Amplificazione dell'obiettivo delle cellule pre-arricchimento e intero genoma per singola cella a valle caratterizzazione

Questo protocollo è quello di recuperare e preparare cellule bersaglio rara da una miscela con cellule non-bersaglio della priorità bassa per la caratterizzazione genetica molecolare a livello di singola cellula. Qualità del DNA è uguale a cellule singole non trattata e permette per cella singola applicazione (entrambi screening basato e analisi mirate).

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le cellule dalla sospensione cellulare al fine di renderle disponibili per l'analisi a valle di singole cellule. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel contesto delle biopsie liquide e dell'eterogeneità cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'isolamento di singole cellule basato su anticorpi e il loro recupero per la successiva analisi genetica molecolare a livello di singola cellula.

Una volta autorizzata per il suo uso nei pazienti, questa tecnica consentirà la caratterizzazione delle cellule tumorali circolanti di pazienti oncologici. Poiché questo metodo può fornire informazioni sull'eterogeneità tra le singole cellule, può essere applicato a tutti i tipi di sospensioni cellulari contenenti sottopopolazioni come campioni di sangue, campioni di colture cellulari o tessuti e organi dissociati. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo utilizzato un dispositivo di arricchimento in vivo non in grado di rilasciare cellule ai fini dell'analisi a valle.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di raccolta di singole cellule mediante microdissezione laser o micromanipolazione sono difficili da eseguire con successo perché il processo di raccolta di singole cellule è soggetto a perdita cellulare e richiede un alto livello di competenza. In un millilitro di terreno di coltura cellulare preriscaldato, risospendere le cellule marcate con HT-29 CFSE e lasciarle rigenerare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Per raccogliere le cellule, centrifugare a 300 g per tre minuti.

Quindi, risospendere il pellet cellulare in un millilitro di soluzione di colorazione del DNA Hoechst 33342 pronta all'uso a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, centrifugare la sospensione cellulare a 300 g per tre minuti. Quindi, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in quattro millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato 1X.

Quindi, contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro e verificare la marcatura a fluorescenza con il microscopio a fluorescenza. Quindi, centrifugare le celle a 300 g per tre minuti, scartare il surnatante e risospendere il pellet a circa 500.000 cellule per millilitro e posizionare le cellule sul ghiaccio. In cinque millilitri di sangue periferico, aggiungere circa 500-500.000 cellule e poi mescolare capovolgendo la provetta.

Dopo aver rimosso il filo dal vano portaoggetti, rimuovere il tappo di gomma che trattiene il filo e lavare il filo con soluzione salina tamponata con fosfato 1X e montarlo nel tappo del tubo. Quindi, incubare la provetta su un miscelatore a rulli inclinati a cinque rotazioni al minuto per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, sciacquare tre volte il filo con soluzione salina tamponata con fosfato 1X.

Quindi, conservare il filo in una provetta da 15 millilitri contenente soluzione salina tamponata con fosfato 1X al buio. Disegna un'area rettangolare su un vetrino usando una penna per grasso, quindi aggiungi 500 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato 1X. Per immergere la parte funzionale del filo in soluzione salina tamponata con fosfato 1X, piegare la parte non funzionale del filo e posizionarla sul vetrino.

Per contare il numero di celle catturate, ispezionare visivamente entrambi i lati del filo. Dopo l'ispezione, ritrasferire il filo nella provetta da 15 millilitri con soluzione fisiologica tamponata con fosfato 1X e tenerlo al buio. In un millilitro di soluzione salina tamponata con fosfato 1X, sciogliere quattro milligrammi del componente tampone di rilascio, quindi filtrare la soluzione attraverso un filtro sterile da 0,2 micrometri per ottenere il tampone pronto all'uso.

Quindi, scaldare il tampone di rilascio a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Una volta riscaldato, trasferire 1,6 millilitri di tampone di rilascio per riempire completamente una provetta di reazione da 1,5 millilitri. Quindi, incubare la parte funzionale del filo nel tampone di rilascio a 37 gradi Celsius a bagnomaria per 20 minuti.

Dopo l'incubazione, posizionare il filo su uno shaker a 500 rotazioni al minuto per 15 minuti. Quindi, centrifugare il filo a 300 g per 10 minuti. Una volta terminata la centrifugazione, spostare il filo dalla provetta, chiudere il tappo e centrifugare nuovamente la provetta a 300 g per 10 minuti.

Per ridurre il volume della sospensione cellulare, scartare tutti tranne 100 microlitri di surnatante per la micromanipolazione o 300 microlitri per la successiva citocentrifugazione e microdissezione laser. Quindi, procedere rapidamente al campionamento di singole cellule. Per la micromanipolazione, trasferire tutti i 100 microlitri di sospensione cellulare su un vetrino.

Quindi, posizionare il vetrino su un microscopio dotato di micromanipolatore e lasciare che le cellule si stabilizzino per cinque minuti. Quindi, in provette PCR da 0,2 millilitri, pipettare due microlitri di master mix di lisi cellulare e trasferire su ghiaccio. Utilizzare il micromanipolatore per raccogliere una singola cellula in un microlitro di soluzione salina tamponata con fosfato 1X.

Quindi, trasferire la cellula direttamente in due microlitri di miscela master di lisi cellulare. Utilizzare un microfuge da tavolo per centrifugare rapidamente i campioni a 2.000 g per tre secondi per raccogliere il liquido sul fondo della provetta. Quindi, trasferire il campione su ghiaccio e procedere all'amplificazione dell'intero genoma basata su adapter-linker.

Aspirare una sola cellula utilizzando al massimo un microlitro di tampone. Quando si trasferisce la cella nella soluzione di lisi, assicurarsi di vedere le bolle che emergono dalla soluzione, indicando che tutto il volume aspirato è stato trasferito. Per la microdissezione laser, citocentrifugare tutti i 300 microlitri di sospensione cellulare su un vetrino rivestito di membrana a 300 g per cinque minuti.

Quindi, posizionare il vetrino rivestito su membrana su un microscopio in grado di eseguire la microdissezione laser. Quindi, pipettare 4,5 microlitri di miscela master di lisi cellulare nel tappo della provetta PCR da 0,2 millilitri. Posizionare il tappo sopra il campione e raccogliere una singola cellula mediante microdissezione laser.

Subito dopo, verificare la presenza di cellule isolate nel tappo per PCR, rimuovere la provetta per PCR dal microscopio di microdissezione laser e chiudere la provetta . Raccogli tutto il liquido sul fondo del tubo con una breve centrifuga. Trasferire il campione su ghiaccio e procedere all'amplificazione dell'intero genoma basata su adapter-linker.

Assicurati di recuperare la cella microsezionata al laser. Pertanto, è importante coprire l'intero tappo del tubo con la soluzione di lisi. Dopo la microdissezione, controllare il tappo della provetta per la presenza della cellula.

Per mostrare le cellule colorate con CFSE e Hoechst 33342, l'imaging in immunofluorescenza è stato eseguito prima di caricare il filo, durante il collegamento delle cellule al filo, quindi staccato dal filo e infine sul vetrino. Le immagini di immunofluorescenza delle cellule prima della carica mostrano una colorazione nucleica brillante in blu, mentre il citoplasma delle cellule mostra una colorazione verde CFSE con intensità intercellulare eterogenea. Un modello di colorazione simile si osserva anche per le cellule che vengono attaccate e successivamente staccate dal filo.

Per verificare la qualità dell'intero prodotto di amplificazione del genoma, è stato eseguito un gel di agarosio all'1%. Il gel di agarosio mostra uno striscio di DNA che varia da 0,2 a più di 1 kilobase per i prodotti della PCR di amplificazione dell'intero genoma. I prodotti PCR per il controllo qualità 4plex ottenuti dalla singola cella producono prodotti da 100, 200, 300 e 400 coppie di basi.

I prodotti che mostrano meno di tre bande sono esclusi da ulteriori analisi. Una volta padroneggiata, questa tecnica consente l'isolamento di singole cellule da sospensioni cellulari in quattro ore, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere le cellule immerse nel tampone, soprattutto durante il tempo in cui le cellule sono attaccate al filo per evitare di danneggiare le cellule.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire metodi di analisi come l'ibridazione genomica comparativa dell'area, il sequenziamento di nuova generazione e la PCR target-specifica per caratterizzare singole cellule in base alle variazioni del numero di copie e alle mutazioni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare e recuperare le cellule da sospensioni cellulari utilizzando un filo funzionalizzato e come campionare singole cellule per più analisi genetiche molecolari a valle. Non dimenticare che lavorare con il sangue umano comporta la possibilità di infezione, quindi indossare guanti e un camice da laboratorio è obbligatorio durante l'esecuzione di questa procedura.