Name: Flusso di lavoro basato sulla combinazione di tracciante isotopico esperimenti per studiare il metabolismo microbico di più fonti di nutrienti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Scopri un metodo per studiare il metabolismo microbico di più fonti di nutrienti utilizzando traccianti isotopici. Questa tecnica consente di determinare la destinazione dei nutrienti consumati e l'origine metabolica dei composti sintetizzati dai microrganismi.

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Grazie a Jean-Roch Mouret, Sylvie Dequin e Jean-Marie Sabalyrolles per aver contribuito alla concezione del sistema robot-assistita fermentazione e Martine Pradal, Nicolas Bouvier e Pascale Brial per il loro supporto tecnico. Finanziamento per questo progetto è stato fornito dal Ministère de l'Education Nationale, de la Recherche et de la Technologie.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Quantificare il partizionamento di composti attraverso reti metaboliche mediante esperimenti di tracciante isotopico è un promettente approccio per capire il funzionamento del metabolismo microbico. Questa metodologia, mentre applicato con successo con uno o due substrati con etichettati, attualmente non può essere implementata per studiare il metabolismo di varie fonti utilizzando multipli con etichettati elementali isotopi (cioè, più di due substrati). Infatti, le tecniche analitiche disponibili consentono la ...

Intesa come opera di metabolismo microbico è una questione chiave per la progettazione di strategie efficienti per migliorare i processi di fermentazione e modulano la produzione di composti fermentativi. I progressi nella genomica e genomica funzionale in questi ultimi due decenni in gran parte contribuito ad estendere la conoscenza della topologia delle reti metaboliche in molti microrganismi. Accesso a queste informazioni hanno portato allo sviluppo di approcci che mirano per una panoramica completa della funzione cellulare1. Queste metodologie si basano spesso su un'interpretazione basata su modello di parametri misurabili. Questi dati sperimentali comprendono, da un lato, tassi di produzione e l'assorbimento di metabolita e, d'altra parte, esperimenti di informazioni quantitative intracellulare che sono ottenuti dal tracciante isotopico. Questi dati forniscono informazioni essenziali per la deduzione dell'attività in vivo di diversi percorsi in una rete metabolica definita2,3,4. Attualmente, le tecniche analitiche disponibili solo attivare la rilevazione accurata di modelli di molecole di etichettatura quando si utilizza un elemento singolo isotopo e possibilmente quando co-etichettatura con due elementi isotopici. Inoltre, sotto la maggior parte delle condizioni di crescita, la fonte di carbonio consiste solo di uno o due-composti. Di conseguenza, approcci basati su 13C-isotopica traccianti da substrati di carbonio sono stati ampiamente e correttamente applicati per sviluppare una comprensione completa del carbonio reti metaboliche operazioni5,6,7 ,8.
Al contrario, in molti ambienti naturali ed industriali, la risorsa di azoto disponibile che supporta la crescita microbica è spesso composto di una vasta gamma di molecole. Ad esempio, durante la fermentazione di vino o birra, azoto viene fornito come una miscela di 18 aminoacidi e ammonio alle concentrazioni variabili9. Questa matrice di composti N che sono accessibili per anabolismo rende queste condizioni supporti complessi notevolmente diversi da quelli comunemente utilizzati per gli studi fisiologici, in quanto quest'ultimo si ottiene utilizzando un'unica fonte di azoto, in genere di ammonio.
Nel complesso, interiorizzato azoto composti possono essere direttamente incorporati nelle proteine o catabolizzate. La struttura della rete del metabolismo dell'azoto in molti microrganismi, tra cui il lievito Saccharomyces cerevisiae, è molto complessa, secondo la diversità dei substrati. Schematicamente, questo sistema si basa sulla combinazione del nucleo centrale del metabolismo dell'azoto che catalizza l'interconversione di glutamina, glutammato e α-chetoglutarato10,11, con transaminasi e deaminasi. Attraverso questa rete, sono riuniti gruppi amminici da ammonio o altri aminoacidi e acidi α-cheto rilasciato. Questi intermedi sono anche sintetizzati attraverso il carbonio centrale metabolismo (CCM)12,13. Questo gran numero di reazioni ramificate e intermedi, coinvolti nel catabolismo di fonti esogene di azoto sia l'anabolismo degli amminoacidi proteinogenici, soddisfa i requisiti anabolizzanti delle cellule. L'attività attraverso questi diversi percorsi interconnessi comporta anche l'escrezione dei metaboliti. In particolare, α-chetoacidi possono essere reindirizzati attraverso il pathway di Ehrlich per la produzione di alcoli superiori e loro acetato estere derivati14, che contribuiscono in maniera essenziale ai profili sensoriali dei prodotti. Successivamente, come funziona il metabolismo dell'azoto svolge un ruolo chiave nella produzione di biomassa e la formazione di molecole volatili (aroma).
Le reazioni, enzimi e geni coinvolti nel metabolismo dell'azoto sono ampiamente descritti nella letteratura. Tuttavia, il problema della distribuzione delle molteplici fonti di azoto attraverso una rete metabolica non è ancora stato risolto. Ci sono due ragioni principali che spiegano questa mancanza di informazioni. In primo luogo, alla luce della complessità importante della rete di metabolismo dell'azoto, una grande quantità di dati quantitativi è richiesta per una completa comprensione del suo funzionamento che non era disponibile fino ad ora. Secondo, molti vincoli sperimentali e le limitazioni dei metodi analitici ha impedito l'attuazione di approcci che sono stati precedentemente utilizzati per la delucidazione della funzione CCM.
Per superare questi problemi, abbiamo scelto di sviluppare un approccio di livello di sistema che si basa sulla riconciliazione dei dati da una serie di esperimenti di tracciante isotopico. Il flusso di lavoro comprende: -Una serie di fermentazioni effettuate nelle stesse condizioni ambientali, mentre una diversa fonte di nutrienti selezionata (substrato) è etichettata ogni volta. -Una combinazione di procedure analitiche (HPLC, GC-MS) per una determinazione accurata, nelle diverse fasi della fermentazione, la concentrazione residua di substrato con etichetta e la concentrazione e l'arricchimento isotopico di composti che sono derivati da il catabolismo della molecola con etichetta, compresa la biomassa derivata. -Un calcolo del saldo massa ed isotopico per ciascuno consumati con etichetta molecola e un'ulteriore analisi integrata del set di dati per ottenere una panoramica globale della gestione delle molteplici fonti di nutrienti da parte dei microrganismi attraverso la determinazione dei coefficienti di flusso .
Per applicare questa metodologia, si deve prestare attenzione al comportamento riproducibile del ceppo/microrganismo tra culture. Inoltre, si devono prelevare campioni da diverse culture durante lo stesso progresso di fermentazione ben definito. Nel lavoro sperimentale segnalato in questo manoscritto, un sistema robot-assistita è utilizzato per il monitoraggio online delle fermentazioni per rappresentare questi vincoli.
Inoltre, è fondamentale scegliere un set di substrati con etichettate (composto, natura e posizione di etichettatura) che è opportuno affrontare il problema scientifico dello studio. Qui, arginina, glutamina e 15N-labeled ammonio sono stati selezionati come le tre fonti principali azoto trovate in succo d'uva. Questo ha permesso di valutare il modello di ridistribuzione di azoto dai composti consumati per gli aminoacidi proteinogenici. Abbiamo anche il compito di indagare sulla sorte della spina dorsale del carbonio di aminoacidi consumati e il loro contributo alla produzione di molecole volatili. Per soddisfare questo obiettivo, uniformemente 13C-etichetta leucina, isoleucina, treonina e valina sono stati inclusi nello studio come gli aminoacidi che sono derivati da importanti intermedi del pathway di Ehrlich.
Nel complesso, abbiamo esplorato quantitativamente come lievito gestisce una risorsa complessa azoto ridistribuendo le fonti di azoto esogene per soddisfare le proprie esigenze anabolizzanti per tutta la fermentazione mentre inoltre rimuovono l'eccesso di precursori di carbonio come molecole volatili. La procedura sperimentale riferita in questa carta può essere applicata per studiare altre fonti di nutrienti più utilizzati da qualsiasi altro microrganismo. Sembra essere un approccio adeguato per l'analisi dell'impatto del background genetico o condizioni ambientali sul comportamento metabolico dei microrganismi.

<table><tbody><tr><td>D-glucosio</td><td>PanReac</td><td>141341.0416</td><td></td></tr><tr><td>D-fruttosio</td><td>PanReac</td><td>142728.0416</td><td></td></tr><tr><td>Acido DL-malico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0875</td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico monoidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7129</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di potassio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0772</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ammonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4514</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di manganese monoidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di zinco eptaidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di rame (II) pentaidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7631</td><td></td></tr><tr><td>Iodio di potassio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4286</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di cobalto (II) esaidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3169</td><td></td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B7660</td><td></td></tr><tr><td>Eptamolibdato di ammonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7302</td><td></td></tr><tr><td>Mio-inositolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>D-Acido pantotenico sale emicalcico</td><td>Sigma</td><td>Aldrich 21210</td><td></td></tr><tr><td>Tiamina, cloridrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4625</td><td></td></tr><tr><td>Acido nicotinico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4126</td><td></td></tr><tr><td>Piridossina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5669</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Ergost&eacute; rol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6510</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo assoluto</td><td>VWR Chemicals</td><td>101074F</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ferro (III) esaidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-aspartico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-glutammico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1251</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5006</td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>L-Istidina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>L-Isoleucina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>L-Lisina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>L-Metionina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-Fenilalanina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>L-Prolina</td><td>Sigma</td><td>Aldrich P0380</td><td></td></tr><tr><td>L-Serina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>L-treonina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>L-triptofano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>L-tirosina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>L-valina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>13C5-L-valina</td><td>Eurisotop</td><td>CLM-2249-H-0.25</td><td></td></tr><tr><td>13C6-L-Leucina</td><td>Eurisotop</td><td>CLM-2262-H-0.25</td><td></td></tr><tr><td>15N-Cloruro di ammonio</td><td>Eurisotop</td><td>NLM-467-1</td><td></td></tr><tr><td>ALPHA-15N-L-Glutammina</td><td>Eurisotop</td><td>NLM-1016-1</td><td></td></tr><tr><td>U-15N4-L-Arginina</td><td>Eurisotop</td><td>NLM-396-PK</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di etile</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>270989</tr><tr><td>Propanato di etile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>112305</td><td></td></tr><tr><td>2-metilpropanato di etile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>246085</td><td></td></tr><tr><td>Butanoato di etile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E15701</td><td></td></tr><tr><td>2-metilbutanoato di etile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>306886</td><td></td></tr><tr><td>3-metilbutanoato di etile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8.08541.0250</td><td></td></tr><tr><td>Esanoato di etile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>148962</td><td></td></tr><tr><td>Ottanoato di etile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W244910</td><td></td></tr><tr><td>Decanoato di etile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W243205</td><td></td></tr><tr><td>Dodecanoato di etile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W244112</td><td></td></tr><tr><td>Lattato di etile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W244015</td><td></td></tr><tr><td>Dietil succinato</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>W237701</tr><tr><td>acetato di 2-metilpropile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W217514</td><td></td></tr><tr><td>acetato di 2-metilbutile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W364401</td><td></td></tr><tr><td>acetato di 3-metilbutile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>287725</td><td></td></tr><tr><td>acetato di 2-feniletil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>290580</td><td></td></tr><tr><td>2-metilpropanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>294829</td><td></td></tr><tr><td>2- metilbutanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>133051</td><td></td></tr><tr><td>3-metilbutanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>309435</td><td></td></tr><tr><td>Esanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>128570</td><td></td></tr><tr><td>2-feniletanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77861</td><td></td></tr><tr><td>Acido propanoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94425</td><td></td></tr><tr><td>Acido butanoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>19215</td><td></td></tr><tr><td>Acido 2-metilpropanoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>58360</td><td></td></tr><tr><td>Acido 2-metilbutanoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>193070</td><td></td></tr><tr><td>Acido 3-metilbutanoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W310212</td><td></td></tr><tr><td>Acido esanoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>153745</td><td></td></tr><tr><td>Acido ottanoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W279900</td><td></td></tr><tr><td>Acido decanoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W236403</td><td></td></tr><tr><td>Acido dodecanoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L556</td><td></td></tr><tr><td>Fermentatore 1L</td><td>Legallais</td><td>AT1357</td><td>Fermentatore fatto a mano per fermentazione</td></tr><tr><td>Sistema di filtrazione sottovuoto monouso</td><td>Dominique Deutscher</td><td>029311</td><td></td></tr><tr><td>Fermentatori (250 ml)</td><td>Legallais</td><td>AT1352</td><td>Fermentatore fatto a mano per fermentazione</td></tr><tr><td>Tubi sterili</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Serrature di fermentazione</td><td>Legallais</td><td>AT1356</td><td>Serrature di fermentazione fatte a mano per la fermentazione</td></tr><tr><td>BactoYeast Extract</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>BactoPeptone</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore per</td><td>incubatore Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Particle Counter</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605697</td><td>Multisizer 3 Coulter Counter</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Jouan</td><td></td><td>GR412</td></tr><tr><td>Plate Butler Sistema robotico</td><td>Servizi di laboratorio BV</td><td>PF0X-MA</td><td>Strumento automatico</td></tr><tr><td>Software per maggiordomo a piastre</td><td>Servizi di laboratorio BV</td><td></td><td>Software di monitoraggio robot</td></tr><tr><td>RobView</td><td></td><td></td><td>Software di calcolo sviluppato internamente</td></tr><tr><td>My SQL</td><td></td><td></td><td>Database di fonti internazionali</td></tr><tr><td>Cimarec i Telesystem Agitatori multipunto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50088009</td><td>String Drive 60</td></tr><tr><td>BenchBlotter piattaforma rocker</td><td>Dutscher</td><td>60903</td><td></td></tr><tr><td>Kit enzimatico ammoniaca</td><td>R-Biopharm AG</td><td>5390</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro cuvette</td><td>VWR</td><td>634-0678</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro UviLine 9400</td><td>Secomam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi standard fisiologici - acidi e neutri</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6407</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi standard fisiologici - nozioni di base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6282</td><td></td></tr><tr><td>Citrato tamponi litio - Reagente ultra ninidrina</td><td>Biochrom</td><td>BC80-6000-06</td><td></td></tr><tr><td>Acido solfosalicilico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2130</td><td></td></tr><tr><td>Norleucina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N1398</td><td></td></tr><tr><td>Biochrom 30 AAA</td><td>Biochrom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZChrom</td><td>Elite Biochrom</td><td></td><td>Software di controllo dello strumento e analisi dei dati</td></tr><tr><td>Resina Ultropac 8 Litio</td><td>Biochrom</td><td>BC80-6002-47</td><td>Filtro a colonna fisiologica ad alta risoluzione al litio</td></tr><tr><td>Millex GV</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGVX13NL</td><td>Millex GV 13mm (dimensione dei pori 0,22 &; micro; m)</td></tr><tr><td>Filtro a membrana PALL VWR</td><td></td><td>514-4157</td><td>Supor-450 47mm 0.45&micro; m</td></tr><tr><td>Pompa a vuoto Millivac Mini</td><td>Millipore</td><td>XF5423050</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di pesatura liscio in alluminio 70mm</td><td>VWR</td><td>611-1380</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia di precisione</td><td>Mettler</td><td></td><td>Specifiche AE163</td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido essiccato</td><td>Merck</td><td>1029310161</td><td>(max. 0,025% H2O) SeccoSolv</td></tr><tr><td>Forno a combustione</td><td>Legallais</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine Pierce BCA</td><td>Interchim</td><td>UP40840A</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Fluka</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico fumante 37% Emsure</td><td>Merck</td><td>1003171000</td><td>Grado ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Tampone acetato di litio</td><td>Biochrom</td><td>80-2038-10</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione commerciale di amminoacidi idrolizzati</td><td>Sigma Aldrich</td><td>AAS18</td><td></td></tr><tr><td>L-Metionina sulfone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0876</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-cisteico monoidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30170</td><td></td></tr><tr><td>Provette per coltura in vetro Pyrex</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z653586</td><td></td></tr><tr><td>Piridina</td><td>Acros Organics</td><td>131780500</td><td>99% Extrapuro</td></tr><tr><td>Etil cloroformiato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23131</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32222</td><td></td></tr><tr><td>Fiale</td><td>Sigma Aldrich</td><td>854165</td><td></td></tr><tr><td>Microinserti per fiale da 1,5 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SU860066</td><td></td></tr><tr><td>GC/MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>5890 GC/5973 MS</td><td></td></tr><tr><td>Chemstation</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Software per il controllo e l'analisi dei dati</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td>Chromasolv, per HPLC</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td>ChromasolvPlus, per HPLC</td></tr><tr><td>N,N-Dimetilformammide dimetil acetale</td><td>Sigma Aldrich</td><td>394963</td><td></td></tr><tr><td>Colonna BSTFA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>33024</td><td></td></tr><tr><td>DB-17MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>122-4731</td><td>30m*0,25mm*0,15&micro; m</td></tr><tr><td>Solfato di sodio, anidro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238597</td><td></td></tr><tr><td>Azoto tecnico</td><td>Prodotti per l'aria</td><td>14629</td><td></td></tr><tr><td>Colonna Zebron ZB-WAX</td><td>Phenomenex</td><td>7HG-G007-11</td><td>30m*0.25mm*0.25&micro; m</td></tr><tr><td>Helium BIP</td><td>Air products</td><td>26699</td><td></td></tr><tr><td>Pipette in vetro Pasteur</td><td>VWR</td><td>612-1702</td><td></td></tr></tbody></table>

flusso di lavoro basato sulla combinazione di tracciante isotopico esperimenti per studiare il metabolismo microbico di più fonti di nutrienti

Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources

Studi nel campo della microbiologia si basano sull'attuazione di una vasta gamma di metodologie. In particolare, lo sviluppo di metodi appropriati sostanzialmente contribuisce a fornire una vasta conoscenza del metabolismo dei microrganismi crescono in media chimicamente definite che contengono azoto unico e fonti di carbonio. Al contrario, la gestione attraverso il metabolismo di più fonti di nutrienti, nonostante la loro ampia presenza in ambienti naturali o industriali, rimane praticamente inesplorata. Questa situazione è dovuto principalmente alla mancanza di metodologie, che ostacola le indagini.
Segnaliamo una strategia sperimentale in modo completo e quantitativamente esplorare come metabolismo opera quando una sostanza nutriente è fornito come una miscela di molecole diverse, vale a dire, una risorsa complessa. Qui, descriviamo la sua applicazione per valutare il partizionamento di molteplici fonti di azoto attraverso la rete metabolica di lievito. Il flusso di lavoro combina le informazioni ottenute durante gli esperimenti di tracciante isotopo stabile utilizzando selezionati 13C - o 15N-etichettati substrati. In primo luogo è costituito da fermentazioni parallele e riproducibile sullo stesso supporto, che include una miscela di molecole contenenti N; Tuttavia, una fonte di azoto selezionato è etichettata ogni volta. Una combinazione di procedure analitiche (HPLC, GC-MS) è implementata per valutare i modelli di etichettatura di composti mirati e per quantificare il consumo e il recupero dei substrati in altri metaboliti. Un'analisi integrata del dataset completo fornisce una panoramica del destino di substrati consumati all'interno delle cellule. Questo approccio richiede un preciso protocollo per la raccolta di campioni – agevolato da un sistema di robot-assistita per il monitoraggio online delle fermentazioni – e il raggiungimento di numerose analisi che richiede tempo. Nonostante questi vincoli, essa ha consentito di comprendere, per la prima volta, il partizionamento di molteplici fonti di azoto in tutta la rete metabolica di lievito. Abbiamo determinato le origini metaboliche di molecole volatili e gli aminoacidi proteinogenici e delucidato la ridistribuzione di azoto da fonti più abbondanti verso altri N-composti.

Figura 3 presenta un diagramma schematico del flusso di lavoro che è stato implementato per studiare la gestione da lievito delle molteplici sorgenti di azoto che si trovano durante la fermentazione del vino. Per i diversi punti di campionamento, le caratteristiche di parametri – crescita biologica, modelli di consumo di azoto e il profilo di aminoacidi proteinogenici – Visualizza un'elevata riproducibilità tra fermentazioni (Figura 4<...

Questo protocollo descrive una procedura sperimentale per in modo completo e quantitativamente studiare il metabolismo di più fonti di nutrienti. Questo flusso di lavoro, basato su una combinazione di tracciante isotopico esperimenti e una procedura analitica, permette il destino dei nutrienti consumati e l'origine metabolica delle molecole sintetizzate da microrganismi deve essere determinato.

Flusso di lavoro basato sulla combinazione di tracciante isotopico esperimenti per studiare il metabolismo microbico di più fonti di nutrienti

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare quantitativamente il metabolismo di più fonti di nutrienti utilizzando substrati etichettati. Questo flusso di lavoro consente di determinare il destino dei nutrienti consumati e l'origine metabolica dei composti sintetizzati dai lieviti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del metabolismo microbico, come ad esempio come funziona tutto il metabolismo a seconda delle condizioni ambientali.Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di chiarire e quantificare la distribuzione delle proteine dei nutrienti da più fonti. Questo metodo è stato utilizzato per studiare il metabolismo dell'azoto del lievito, ma può essere applicato anche ad altri metabolismi e microrganismi. La chiave del successo di questo esperimento risiede nella riproducibilità delle fermentazioni.Gli utenti devono prestare particolare attenzione a raccogliere le cellule nello stesso stadio fisiologico definito. A dimostrare la procedura saranno Christian Picou del nostro staff tecnico, Pauline Seguinot, dottoranda del laboratorio, e Stephanie Rollero, borsista post-dottorato. In autoclave, pastorizzare ogni mezzo si

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Stabile mediante l'analisi isotopica profilazione di massa gas-cromatografia spettrometria di flusso intermediario metabolica è descritto nel...

Stabile Profiling isotopica di Flux Intermediario Metabolica in fase di sviluppo e per adulti Caenorhabditis elegans</em

13 C-isotopo etichettatura è una tecnica utile per determinare il metabolismo cellula centrale per vari tipi di microrganismi. Dopo che le cellule sono state coltivate con un substrato specifico etichettato, GC-MS di misurazione in grado di rivelare vie metaboliche funzionali basati su modelli di etichettatura unico nel proteinogenici aminoacidi.

Percorso di conferma metaboliche e scoperta attraverso 13 C-etichettatura dei proteinogenici Aminoacidi

La comunità batterica attivo associato con l'intestino di Spodoptera littoralis, è stato determinato mediante stabile-isotopo probing (SIP) accoppiato a pyrosequencing. Utilizzando questa metodologia, l'identificazione delle specie di batteri metabolicamente attivi all'interno della comunità è stato fatto con alta risoluzione e precisione.

Identificazione dei batteri metabolicamente attivo nell&#39;intestino del generalista<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Via DNA isotopi stabili Probing Utilizzo<sup&gt; 13</sup&gt; C-glucosio

materia organica disciolta fornisce una fonte importante di energia e nutrienti per lo streaming ecosistemi. Qui mostriamo un metodo basato su campi di manipolare il pool ambiente di materia organica disciolta in situ tramite impulsi di nutrienti facilmente replicabili.

Capire disciolto materia organica Biogeochimica Attraverso<em&gt; In Situ</em&gt; Nutrienti Manipolazioni in Stream ecosistemi

Questo articolo descrive un metodo per studiare il metabolismo cellulare in comunità complesse di più tipi di cellule, utilizzando una combinazione di tracciamento di isotopi stabili, smistamento cellulare per isolare specifici tipi di cellule e spettrometria di massa.

Un metodo per misurare il metabolismo in Ordinati sottopopolazioni di cellule Comunità complessi utilizzando Stable Isotope Tracing

Questo articolo descrive protocolli dettagliati per la fabbricazione di ecosistema di dispositivi (EcoFABs) che permettono studi di piante e interazioni piante-microrganismi in condizioni di laboratorio altamente controllate.

Protocolli di fabbricazione (EcoFAB) di ecosistema per la costruzione degli ecosistemi di laboratorio progettato per studiare le interazioni piante-microrganismi

Questo protocollo descrive un singolo throughput per complementari tecniche analitiche e omiche che culmina in una caratterizzazione completamente accoppiato di sostanza organica naturale e proteomica microbica in ecosistemi differenti. Questo approccio permette confronti robusti per identificare vie metaboliche e trasformazioni importanti per descrivere la produzione di gas serra e predire le risposte al cambiamento ambientale.

Singolo-velocità effettiva complementari ad alta risoluzione tecniche analitiche per la caratterizzazione di miscele complesse di sostanza organica naturale

Presentato qui è un protocollo per una tecnica a singola cellula, basata sulla microscopia a epifluorescenza per quantificare i tassi di pascolo negli eucarioti predatori acquatici con alta precisione e risoluzione tassonomica.

Fluorescently etichettato batteri come un tracciante per rivelare nuovi percorsi di flusso organico di carbonio negli ecosistemi acquatici

Viene dimostrato un nuovo metodo di preparazione del campione per l'analisi di macrocolonie batteriche a base di agar mediante spettrometria di massa con desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice.

Studio della cooperazione microbica mediante spettrometria di massa per immagini Analisi di colonie batteriche cresciute su agar e nei tessuti durante l'infezione

Qui, presentiamo un protocollo che utilizza l'ibridazione in situ a fluorescenza fototermica ottica a infrarossi (OPTIR-FISH), nota anche come FISH fototermica nel medio infrarosso (MIP-FISH), per identificare le singole cellule e comprenderne il metabolismo. Questa metodologia può essere ampiamente applicata per diverse applicazioni, tra cui la mappatura del metabolismo cellulare con la risoluzione di una singola cellula.

Ibridazione in situ a fluorescenza infrarossa fototermica ottica (OPTIR-FISH)

Scopri un metodo per studiare il metabolismo microbico di più fonti di nutrienti utilizzando traccianti isotopici. Questa tecnica consente di determinare la destinazione dei nutrienti consumati e l'origine metabolica dei composti sintetizzati dai microrganismi.

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Flusso di lavoro basato sulla combinazione di tracciante isotopico esperimenti per studiare il metabolismo microbico di più fonti di nutrienti

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