa-banda da 400-450 nm - passaggio del protocollo 8.1.7</td></tr><tr><td>Sistema di scansione laser A1R-MP</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td><td></td><td>Compatibile con l'eccitazione multifotone a infrarossi (IR). - passaggio del protocollo 8.1.8</td></tr><tr><td>Software NIS Elements</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td><td>Ver 4.3</td><td>indicato come "software" nel testo - protocollo passo 8.1.9</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td>&nbsp; fase del protocollo 9.1.2</td></tr><tr><td>NeuronJ</td><td>Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, Paesi Bassi</td><td></td><td>https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, per la fase del protocollo 9.2.2</td></tr><tr><td>Microsoft Excel&nbsp;</td>Passaggio del protocollo <td>Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA</td><td>Ver 14</td><td>9.2.8</td></tr></tbody></table>

seconda generazione di armoniche segnali coniglio sclera come strumento per la valutazione del tessuto terapeutico reticolazione (txl) per la miopia

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

Metodi per rinforzare il tessuto introducendo legami chimici (cross-linking non enzimatica) in proteine strutturali (collageni fibrillari) per la terapia includono cross-linking fotochimico e cross-linking metodi (TXL) del tessuto. Tali metodi per indurre i cambiamenti di proprietà meccaniche del tessuto sono essere impiegati per la cornea nei disordini di assottigliamento corneale (meccanicamente indebolito) come cheratocono, nonché la sclera in miopia progressiva, dove diradamento e indebolimento del posteriore sclera si verifica e probabilmente contribuisce all'allungamento assiale. Le proteine bersaglio primario per tale rafforzamento del tessuto sono collageni fibrillari che costituiscono la grande maggioranza delle proteine di peso a secco nella cornea e sclera. Fortuitamente, collageni fibrillari sono la principale fonte di seconda generazione armonica segnali nello spazio extracellulare dei tessuti. Pertanto, modificazioni delle proteine del collagene, quali quelli indotti tramite cross-linking terapie, potenzialmente potrebbero essere rilevate e quantificate attraverso l'uso di microscopia di seconda generazione di armoniche (SHGM). Monitoraggio SHGM segnali attraverso l'uso di un sistema di microscopia accoppiato con un'eccitazione a infrarossi luce di scansione laser di origine è un metodo di imaging moderno emozionante che sta godendo l'uso diffuso nelle scienze biomediche. Così, lo studio presente è stato intrapreso per valutare l'uso di microscopia SHGM come un mezzo per misurare indotta cross-linking effetti ex vivo la sclera di coniglio, segue un'iniezione di una sostanza chimica agente reticolante nello spazio di sub-Tenon (sT), un iniezione di approccio che è pratica standard per causare anestesia oculare durante le procedure cliniche oftalmologiche. La chimica agente reticolante, sodio hydroxymethylglycinate (SMG), è da una classe di conservanti cosmetici conosciuto come formaldeide distaccanti (FARs). Cambiamenti scleral dopo reazione con SMG provocato gli aumenti in SHG segnali e correlati con i cambiamenti nella temperatura di denaturazione termica, un metodo standard per valutare indotta cross-linking effetti del tessuto.

Temperatura di denaturazione termica (Tm) come un metodo di dosaggio per valutare TXL cross-linking effetto: Un totale di 16 paia di occhi di coniglio sono stati utilizzati in questi esperimenti per la procedura TXL. Come una parte iniziale di questo studio, è stata valutata la localizzazione di cross-linking effetto indotto tramite una singola iniezione di agente reticolante SMG via sT spazio alla testa di coniglio cadaverico. Questo tipo di esperimento ha rilevanza per ...

Questo protocollo descrive le tecniche per la valutazione di reticolazione chimica dello sclera coniglio mediante generazione di seconda armonica imaging e Calorimetria a scansione differenziale.

Seconda generazione di armoniche segnali coniglio sclera come strumento per la valutazione del tessuto terapeutico reticolazione (TXL) per la miopia

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è dimostrare l'uso della microscopia di seconda armonica per visualizzare e misurare l'effetto di reticolazione del collagene nel tessuto sclerale, indotto dall'iniezione di agente di rilascio di formaldeide da parte di sub-tenone, e come confermato dalla calorimetria differenziale a scansione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della reticolazione terapeutica dei tessuti, fornendo un metodo non invasivo per valutare gli effetti di reticolazione indotta. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i segnali generati dalla seconda armonica sono altamente specifici per le fibrille del collage e, come tale, non è richiesta alcuna preparazione tissutale speciale, come la colorazione degli anticorpi.Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo letto della procedura applicata alla reticolazione terapeutica del tessuto corneale. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, in quanto il successo della microscopia a generazione di seconda armonica richiede un attento posizionamento del tessuto e l'impostazione di condizioni di imaging corrette per prevenire danni ai tessuti e artefatti nella misurazione del segnale. Iniziare il trattamento con l'iniezione di sub-tenone nei bulbi oculari del coniglio come descritto nel protocollo di testo.Mostra qui una rappresentazione schematica del sito di iniezione del sub-tenone. Seleziona uno speculum di dimensioni ottimali in base alle dimensioni dell'occhio. Dopo tre ore e mezza di incubazione, ritrarre le palpebre utilizzando lo speculum palpebrale per ottimizzare l'accesso al globo.Separare la congiuntiva che circonda il limbus e tagliare i muscoli oculari extra nei loro siti di inserzione sclerale. Tagliare la parte superiore della sclera usando le forbici o una lama per creare un'area di un centimetro ad uno con il sito di iniezione situato centralmente. Raschiare gli strati retinici e coroidi rimanenti e lavare due volte con PBS fresco, lasciando ogni volta i pezzi in soluzione per circa 10 secondi.Posizionare il tessuto in provette da un millilitro riempite con soluzione PBS per il trasporto alla struttura di imaging. Per massimizzare il segnale e la risoluzione durante l'esecuzione della microscopia SHG, utilizzare una lente dell'obiettivo ottimizzata per trasmettere la luce infrarossa e con un'elevata apertura numerica. Regolare il collare di correzione della lente in modo che corrisponda alla profondità del campione.In questo caso, 0,17 millimetri. Montare l'obiettivo 25 volte sul microscopio e aggiungere una generosa quantità di gel da immersione a base d'acqua per coprire la superficie dell'obiettivo. È importante eseguire l'imaging tissutale entro 30 minuti dal montaggio del campione sul microscopio al fine di mantenere il tessuto idratato e prevenire l'essiccazione del gel di immersione tra l'obiettivo della lente e il vetrino, in quanto comporterebbe cambiamenti nel segnale SHG.Assemblare la camera della cella posizionando un vetrino di copertura rotondo da 25 millimetri sulla parte inferiore della camera. Posizionare il pezzo di tessuto sclera sul vetrino coprioggetto e aggiungere da 50 a 100 microlitri di tampone. Coprire il fazzoletto con un secondo vetrino coprinte rotondo e avvitare la parte superiore della camera senza premere o appiattire il fazzoletto.Quindi, montare la camera cellulare con il campione di tessuto sul tavolino del microscopio. Posizionare il tavolino e regolare l'altezza dell'obiettivo in modo che la superficie inferiore del campione sia a fuoco come determinato dall'ispezione in campo chiaro attraverso l'oculare. Spegni tutte le luci tranne il monitor del computer e blocca quanta più luce possibile dal monitor con fogli di alluminio drappeggiati sul tavolino del microscopio.Nel software, disattivare la modalità Eye Port. Nel pannello TI Pad, verificare che la definizione dell'obiettivo sia corretta. Nel pannello dell'interfaccia grafica utente compatta A1, scegliere il laser a infrarossi per l'imaging, selezionare i rivelatori non descanned e scegliere il canale DAPI dotato di un filtro passa-banda da 400 a 450 nanometri.Nel pannello dell'interfaccia utente grafica A1 Multi Photon, impostare la lunghezza d'onda del laser a infrarossi su 860 nanometri e aprire l'otturatore. Attendere che la lunghezza d'onda di emissione venga modificata come indicato dalla luce verde fissa. Per impostare le condizioni di scansione laser nel pannello dell'interfaccia grafica utente compatta A1, selezionare lo scanner Galvano, la scansione direzionale dell'unità, una dimensione del fotogramma di 1024 x 1024 pixel, un tempo di permanenza dei pixel di 6,2 microsecondi e una media delle linee di 2X.Quindi, attiva l'immaginazione dal vivo con la modalità di ricerca e imposta le condizioni di immagine nel pannello dell'interfaccia utente grafica compatta AI regolando la potenza del laser e il guadagno del rivelatore. Impostare la potenza del laser tra 50 milliwatt e 150 milliwatt, ovvero tra il due percento e il sei percento per un laser a 860 nanometri. Al di sopra di questo intervallo possono verificarsi danni ai tessuti.Aprire il pannello Tabella di ricerca che visualizza un istogramma dei valori di intensità dei pixel nell'immagine corrente e regolare ulteriormente il guadagno del rilevatore nella barra etichettata HV per massimizzare l'intervallo di valori dei pixel evitando la saturazione. Utilizzare il campione con il segnale SHG più alto per trovare le impostazioni ottimali del laser e del guadagno. Mantieni le stesse impostazioni per tutti i campioni da confrontare in un esperimento.Questa pratica garantisce che nessun campione nell'esperimento saturerà il rivelatore. Per scansionare il tessuto in modalità anteprima, aprire lo strumento di panoramica XYZ. Impostare l'immagine su una risoluzione più bassa per velocizzare l'acquisizione delle immagini in questa modalità.Nel pannello di panoramica XYZ, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla posizione corrente e selezionare Scansione cinque per cinque, Tre per tre o Acquisizione vista singola. Al termine della scansione, spostarsi in una nuova posizione facendo doppio clic su un'area esterna all'area attualmente visualizzata in anteprima. Attiva la modalità Live Scan, quindi metti a fuoco il tessuto poiché diverse regioni del tessuto possono avere posizioni leggermente diverse in direzione assiale.Cattura un nuovo campo visivo cinque per cinque, tre per tre o singoli. Ripetere questo processo fino a quando non è stata visualizzata un'anteprima di un'ampia area del tessuto. Nello strumento di panoramica XYZ, fare doppio clic su una posizione in cui le fibre di collagene sono visibili nell'intero campo visivo per spostare il tavolino in quella particolare posizione.Imposta l'imaging su alta risoluzione, 1024 x 1024 pixel e media delle linee 2X. Attiva la modalità Live Find, regola la posizione dell'obiettivo in modo che il piano inferiore sia a fuoco e, nel TI Pad, usa l'unità Z per spostare il piano ottico di 10 micrometri sopra questo strato inferiore. Acquisisci un'immagine utilizzando il pulsante di acquisizione, salva la posizione con il pulsante più nello strumento di revisione XYZ.Fare doppio clic su una nuova posizione e ripetere il processo di regolazione della profondità e di acquisizione dell'immagine. Per ogni pezzo di tessuto, cattura 10 immagini. I campi visivi non devono sovrapporsi, come mostrato dalle posizioni salvate nello strumento di panoramica XYZ.Infine, posizionare i pezzi sclerali in una provetta da un millilitro con PBS subito dopo il completamento della microscopia in preparazione per la successiva analisi calorimetrica a scansione differenziale. Per iniziare, ritagliate la parte centrale del controllo e trattate la sclera con le forbici. Asciugare ogni quadrato sclerale con un fazzoletto assorbente e adagiarlo sul fondo di una padella DSC utilizzando una pinza dentata.Con il fazzoletto all'interno e il labbro arricciato e coperto, pesare il piatto in modo da ottenere il peso umido del fazzoletto. Quindi, posizionare il campione pesato nella posizione designata sul vassoio dell'autocampionatore DSC. Creare un metodo utilizzando il software di gestione degli strumenti, specificando il peso del tessuto ed eseguire l'analisi termica utilizzando i perimetri elencati nel protocollo di testo.Una volta completato, analizzare i dati per ciascun campione estraendo il picco di temperatura di transizione in cui si verifica la denaturazione termica utilizzando il software di imaging dello strumento. Le immagini SHG della sclera sono state analizzate nelle Fiji per la luminosità media dei pixel. Quando si apre un'immagine e si seleziona il menu di analisi seguito dalla misurazione, si apre una tabella con i risultati contenente la luminosità media del segnale.In alternativa, nel menu Analizza, l'opzione Istogramma è selezionata per creare un istogramma dei valori di intensità dei pixel che contiene informazioni sulla luminosità media e sulla variazione del segnale nell'immagine. Questa misurazione è stata ripetuta per tutte le immagini dei campioni di controllo e reticolati. Qui sono dimostrate immagini SHG rappresentative della sclera con l'analisi dell'istogramma di accompagnamento, inclusa la luminosità media.Il campione di controllo è caratterizzato da una disposizione ondulata di fibrille. Qui è mostrato un campione reticolato con una mitraglietta da 400 millimolari con una maggiore intensità di pixel che rivela fibre di collagene che appaiono più dritte. I risultati dell'analisi termica mostrano il picco più elevato della temperatura di denaturazione e confermano l'effetto di reticolazione.Vengono mostrati il campione di controllo e una curva di denaturazione del campione reticolato di 400 millimolari. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come preparare un campione reticolato e di come eseguire la microscopia SHG su campioni sclerali. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo lottano con l'iniezione precisa nello spazio sub-tenone, estraendo chirurgicamente il quadrato attorno al sito di iniezione e impostando le condizioni dell'immagine per scansionare il tessuto in modalità anteprima.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'autoluorescenza, per rispondere a ulteriori domande, come l'analisi dell'elastina, compresa la quantificazione e la morfologia. Le implicazioni di questa tecnica di somministrazione dell'agente reticolante si estendono alla terapia della miopia elevata e dello stafiloma posteriore, perché fornisce un accesso più facile al polo posteriore ai fini della stabilizzazione sclerale. Le implicazioni di questa tecnica di microscopia si estendono alle diagnosi di miopia elevata e complicanze causate dall'indebolimento del collagene misurando lo stato di reticolazione del collagene nella sclera malata o misurando l'esito dopo il completamento della procedura di reticolazione desiderata.Quindi, questo metodo di cross-linking e la microscopia di seconda generazione armonica possono fornire informazioni sul cross-linking sclerale, può anche essere applicato ad altri tessuti come cornea, pelle, cartilagine, tendini, valvole cardiache e vasi sanguigni.

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