Flusso di lavoro basato sulla combinazione di tracciante isotopico esperimenti per studiare il metabolismo microbico di più fonti di nutrienti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare quantitativamente il metabolismo di più fonti di nutrienti utilizzando substrati etichettati. Questo flusso di lavoro consente di determinare il destino dei nutrienti consumati e l'origine metabolica dei composti sintetizzati dai lieviti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del metabolismo microbico, come ad esempio come funziona tutto il metabolismo a seconda delle condizioni ambientali.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di chiarire e quantificare la distribuzione delle proteine dei nutrienti da più fonti. Questo metodo è stato utilizzato per studiare il metabolismo dell'azoto del lievito, ma può essere applicato anche ad altri metabolismi e microrganismi. La chiave del successo di questo esperimento risiede nella riproducibilità delle fermentazioni.

Gli utenti devono prestare particolare attenzione a raccogliere le cellule nello stesso stadio fisiologico definito. A dimostrare la procedura saranno Christian Picou del nostro staff tecnico, Pauline Seguinot, dottoranda del laboratorio, e Stephanie Rollero, borsista post-dottorato. In autoclave, pastorizzare ogni mezzo sintetico preparato per ciascuna fonte di azoto in un pallone da un litro contenente un'ancoretta magnetica.

Sciogliere la quantità appropriata di molecola marcata per raggiungere la concentrazione finale desiderata nel mezzo. Sterilizzare il terreno utilizzando un sistema di filtrazione sottovuoto monouso. Utilizzando un cilindro graduato sterile, dividere il fluido tra due fermentatori pre-sterilizzati che contengono un'ancoretta magnetica e sono dotati di blocchi di fermentazione per evitare l'ingresso di ossigeno ma consentire il rilascio di anidride carbonica.

Dopo aver coltivato un ceppo cerevisiae in terreno YPD, raccogliere un'aliquota di pre-coltura sotto flusso laminare e quantificare la popolazione cellulare utilizzando un contatore elettronico di particelle dotato di un'apertura di 100 micrometri. Dopo aver centrifugato la pre-coltura, sospendere il pellet in un volume appropriato di acqua sterile per ottenere una concentrazione finale di 2,5 volte 10 al 9° cellule per millilitro. Quindi, inoculare ogni fermentatore con un millilitro di sospensione cellulare.

Successivamente, preparare una piattaforma di fermentazione installando i fermentatori nelle guide di supporto correttamente posizionate sulle piastre di agitazione a 21 posizioni e impostare la velocità di agitazione a 270 giri/min. Per avviare il monitoraggio online di ogni fermentazione, avviare l'applicazione di controllo robot, fare clic sul pulsante Avvia test e selezionare il volume di fermentazione da effettuare. Per fare in modo che l'interfaccia visualizzata consenta l'indicazione del numero e della posizione dei fermentatori sulla piattaforma, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla posizione della fessura e scegliere Disabilita per disattivare il monitoraggio delle posizioni vuote.

Per inizializzare il software di calcolo, fare clic sul pulsante Inizializzatore e convalidare con OK. Quindi, fare clic sul pulsante Avvia dell'applicazione di controllo del robot per avviare le acquisizioni di peso. Successivamente, centrifugare due campioni da sei millilitri prelevati dai fermentatori a 2.000 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Al termine, trasferire ogni surnatante congelato in due tubi e conservare a meno 80 gradi Celsius.

Lavare ogni pellet due volte con cinque millilitri di acqua distillata e conservarlo a meno 80 gradi Celsius per la misurazione dell'arricchimento isotopico. Aggiungere 200 microlitri di una soluzione di acido sulfosalicilico al 25% che contiene 2,5 millimolari di norleucina come standard interno a 800 microlitri di campione per rimuovere le molecole ad alto peso molecolare. Dopo l'incubazione e la centrifugazione, filtrare la miscela attraverso una membrana di nitrocellulosa di dimensioni pari a 0,22 micrometri e posizionare il campione in un sistema di analisi degli amminoacidi.

Nel programma o nel software del sistema di analisi, cliccare sul pulsante Esegui per iniziare le analisi di cromatografia liquida con l'analizzatore dotato di colonna a scambio cationico. Successivamente, preparare un estratto ossidato sospendendo un pellet cellulare precedentemente preparato in 200 microlitri di acido performico. Dopo l'incubazione per quattro ore a quattro gradi Celsius, interrompere la reazione aggiungendo 33,6 milligrammi di solfato di sodio.

Aggiungere 800 microlitri di acido cloridrico normale all'estratto ossidato e incubare il campione in una provetta di vetro ermeticamente sigillata per 16 ore a 110 gradi Celsius in un forno a calore secco. Dopo aver lasciato raffreddare il campione a temperatura ambiente, aggiungere 200 microlitri di neuroleucina da 2,5 millimolari e rimuovere il gas di acido cloridrico con un flusso di azoto. Lavare l'estratto secco due volte con 800 microlitri di acqua distillata, e poi 800 microlitri di etanolo.

Quindi, aggiungere all'estratto 800 microlitri di tampone di acetato di litio da 200 millimolari. Determinare le concentrazioni relative di amminoacidi all'interno delle proteine del campione utilizzando il metodo cromatografico precedentemente descritto. Idrolizzare un pellet di cella marcato aggiungendo 1,2 millilitri di acido cloridrico a sei molari e incubando il campione per 16 ore a 105 gradi Celsius in un tubo di vetro ben chiuso in un forno a calore secco.

Dopo aver lasciato raffreddare il campione a temperatura ambiente, aggiungere 1,2 millilitri di acqua distillata. Dopo la centrifugazione per rimuovere i detriti cellulari, distribuire il surnatante in sei frazioni da 400 microlitri in provette di vetro aperte. Asciugare le frazioni nel forno a calore secco a 105 gradi Celsius per quattro o cinque ore fino a raggiungere la consistenza dello sciroppo.

Durante l'idrolisi della biomassa, essiccare la frazione fino alla consistenza di uno sciroppo controllando frequentemente l'acido di funzionamento. Per la derivatizzazione dell'ECF, sciogliere l'idrolizzato essiccato raffreddato in 200 microlitri di acido cloridrico 20 millimolare e 133 microlitri di una miscela da uno a quattro di piridina ed etanolo. Aggiungere 50 microlitri di cloroformiato di etile per derivatizzare gli amminoacidi.

Dopo che l'anidride carbonica è stata rilasciata, trasferire la miscela in provette da centrifuga che contengono 500 microlitri di diclorometano per estrarre i composti derivatizzati. Agitare i campioni per 10 secondi. Dopo aver centrifugato per quattro minuti a 10.000 volte G, raccogliere la fase organica inferiore di ciascun campione con una pipetta Pasteur e trasferirla in una fiala di autocampionatore GC che contiene un inserto conico in vetro in modo che ogni campione possa essere iniettato direttamente nello strumento GCMS.

reagenti di derivatizzazione HPLC vengono utilizzati per la procedura ECF. Cambiare frequentemente i reagenti ECF. Per la derivatizzazione del DMF-DMA, sciogliere l'idrolizzato essiccato in 50 microlitri di metanolo e 200 microlitri di acetonitrile.

Aggiungere 300 microlitri di DMF-DMA e agitare il campione. Quindi, trasferire il campione in una fiala dell'autocampionatore GC che contiene un inserto conico in vetro. Per la derivatizzazione BSTFA, sospendere l'idrolizzato in 200 microlitri di acetonitrile.

Aggiungere 200 microlitri di BSTFA al campione e chiudere ermeticamente il tubo di vetro. Dopo l'incubazione per quattro ore a 135 gradi Celsius, trasferire l'estratto raffreddato direttamente in una fiala di autocampionatore GC che contiene un inserto conico in vetro. Ora, analizzare i campioni con un gascromatografo dotato di un iniettore autocampionatore e accoppiato a uno spettrometro di massa.

Fare clic su Strumento nel menu del software del computer. Nella scheda Sequenza, fare clic su Modifica tabella registro campioni per creare un elenco di campioni e fare clic su Esegui ed esegui sequenza per avviare le iniezioni. Al termine delle analisi, registrare un cluster di intensità per ciascun amminoacido che corrisponde ai suoi diversi isotopomeri di massa.

Aggiungere 10 microlitri degli standard interni deuterati appropriati a cinque millilitri di surnatante in un tubo di vetro da 15 millilitri. Aggiungere un millilitro di diclorometano, chiudere ermeticamente la provetta e agitare il campione su una piattaforma oscillante per 20 minuti. Dopo la centrifugazione, raccogliere la fase organica inferiore in una provetta di vetro da 15 millilitri.

Dopo aver ripetuto l'estrazione con diclorometano, essiccare l'estratto organico oltre 500 milligrammi di solfato di sodio anidro e raccogliere la fase liquida con una pipetta Pasteur. Concentrare l'estratto di un fattore quattro sotto il flusso di azoto. Quindi, trasferire il campione concentrato in una fiala dell'autocampionatore GC.

Per la quantificazione GCMS, iniettare due microlitri di campione con un rapporto di divisione di 10 a uno e separare le molecole volatili estratte utilizzando il profilo di temperatura del forno appropriato. Utilizzando i fogli di calcolo nel protocollo di testo, inserire i valori dei dati grezzi che corrispondono alla concentrazione di aminoacidi extracellulari, al peso secco delle cellule, al contenuto proteico delle cellule, alla concentrazione di molecole volatili e all'arricchimento isotopico di amminoacidi proteinogenici e molecole volatili. Di seguito è mostrato un diagramma schematico del flusso di lavoro per studiare la gestione da parte del lievito delle molteplici fonti di azoto che si trovano durante la fermentazione del vino.

Per diversi punti di campionamento, i parametri biologici mostrano un'elevata riproducibilità tra le fermenazioni. Qui viene mostrata una panoramica della ridistribuzione dell'azoto dalle fonti del succo d'uva a tutti gli amminoacidi proteinogenici. In combinazione con la determinazione dei bilanci di massa, la misurazione dell'arricchimento isotopico degli amminoacidi proteinogenici ha fornito la prima quantificazione del contributo di arginina, glutammina, ammonio e altre fonti di origine azotata ai gruppi amminici di ciascuno di questi composti.

Qui viene illustrato un confronto tra la quantità di amminoacido consumato che viene recuperato direttamente nella biomassa. Qui viene mostrata la ripartizione degli amminoacidi alifatici consumati, leucina e valina nella rete metabolica del lievito. Più del 96% della valina e della leucina consumate viene recuperato nei loro prodotti di conversione.

Sorprendentemente, una frazione sostanziale di valina e leucina viene catabolizzata nonostante un notevole squilibrio tra la disponibilità di questi composti nel mezzo e il loro contenuto nella biomassa. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque giorni. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di selezionare attentamente la parte di etichettatura del substrato in base alle questioni scientifiche.

Per garantire una buona riproducibilità biologica, eseguire la fermentazione e l'analisi cromatografica in duplicato. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della microbiologia per esplorare come il metabolismo e la fisiologia dei microrganismi cambiano a seconda delle condizioni ambientali. Non dimenticare che lavorare con i reagenti di derivatizzazione e il solvente arginina può essere estremamente pericoloso, quindi è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti e lavorare sotto una cappa aspirante durante l'esecuzione di questa procedura.