Un metodo di cultura alternativa per mantenere l'ipometilazione genomica delle cellule staminali embrionali del Mouse utilizzando PD0325901 inibitore MEK e vitamina C

Abbiamo descritto in dettaglio due protocolli basati su sostanze chimiche per la coltura di cellule staminali embrionali di topo. Questo nuovo metodo utilizza meccanismi sinergici di promuovere ossidazione Tet-mediata (da vitamina C) e reprimendo la sintesi de novo di 5-metilcitosina (da PD0325901) per mantenere l'ipometilazione del DNA e la pluripotenza delle cellule staminali embrionali di topo.

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di utilizzare i composti a piccole molecole PD0325901 e la vitamina C per mantenere uno stato ipometilato e pluripotente nelle cellule staminali embrionali di topo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle cellule staminali embrionali di topo in coltura FBS, come l'eterogenerità nella morfologia e la deipermetilazione. Quindi il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule staminali embrionali di topo sono in grado di sostenere un'eccellente morfologia e lo stato ipometilato e indifferenziato.

Dopo aver preparato piastre e tamponi, secondo il protocollo di testo, preriscaldare le cellule ES di topo, il terreno di coltura, la tripsina e la PBS in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Per far passare le cellule, aspirare il terreno dal piatto e utilizzare due millilitri di PBS per sciacquare le cellule due volte. Quindi rimuovere il PBS e aggiungere 0,3 millilitri di tripsone EDTA alle cellule e inclinare rapidamente il piatto per coprire le cellule nella soluzione.

Rimuovere immediatamente la tripsina e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un minuto per staccare le cellule. Aggiungere due millilitri di siero preriscaldato per inattivare la tripsina e utilizzare una pipetta da cinque millilitri per risospendere le colonie cellulari 10 volte in una singola sospensione cellulare. Piastra 150 microlitri di soluzione cellulare in un nuovo piatto di sei centimetri ricoperto di gelatina e integra con tre millilitri di VCPD0325901 terreno appena preparato.

Colture delle cellule a 37 gradi Celsius e al cinque percento di CO2. A causa dell'instabilità di Vc, ogni 24 ore durante l'incubazione, rimuovere il vecchio terreno di coltura e aggiungere tre millilitri di terreno fresco Vcpd0325901. Dopo aver raggiunto il 70-80 percento di confluenza, far passare le cellule e continuare a coltivarle come appena dimostrato.

Per eseguire l'estrazione del DNA, raccogliere le cellule con la tripsina come dimostrato in precedenza e utilizzare un kit di purificazione del DNA genomico seguendo le istruzioni del produttore. Aggiungere 100 microlitri di acqua ultra pura alla provetta di DNA e sciogliere il DNA pipettandolo circa 15 volte. Quindi, utilizzare uno spettrofotometro per misurare il rapporto Od260-280 per determinare la concentrazione e la qualità del DNA.

La concentrazione di DNA dovrebbe essere di circa 500 nogrammi per microlitro. Successivamente, digerire cinque microgrammi di DNA combinandolo con cinque microlitri di tris cloridrato da 100 millimolari PH7.6, due unità di fosfatasi intestinale di vitello, un'unità di Dnase uno e 0,005 unità di veleno di serpente, fosfodiesterasi uno. Quindi, utilizzare acqua ultra pura per aumentare il volume a 50 microlitri.

Incubare la reazione a 37 gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente, raccogliere il campione mediante centrifugazione a 1.000xg a temperatura ambiente per un minuto. Quindi trasferire la soluzione in provette di ultrafiltrazione e centrifugare i campioni a 13.000xg e 4 gradi Celsius per 30 minuti per rimuovere gli enzimi di digestione.

Per preparare i campioni per l'analisi 5HMC, trasferire 36 microlitri di filtrato in una nuova provetta da un millilitro e aggiungere quattro microlitri di D35HMC per una concentrazione finale di tre nanomolari. Per l'analisi 5MC, pipettare 196 microlitri di acqua ultra pura in una nuova provetta da centrifuga e aggiungere quattro microlitri di filtrato a causa dell'alta densità di 5MC nel DNA genomico. Trasferire 36 microlitri della soluzione diluita di 5MC in una nuova provetta da centrifuga e aggiungere quattro microlitri di D35MC per una concentrazione finale di 50 nanomolari.

Utilizzare D35HMC e D35MC come standard interni per calibrare rispettivamente 5HMC e 5MC. Dopo aver impostato i parametri per analizzare 5MC e 5HMC nel software UHPLCMS, in base al protocollo di testo, stabilire i parametri per QQQMSMS facendo clic su MS QQQ. Per il tempo di arresto, scegliere Nessun limite/Come pompa.

Per Sorgente ionica, scegliere ESI. Per filtrare il tempo, seleziona Larghezza picco e inserisci 0,07 minuti. Per impostare i segmenti di tempo, per l'ora di inizio, scegli zero.

Per impostare la modalità di scansione in Gestione record di messaggistica per analizzare l'allusione dalla colonna, per Tipo di scansione scegliere Gestione record di messaggistica. Per Valore div, scegliere In MS. Per Delta EMV plus, inserisci 200 e per Delta EMV minus, inserisci zero. Creare i parametri per il monitoraggio delle transizioni facendo clic su MSQQQ un'acquisizione.

Per impostare i segmenti di scansione, per Ritardo, immettere 90. Per impostare le tensioni dei frammenti per il frammento, immettere 90. Per Energia di collisione, inserisci cinque.

Per la tensione dell'acceleratore di celle, immettere quattro. Per impostare la modalità ioni positivi, per Polarità, scegliere positivo. Per effettuare la separazione UHPLC dei mononucleosidi, preparare le soluzioni a e b per l'allusione di 5MC e citosina mescolando 500 millilitri di acqua ultra pura con 500 microlitri di acido formico per la soluzione a.

Quindi misurare 500 millilitri di metanolo al 100% e la soluzione b. Mescolare la soluzione a e la soluzione b con un rapporto volume/volume di 95 a cinque come fase mobile per eluire 5MC e C.Quindi impostare la portata a 0,25 millilitri al minuto. Separare 5HMC utilizzando un'allusione al gradiente ottimizzato.

Quindi impostare la portata a 0,25 millilitri al minuto. Monitora le transizioni per 5MC, D35MC, DC, 5HMC e D35HMC. Impostare le tensioni capillari a 3.500 volt.

Quindi impostare il volume di iniezione su 5 microlitri e analizzare ogni campione tre volte. Utilizzare le curve standard corrispondenti per valutare la quantità di 5MC e 5HMC secondo il protocollo di testo. Come si è visto in questa analisi del DNA genomico in cellule ES di topo mediante MSMS UHPLC, il trattamento con VcPD0325901 ha determinato un declino più rapido della metilazione del DNA e ha raggiunto livelli costanti di cinque MC dopo cinque giorni, mentre il trattamento con Vc 2i ha portato a un livello comparabile al giorno 11.

Questo grafico mostra che il trattamento con Vc ha aumentato drasticamente la frequenza di 5HMC dopo un giorno e, successivamente, i livelli di 5HMC sono gradualmente diminuiti a causa di una progressiva riduzione del substrato di 5MC. L'analisi del Western blot ha mostrato che Prdm14 era significativamente elevato, mentre Dnmt3b e il suo cofattore, Dnmt3l, erano considerevolmente sottoregolati quando le cellule si ritiravano con PD0325901, indicando l'azione di PD0325901 nella cancellazione di 5MC. In questo test della fosfatasi alcalina, le cellule ES di topo sono state tutte colorate di viola con una morfologia a palla quando coltivate per 26 giorni in VcPD032590, indicando uno stato indifferenziato.

Al contrario, le cellule cresciute in FBS contenenti solo terreno apparivano di colore chiaro con una parziale diffusione che indicava una parziale differenziazione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che gli FBS devono essere pre-selezionati.

Inoltre, evitare di sovrapipettare le cellule attraverso il passaggio e di cambiare quotidianamente il terreno di coltura VcPDO325901. Dopo questo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della coltura di cellule ES di topo in vitro per esplorare lo sviluppo e i processi degli embrioni in vitro e delle cellule generate di rilevanza medica per la medicina rigenerativa. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una maggiore comprensione di come mantenere la morfologia di crescita e lo stato ipermetilato e di potenza plurale per le cellule ES di topo utilizzando due piccoli componenti molecolari, l'inibitore MEK PD0325901.

Non dimenticare che lavorare con Trisol, DMS o PMS e DTT può essere estremamente pericoloso e le precauzioni come indossare guanti, mascherina e occhiali protettivi devono essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.