Seconda generazione di armoniche segnali coniglio sclera come strumento per la valutazione del tessuto terapeutico reticolazione (TXL) per la miopia

L'obiettivo generale di questo protocollo è dimostrare l'uso della microscopia di seconda armonica per visualizzare e misurare l'effetto di reticolazione del collagene nel tessuto sclerale, indotto dall'iniezione di agente di rilascio di formaldeide da parte di sub-tenone, e come confermato dalla calorimetria differenziale a scansione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della reticolazione terapeutica dei tessuti, fornendo un metodo non invasivo per valutare gli effetti di reticolazione indotta. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i segnali generati dalla seconda armonica sono altamente specifici per le fibrille del collage e, come tale, non è richiesta alcuna preparazione tissutale speciale, come la colorazione degli anticorpi.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo letto della procedura applicata alla reticolazione terapeutica del tessuto corneale. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, in quanto il successo della microscopia a generazione di seconda armonica richiede un attento posizionamento del tessuto e l'impostazione di condizioni di imaging corrette per prevenire danni ai tessuti e artefatti nella misurazione del segnale. Iniziare il trattamento con l'iniezione di sub-tenone nei bulbi oculari del coniglio come descritto nel protocollo di testo.

Mostra qui una rappresentazione schematica del sito di iniezione del sub-tenone. Seleziona uno speculum di dimensioni ottimali in base alle dimensioni dell'occhio. Dopo tre ore e mezza di incubazione, ritrarre le palpebre utilizzando lo speculum palpebrale per ottimizzare l'accesso al globo.

Separare la congiuntiva che circonda il limbus e tagliare i muscoli oculari extra nei loro siti di inserzione sclerale. Tagliare la parte superiore della sclera usando le forbici o una lama per creare un'area di un centimetro ad uno con il sito di iniezione situato centralmente. Raschiare gli strati retinici e coroidi rimanenti e lavare due volte con PBS fresco, lasciando ogni volta i pezzi in soluzione per circa 10 secondi.

Posizionare il tessuto in provette da un millilitro riempite con soluzione PBS per il trasporto alla struttura di imaging. Per massimizzare il segnale e la risoluzione durante l'esecuzione della microscopia SHG, utilizzare una lente dell'obiettivo ottimizzata per trasmettere la luce infrarossa e con un'elevata apertura numerica. Regolare il collare di correzione della lente in modo che corrisponda alla profondità del campione.

In questo caso, 0,17 millimetri. Montare l'obiettivo 25 volte sul microscopio e aggiungere una generosa quantità di gel da immersione a base d'acqua per coprire la superficie dell'obiettivo. È importante eseguire l'imaging tissutale entro 30 minuti dal montaggio del campione sul microscopio al fine di mantenere il tessuto idratato e prevenire l'essiccazione del gel di immersione tra l'obiettivo della lente e il vetrino, in quanto comporterebbe cambiamenti nel segnale SHG.

Assemblare la camera della cella posizionando un vetrino di copertura rotondo da 25 millimetri sulla parte inferiore della camera. Posizionare il pezzo di tessuto sclera sul vetrino coprioggetto e aggiungere da 50 a 100 microlitri di tampone. Coprire il fazzoletto con un secondo vetrino coprinte rotondo e avvitare la parte superiore della camera senza premere o appiattire il fazzoletto.

Quindi, montare la camera cellulare con il campione di tessuto sul tavolino del microscopio. Posizionare il tavolino e regolare l'altezza dell'obiettivo in modo che la superficie inferiore del campione sia a fuoco come determinato dall'ispezione in campo chiaro attraverso l'oculare. Spegni tutte le luci tranne il monitor del computer e blocca quanta più luce possibile dal monitor con fogli di alluminio drappeggiati sul tavolino del microscopio.

Nel software, disattivare la modalità Eye Port. Nel pannello TI Pad, verificare che la definizione dell'obiettivo sia corretta. Nel pannello dell'interfaccia grafica utente compatta A1, scegliere il laser a infrarossi per l'imaging, selezionare i rivelatori non descanned e scegliere il canale DAPI dotato di un filtro passa-banda da 400 a 450 nanometri.

Nel pannello dell'interfaccia utente grafica A1 Multi Photon, impostare la lunghezza d'onda del laser a infrarossi su 860 nanometri e aprire l'otturatore. Attendere che la lunghezza d'onda di emissione venga modificata come indicato dalla luce verde fissa. Per impostare le condizioni di scansione laser nel pannello dell'interfaccia grafica utente compatta A1, selezionare lo scanner Galvano, la scansione direzionale dell'unità, una dimensione del fotogramma di 1024 x 1024 pixel, un tempo di permanenza dei pixel di 6,2 microsecondi e una media delle linee di 2X.

Quindi, attiva l'immaginazione dal vivo con la modalità di ricerca e imposta le condizioni di immagine nel pannello dell'interfaccia utente grafica compatta AI regolando la potenza del laser e il guadagno del rivelatore. Impostare la potenza del laser tra 50 milliwatt e 150 milliwatt, ovvero tra il due percento e il sei percento per un laser a 860 nanometri. Al di sopra di questo intervallo possono verificarsi danni ai tessuti.

Aprire il pannello Tabella di ricerca che visualizza un istogramma dei valori di intensità dei pixel nell'immagine corrente e regolare ulteriormente il guadagno del rilevatore nella barra etichettata HV per massimizzare l'intervallo di valori dei pixel evitando la saturazione. Utilizzare il campione con il segnale SHG più alto per trovare le impostazioni ottimali del laser e del guadagno. Mantieni le stesse impostazioni per tutti i campioni da confrontare in un esperimento.

Questa pratica garantisce che nessun campione nell'esperimento saturerà il rivelatore. Per scansionare il tessuto in modalità anteprima, aprire lo strumento di panoramica XYZ. Impostare l'immagine su una risoluzione più bassa per velocizzare l'acquisizione delle immagini in questa modalità.

Nel pannello di panoramica XYZ, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla posizione corrente e selezionare Scansione cinque per cinque, Tre per tre o Acquisizione vista singola. Al termine della scansione, spostarsi in una nuova posizione facendo doppio clic su un'area esterna all'area attualmente visualizzata in anteprima. Attiva la modalità Live Scan, quindi metti a fuoco il tessuto poiché diverse regioni del tessuto possono avere posizioni leggermente diverse in direzione assiale.

Cattura un nuovo campo visivo cinque per cinque, tre per tre o singoli. Ripetere questo processo fino a quando non è stata visualizzata un'anteprima di un'ampia area del tessuto. Nello strumento di panoramica XYZ, fare doppio clic su una posizione in cui le fibre di collagene sono visibili nell'intero campo visivo per spostare il tavolino in quella particolare posizione.

Imposta l'imaging su alta risoluzione, 1024 x 1024 pixel e media delle linee 2X. Attiva la modalità Live Find, regola la posizione dell'obiettivo in modo che il piano inferiore sia a fuoco e, nel TI Pad, usa l'unità Z per spostare il piano ottico di 10 micrometri sopra questo strato inferiore. Acquisisci un'immagine utilizzando il pulsante di acquisizione, salva la posizione con il pulsante più nello strumento di revisione XYZ.

Fare doppio clic su una nuova posizione e ripetere il processo di regolazione della profondità e di acquisizione dell'immagine. Per ogni pezzo di tessuto, cattura 10 immagini. I campi visivi non devono sovrapporsi, come mostrato dalle posizioni salvate nello strumento di panoramica XYZ.

Infine, posizionare i pezzi sclerali in una provetta da un millilitro con PBS subito dopo il completamento della microscopia in preparazione per la successiva analisi calorimetrica a scansione differenziale. Per iniziare, ritagliate la parte centrale del controllo e trattate la sclera con le forbici. Asciugare ogni quadrato sclerale con un fazzoletto assorbente e adagiarlo sul fondo di una padella DSC utilizzando una pinza dentata.

Con il fazzoletto all'interno e il labbro arricciato e coperto, pesare il piatto in modo da ottenere il peso umido del fazzoletto. Quindi, posizionare il campione pesato nella posizione designata sul vassoio dell'autocampionatore DSC. Creare un metodo utilizzando il software di gestione degli strumenti, specificando il peso del tessuto ed eseguire l'analisi termica utilizzando i perimetri elencati nel protocollo di testo.

Una volta completato, analizzare i dati per ciascun campione estraendo il picco di temperatura di transizione in cui si verifica la denaturazione termica utilizzando il software di imaging dello strumento. Le immagini SHG della sclera sono state analizzate nelle Fiji per la luminosità media dei pixel. Quando si apre un'immagine e si seleziona il menu di analisi seguito dalla misurazione, si apre una tabella con i risultati contenente la luminosità media del segnale.

In alternativa, nel menu Analizza, l'opzione Istogramma è selezionata per creare un istogramma dei valori di intensità dei pixel che contiene informazioni sulla luminosità media e sulla variazione del segnale nell'immagine. Questa misurazione è stata ripetuta per tutte le immagini dei campioni di controllo e reticolati. Qui sono dimostrate immagini SHG rappresentative della sclera con l'analisi dell'istogramma di accompagnamento, inclusa la luminosità media.

Il campione di controllo è caratterizzato da una disposizione ondulata di fibrille. Qui è mostrato un campione reticolato con una mitraglietta da 400 millimolari con una maggiore intensità di pixel che rivela fibre di collagene che appaiono più dritte. I risultati dell'analisi termica mostrano il picco più elevato della temperatura di denaturazione e confermano l'effetto di reticolazione.

Vengono mostrati il campione di controllo e una curva di denaturazione del campione reticolato di 400 millimolari. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come preparare un campione reticolato e di come eseguire la microscopia SHG su campioni sclerali. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo lottano con l'iniezione precisa nello spazio sub-tenone, estraendo chirurgicamente il quadrato attorno al sito di iniezione e impostando le condizioni dell'immagine per scansionare il tessuto in modalità anteprima.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'autoluorescenza, per rispondere a ulteriori domande, come l'analisi dell'elastina, compresa la quantificazione e la morfologia. Le implicazioni di questa tecnica di somministrazione dell'agente reticolante si estendono alla terapia della miopia elevata e dello stafiloma posteriore, perché fornisce un accesso più facile al polo posteriore ai fini della stabilizzazione sclerale. Le implicazioni di questa tecnica di microscopia si estendono alle diagnosi di miopia elevata e complicanze causate dall'indebolimento del collagene misurando lo stato di reticolazione del collagene nella sclera malata o misurando l'esito dopo il completamento della procedura di reticolazione desiderata.

Quindi, questo metodo di cross-linking e la microscopia di seconda generazione armonica possono fornire informazioni sul cross-linking sclerale, può anche essere applicato ad altri tessuti come cornea, pelle, cartilagine, tendini, valvole cardiache e vasi sanguigni.