In pool shRNA schermo per riattivazione di MeCP2 sul cromosoma di X inattivo

Iniziare questa procedura con la preparazione dei fibroblasti tendinei di topo, come descritto nel protocollo di testo. Raccogliere le cellule da una piastra di 10 centimetri aspirando prima il terreno. Quindi aggiungere un millilitro di tripsina EDTA allo 0,05% e incubare per due-cinque minuti a 37 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, estinguere la tripsina con nove millilitri di DMEM-10 e raccogliere le cellule risospese in una provetta conica da 15 millilitri. Diluire le cellule con DMEM-10 fino a una concentrazione finale di una cellula per 100 microlitri. Quindi trasferire le cellule in piastre da 96 pozzetti pipettando 100 microlitri di sospensione in ciascun pozzetto.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius fino a quando i pozzetti non sono confluenti, operazione che può richiedere fino a due o tre settimane. Sostituire il supporto con DMEM-10 nuovo ogni tre-cinque giorni. Quando sono confluenti, mobilizzare le cellule con 20 microlitri di tripsina EDTA allo 0,05% per pozzetto e dividerle in due set duplicati di piastre da 96 pozzetti.

Saggio per l'attività della luciferasi in una serie di piastre. Utilizzare un test omogeneo della luciferasi Firefly che non richieda la rimozione del terreno, seguendo il protocollo incluso nel kit del test della luciferasi. Utilizzare i risultati del test per selezionare i cloni senza attività di luciferasi rilevabile dal restante set di piastre.

Espandi questi cloni prima in una piastra a 24 pozzetti e poi in una piastra a sei pozzetti. Esegui lo stesso per un clone con la più alta attività della luciferasi. Questo verrà utilizzato come controllo positivo ai fini della convalida.

Dopo l'espansione nella piastra a sei pozzetti, raccogliere un'aliquota di ciascun pozzetto per un Western blot. Mobilizzare le cellule con 200 microlitri di tripsina EDTA allo 0,05%. Incubare le cellule per due-cinque minuti a 37 gradi Celsius.

Spegnere le cellule con due millilitri di DMEM-10 e trasferire metà delle cellule in un'altra piastra a sei pozzetti. Attendere che le celle si attacchino al fondo della piastra. Quindi lavare le cellule una volta con PBS prima della lisi per il Western blot.

Piastra diversi cloni negativi a 0,2 milioni di cellule per pozzetto in una piastra a sei pozzetti. Trattare le cellule una volta con 10 micromolari di 5-azacitidina. Quindi incubare per 72 ore senza cambiare il terreno prima di testare l'attività della luciferasi, come prima.

Quindi, scegli un clone negativo che ha acquisito attività di luciferasi con 5-azacitidina per lo schermo e inizia ad espanderlo a più piastre da 10 centimetri. Congelare i cloni negativi rimanenti in azoto liquido come backup. Il clone positivo può essere mantenuto nella coltura tissutale o congelato fino a nuovo utilizzo.

Al mattino, piastreggiare un milione di cellule X inattive su piastre di coltura tissutale da 10 centimetri. Nel pomeriggio, infettare le piastre sostituendo il terreno con DMEM-10 fresco contenente una quantità predeterminata di surnatante virale e da cinque a 10 microgrammi per millilitro di polibrene. Dopo 18-24 ore, aspirare il terreno e aggiungere 10 millilitri di DMEM-10 fresco a ciascuna piastra.

Piastre di coltura per altre 48 ore. Al mattino, mobilizzare le cellule utilizzando un millilitro di tripsina EDTA allo 0,05% per piastra e spegnere le cellule con 9 millilitri di DMEM-10 per piastra. Far passare la sospensione attraverso un filtro a maglie da 100 micron.

Unire le sospensioni filtrate e seminare due serie di piastre da 10 centimetri a un milione di celle per piastra. Nel pomeriggio, sostituire il terreno in un set di piastre con DMEM-10 contenente 15 microgrammi per millilitro di igromicina B.In l'altro set, sostituire il terreno con solo DMEM-10 fresco. Dopo 48 ore, mobilizzare le cellule dalle piastre non trattate di igromicina B utilizzando un millilitro di tripsina EDTA allo 0,05%.

Incubare da due a cinque minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, spegnere le cellule con 9 millilitri di DMEM-10. Estrarre i singoli campioni e procedere immediatamente con l'estrazione del DNA.

Continuare a coltivare il set di selezione dell'igromicina B per altri sei giorni, reintegrando il terreno di selezione con DMEM-10 fresco contenente igromicina B a giorni alterni. Il sesto giorno, sostituire il supporto di selezione solo con DMEM-10 nuovo. Attendere quattro giorni per il recupero, quindi raccogliere il DNA del campione post-selezione come prima.

Procedere all'identificazione delle forcine arricchite nei campioni post-selezione, come descritto nel protocollo di testo. Per convalidare i risultati, è stato prima seminato otto milioni di celle da 293 piedi per piastra su piastre da 10 centimetri. Il giorno seguente, sostituire il terreno con nove millilitri di DMEM-10 privo di antibiotici per piastra 30 minuti prima della transezione.

Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di miscela di trasfezione una a ciascuna aliquota della miscela di trasfezione due e mescolare delicatamente mediante pipettaggio. Quindi incubare la miscela a temperatura ambiente per 20 minuti. Applicare il composto su ogni piastra a goccia e far roteare delicatamente la piastra per mescolare.

Il giorno seguente, sostituire il terreno con cinque millilitri di DMEM-10,48 ore dopo la trasfezione iniziale, raccogliere il surnatante lentivirale e farlo passare attraverso un filtro da 0,22 micron che è stato prebagnato con DMEM-10 per massimizzare il recupero. La mattina successiva, piastra 0,1 milioni di cellule X inattive per pozzetto su piastre a sei pozzetti. Nel pomeriggio, infettare le piastre sostituendo il terreno con due millilitri di DMEM-10 fresco contenente surnatante lentivirale e da cinque a 10 microgrammi per millilitro di polibrene.

Infettare un pozzetto di controllo con surnatante virale prodotto da un vettore lentivirale vuoto. Il giorno seguente, sostituire il terreno con due millilitri di DMEM-10 contenenti un milligrammo per millilitro di puromicina. Utilizzare la selezione per quattro giorni.

Dopo quattro giorni, sostituire il terreno con due millilitri di DMEM-10 fresco e attendere da 48 a 72 ore per il recupero. Dopo aver mobilizzato le cellule con 150 microlitri di tripsina EDTA allo 0,05%, incubarle per due-cinque minuti a 37 gradi Celsius. Spegnere le celle con 1,5 millilitri di DMEM-10 prima di trasferirle in provette coniche e centrifugare le celle a temperatura ambiente a 500 volte G per 10 minuti.

Rimuovere il terreno e risospendere le cellule in 100 microlitri di tampone di lisi fornito nel kit del saggio della luciferasi. Incubare la sospensione a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo cinque minuti, trasferire la sospensione in una piastra bianca a 96 pozzetti.

Eseguire il test in camera oscura, seguendo il protocollo incluso nel kit. Utilizzare le cellule X attive come controllo positivo e le cellule X negative infettate con un vettore lentivirale vuoto come controllo negativo. I cloni immortalizzati di fibroblasti tendinei di topo mostrano un'attività luciferasica positiva o negativa di Firefly, coerente con il posizionamento del reporter sul cromosoma X attivo o inattivo, rispettivamente.

L'espressione di MeCP2, come determinata dal Western blot, mostra il modello reciproco. Si noti che l'attività della luciferasi Firefly può essere indotta in cloni negativi con somministrazione di 5-azacitidina. Se presente sul cromosoma X attivo, il gene di resistenza all'igromicina conferisce un vantaggio di sopravvivenza nella selezione dell'igromicina, rispetto alle cellule con il gene sul cromosoma X inattivo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come progettare ed eseguire uno screening per i regolatori dell'inattivazione del cromosoma X utilizzando reporter inseriti selettivamente sul cromosoma X inattivo. Il mio laboratorio ha precedentemente effettuato screening di basi per i regolatori della cromatina nel lievito e il nostro successo con questo approccio mi ha ispirato a progettare questo screening per i regolatori dell'inattivazione del cromosoma X nelle cellule di mammifero. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'utilizzo di piccoli RNA interferenti, CRISPR, piccole molecole per aiutare a rispondere a ulteriori domande sull'inattivazione del cromosoma X nelle cellule di mammifero.