Name: Imaging ad alta risoluzione confocale della barriera sangue - cervello: Imaging, ricostruzione 3D e quantificazione di transcitosi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Impara l'imaging confocale ad alta risoluzione della barriera ematoencefalica nel topo per ricostruzione 3D e quantificazione di organelli subcellulari. Questo metodo avanzato supporta la ricerca neurovascolare.

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R.V. lavoro è stato supportato da una borsa di studio post-dottorato Roche (2014-2017).

<ol><li>Blanchette, M., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+maintenance+of+the+BBB%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Formation and maintenance of the BBB.</a> Mech Dev. 138, Pt 1 8-16 (2015).</li>
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<li>Preston, J. E., Joan Abbott, N., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcytosis+of+macromolecules+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Transcytosis of macromolecules at the blood-brain barrier.</a> Adv Pharmacol. 71, 147-163 (2014).</li>
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<li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRP-1-mediated+intracellular+antibody+delivery+to+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">LRP-1-mediated intracellular antibody delivery to the Central Nervous System.</a> Sci Rep. 5, 11990(2015).</li>
<li>Hsu, J., Rappaport, J., Muro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+binding%2C+uptake%2C+and+transport+of+ICAM-1-targeted+nanocarriers+across+endothelial+and+subendothelial+cell+components+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Specific binding, uptake, and transport of ICAM-1-targeted nanocarriers across endothelial and subendothelial cell components of the blood-brain barrier.</a> Pharm Res. 31 (7), 1855-1866 (2014).</li>
<li>Siupka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+apical-basal+traffic+of+the+cation-independent+mannose-6-phosphate+receptor+in+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells.</a> J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).</li>
<li>Zlokovic, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+saturable+mechanism+for+transport+of+immunoglobulin+G+across+the+blood-brain+barrier+of+the+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A saturable mechanism for transport of immunoglobulin G across the blood-brain barrier of the guinea pig.</a> Exp Neurol. 107 (3), 263-270 (1990).</li>
<li>Deane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG-assisted+age-dependent+clearance+of+Alzheimer%27s+amyloid+beta+peptide+by+the+blood-brain+barrier+neonatal+Fc+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">IgG-assisted age-dependent clearance of Alzheimer's amyloid beta peptide by the blood-brain barrier neonatal Fc receptor.</a> J Neurosci. 25 (50), 11495-11503 (2005).</li>
<li>Cabezon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+applied+to+study+the+trafficking+of+8D3-coated+gold+nanoparticles+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Serial block-face scanning electron microscopy applied to study the trafficking of 8D3-coated gold nanoparticles at the blood-brain barrier.</a> Histochem Cell Biol. , (2017).</li>
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<li>Collin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+uptake+of+tau%2FpS422+antibody+and+reduced+progression+of+tau+pathology+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Neuronal uptake of tau/pS422 antibody and reduced progression of tau pathology in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Brain. 137 (10), 2834-2846 (2014).</li>
<li>Villasenor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+Endogenous+Immunoglobulins+by+Endothelial+Cells+at+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Trafficking of Endogenous Immunoglobulins by Endothelial Cells at the Blood-Brain Barrier.</a> Sci Rep. 6, 25658(2016).</li>
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<li>Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+vesicles+in+the+blood-brain+barrier%3A+are+they+related+to+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial vesicles in the blood-brain barrier: are they related to permeability.</a> Cell Mol Neurobiol. 20 (2), 149-163 (2000).</li>
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</ol>

Gli autori sono sotto lavoro retribuito da Roche.

Il protocollo di cui sopra descrive la preparazione di sezioni digalleggiante del cervello, macchiatura immunofluorescente, acquisizione di immagini e parametri di analisi per microscopia ad alta risoluzione della BBB. Questo metodo è stato recentemente utilizzato per studiare la localizzazione di anticorpo consegna piattaforme3, il trasporto di IgG endogeno attraverso la BBB17e l'eterogeneità della BBB su Pericita perdita18. Diverse fasi del protocollo possono essere modificati per adattarsi all'obiettivo specifico dell'esperimento. In primo luogo, l'uso di sezioni spesse (100 µm) facilita la loro manipolazione durante le procedure di montaggio e di immunostaining. Permette anche per la ricostruzione 3D della rete capillare, l'unità neurovascolare e per la generazione di sezioni trasversali NVU e capillare. Tuttavia, penetrazione di anticorpi all'interno delle sezioni del tessuto può variare e alcuni macchiatura dell'anticorpo può essere limitata allo strato superficiale del tessuto vicino il vetrino coprioggetti. Il protocollo può essere modificato aumentando la concentrazione di detersivo durante il passaggio di permeabilizzazione e/o la lunghezza del passo permeabilizzazione per migliorare la penetrazione dell'anticorpo nel tessuto. In secondo luogo, la qualità dell'immagine può essere compromessa quando si tenta di acquisire immagini più profonde all'interno del tessuto (di solito 20-30 µm sotto la superficie) a causa di dispersione della luce così come aberrazioni ottiche dalla mancata corrispondenza di indice di rifrazione. Per ovviare a questo problema, nuovi metodi per schiarimento del tessuto e dell'anticorpo attivo penetrazione20 possono essere combinati con questo protocollo per grandi volumi di immagini del tessuto. In terzo luogo, deconvoluzione viene eseguita dopo l'acquisizione di immagini per migliorare la risoluzione assiale dell'immagine. La scelta dell'algoritmo di deconvoluzione cieco utilizzato in questo protocollo si basava su (i) la sua facilità d'uso, come richiesto, nessun pre-calcolo della funzione di diffusione del punto (ii) la sua robustezza per il miglioramento della qualità di immagine21e (iii) la mancanza di manufatti su mIgG strutture intracellulari dopo l'implementazione. A seconda delle strutture intracellulari visualizzate nell'esempio, altri algoritmi di deconvoluzione potrebbero causare immagini di qualità superiore. I seguenti riferimenti21,22 forniscono un ampio dibattito sui vantaggi e limitazioni degli ulteriori algoritmi di deconvoluzione di immagine. Infine, l'uso di un pacchetto di software di analisi di immagine ha permesso la segmentazione dei capillari e strutture intracellulari in tre dimensioni. Chiaramente l'analisi dell'immagine non è limitato al software descritto nel protocollo e pacchetti alternativi, ad esempio quelli discussi in riferimento23, può essere utilizzato per immagini del segmento. L'idoneità dei programmi software diversi per l'analisi delle strutture intracellulari attraverso la Bee deve essere verificata empiricamente valutando la precisione di segmentazione di immagini.
Poiché questo metodo si basa su campioni fissati, non fornisce informazioni dirette sulle dinamiche di transcitosi attraverso la Bee. Tuttavia, si può abbinare con esperimenti di tempo-corso24, ad esempio per via endovenosa iniettando la molecola di interesse e misurando il suo accumulo all'interno di BECs in diversi momenti dopo l'iniezione, per ricostruire la cinetica di trasporto intracellulare. Il vantaggio di questo approccio è che permette l'analisi delle regioni profonde del cervello, come mostrato in18, che sono attualmente inaccessibile al videomicroscopia approcci di imaging dal vivo. Un passaggio fondamentale durante il protocollo è l'attento monitoraggio della fissazione del tessuto. Fissaggio con 4% PFA riduce drasticamente l'immunogenicità degli organelli intracellulari e di immunoglobuline endogena o marginalmente amministrato17 (Figura 1B). Una limitazione di questo protocollo è relativo requisito degli anticorpi di alta qualità (cioè, bassa colorazione aspecifica, bassa reattività crociata) adatti a immunofluorescenza. Purché tali reagenti sono disponibili, il metodo può essere applicato per studiare la localizzazione intracellulare di tutta la proteina di interesse. Ad esempio, il protocollo è stato utilizzato per identificare i lisosomi nel cervello cellule endoteliali17. Si deve inoltre osservare che, poiché questo protocollo si basa su microscopia confocal, la risoluzione laterale è limitata dalla diffrazione e non è possibile risolvere strutture più piccoli di circa 175 a 250 nm (Figura 2).
Gli studi precedenti hanno effettuato analisi dettagliata della composizione cellulare dell'unità neurovascolare usando microscopia confocale25,26. Tuttavia, indagando il trasporto intracellulare a BBB si basa principalmente sull'uso di microscopia elettronica di trasmissione19,27,28. Mentre questo metodo offre la massima risoluzione laterale di strutture intracellulari, microscopia elettronica rimane una tecnica impegnativa con bassa velocità effettiva. Inoltre, il numero di bersagli molecolari differenti che possono essere visualizzate da EM è molto limitato. Questo protocollo offre un'alternativa accessibile per studiare il trasporto intracellulare a BBB. La procedura completa, dall'accumulazione del cervello all'analisi di immagine, può essere eseguita in 5 o 6 giorni. Se gli anticorpi adatti sono disponibili, immunofluorescenza consente la rilevazione simultanea di più tipi/molecole delle cellule all'interno del campione stesso. Inoltre questo protocollo potrebbe essere combinato con tecniche di microscopia di Super-risoluzione per superare i limiti nella risoluzione spaziale29. Nel complesso, il protocollo sopra descritto consente la quantificazione dei cambiamenti nella localizzazione intracellulare di proteine di interesse all'interno dell'unità neurovascolare. Sua applicazione per diverse perturbazioni genetiche o farmacologiche permetterà di indagare le funzioni struttura e trasporto intracellulare di BBB in vivo.

Emato - encefalica (BBB) è una barriera cellulare continua formata da neuroni, astrociti, cellule endoteliali e periciti che separa il sistema nervoso centrale (SNC) dal sangue circolazione1. Il regolamento di trasporto attraverso la Bee svolge un ruolo cruciale nel mantenimento dell'omeostasi del cervello ed è mediato dalla proprietà specializzate delle cellule endoteliali cerebrali (BECs). La presenza di giunzioni intercellulari strette tra BECs e un basso tasso basale di transcitosi limitare il trasporto paracellulare e transcellulare di molecole ematica, rispettivamente2. Recentemente, la via di transcitosi in BECs è stata sfruttata per migliorare la fornitura di grandi molecole terapeutiche al cervello3,4. Tuttavia, i meccanismi di transcitosi attraverso la Bee non sono ancora stati completamente caratterizzato5,6.
Vasto lavoro è stato fatto in vitro per decifrare i meccanismi cellulari e molecolari che regolano il trasporto intracellulare attraverso BECs7,8,9,10, 11, ma tali sistemi non riescono a ricapitolare l'architettura complessa e la fisiologia dell'unità neurovascolare (NVU). D'altra parte, gli studi in vivo12,13 fornire dettagliate informazioni quantitative sui tassi di trasporto attraverso la Bee ma non forniscono le comprensioni nei meccanismi intracellulari di trasporto. Di conseguenza, indagando i componenti cellulari e intracellulari il NVU in vivo ed ex vivo rimane molto impegnativo14. Solo un numero limitato di tecniche è suscettibile di analizzare strutture subcellulari all'interno delle cellule il nvu. Maggior parte degli studi utilizza la microscopia elettronica, ma questa tecnica è limitata dai protocolli complessi necessari per la corretta preparazione e trattamento dei campioni. Quindi, abbiamo stabilito una metodologia basata sulla microscopia confocale ad alta risoluzione che faciliterebbe l'elaborazione dei campioni del cervello, l'analisi e la quantificazione dei compartimenti subcellulari all'interno delle cellule il nvu.
Qui, descriviamo un protocollo che utilizza sezioni digalleggiante di cervello di topo per eseguire imaging quantitativo del BBB e NVU a livello cellulare e subcellulare. Abbiamo testato e approvato un certo numero di anticorpi anti-immagine e ricostruire il NVU in tre dimensioni. Inoltre, questo protocollo permette la formazione immagine la risoluzione ottica massima di diffrazione limitata degli organelli all'interno dei capillari del cervello. Insieme con analisi dell'immagine, questo protocollo consente di indagare il trasporto intracellulare di macromolecole attraverso la Bee in diverse condizioni sperimentali, ad esempio in modelli murini di malattia di neurodegenerazione.

<table><tbody><tr><td>Clone di anticorpo monoclonale di ratto ER-MP12 contro CD31/PECAM</td><td>Novus Biologicals</td><td></td><td>MCA2388 Etichette Cellule endoteliali cerebrali Utilizzare alla diluizione 1:100 rilevare con IgG policlonali anti-ratto d'asino (H+L) accoppiate con colorante AlexaFluor adatto, utilizzato a diluizione 1:400</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale di ratto contro Podocalyxin</td><td>R& D Sistemi</td><td>MAB1556</td><td>Etichette Lume dei capillari Utilizzare alla diluizione 1:100 rilevare con l'asino policlonale anti-ratto IgG (H+L) accoppiato con il colorante AlexaFluor adatto, utilizzato alla diluizione 1:400</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale di coniglio contro il CollageneIV</td><td>Biotrend</td><td>BT21-5014-70</td><td>Etichette Membrana basale dei capillari Utilizzare alla diluizione 1:100 rilevare con l'asino policlonale anti-coniglio IgG (H+L) accoppiato con il colorante AlexaFluor adatto, utilizzato a diluizione 1:400</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale di capra contro CD13</td><td>R& D Systems</td><td>AF2335</td><td>Etichetta i periciti Utilizzare alla diluizione 1:100 rilevare con l'asino policlonale anti-capra IgG (H+L) accoppiato con il colorante AlexaFluor adatto, utilizzato alla diluizione 1:400</td></tr><tr><td>Clone di anticorpo monoclonale di topo G-A-5 contro GFAP accoppiato a Cy3</td><td>Abcam</td><td>ab49874</td><td>Etichetta gli astrociti Utilizzare alla diluizione 1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale di coniglio contro Iba-1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>Etichette Microglia Utilizzare alla diluizione 1:100 rilevare con l'asino policlonale anti-ratto IgG (H+L) accoppiato con il colorante AlexaFluor adatto, utilizzato alla diluizione 1:400</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale di ratto ABL93 gainst LAMP2</td><td>Fitzgerald</td><td>10R-CD107BBMSP</td><td>Etichette lisosomi Utilizzare alla diluizione 1:100 rilevare con l'asino policlonale anti-ratto IgG (H+L) accoppiato con il colorante AlexaFluor adatto, utilizzato a diluizione 1:400</td></tr><tr><td>anticorpo policlonale d'asino contro le IgG di topo (H+L) AlexaFluor594</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21203</td><td>Utilizzare a diluizione 1:400</td></tr><tr><td>anticorpo policlonale d'asino contro le IgG di topo (H+L) AlexaFluor488</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21202</td><td>Utilizzare a diluizione 1:400</td></tr><tr><td>anticorpo policlonale di capra contro le IgG di topo (H+L) AlexaFluor555</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21422</td><td>Utilizzare a diluizione 1:400</td></tr><tr><td>Carta da filtro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10334347</td><td>Whatman carta da filtro qualitativa prepletata Grado 0858 1/2,</td></tr><tr><td>colla cianoacrilica</td> granulosa <td>Roth Carl</td><td>258.1</td><td>Roti Coll 1</td></tr><tr><td>Fluorescente Mezzo di montaggio</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>Dako fluorescente Mezzo di montaggio</td></tr><tr><td>Topi adulti</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>C57BL/6J topi maschi o femmine tra 9 e 19 mesi di età</td></tr><tr><td>Vibratomo</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047235612</td><td>Microtomo a lama vibrante Leica VT100S</td></tr><tr><td>Microscopio confocale a scansione laser</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td>Leica TCS SP8 X con rivelatori HyD e laser a luce bianca</td></tr><tr><td>Software di elaborazione delle immagini</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td>Leica Application Suite AF versione 3.1.0 build 8587</td></tr><tr><td>Software di analisi delle immagini</td><td>Software scientifico Bitplane</td><td>NA</td><td>Imaris versione 7.6.5 build 31770 per x64</td></tr><tr><td>Fluorescence SpectraViewer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NA</td><td>https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td></tr></tbody></table>

imaging ad alta risoluzione confocale della barriera sangue - cervello: imaging, ricostruzione 3d e quantificazione di transcitosi

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Emato - encefalica (BBB) è un'interfaccia dinamica multicellulare che regola il trasporto delle molecole tra la circolazione e il cervello. Transcitosi attraverso la Bee regola la consegna di ormoni, metaboliti e gli anticorpi terapeutici al parenchima del cervello. Qui, presentiamo un protocollo che unisce immunofluorescenza delle sezioni digalleggiante con scansione laser confocale e analisi delle immagini per visualizzare gli organelli sottocellulari all'interno delle cellule endoteliali a BBB. Combinando questo set di dati con software di analisi di immagine 3D consente la segmentazione semi-automatizzata e quantificazione del volume capillare e superficie, nonché il numero e intensità degli organelli intracellulari a BBB. La rilevazione dell'immunoglobulina endogeno del mouse (IgG) all'interno di vescicole intracellulari e loro quantificazione a BBB viene utilizzata per illustrare il metodo. Questo protocollo può essere applicato potenzialmente all'indagine dei meccanismi di regolazione BBB transcitosi di molecole differenti in vivo.

Come esempi rappresentativi delle immagini ottenute dal protocollo descritto qui, sezioni di cervello di topo sono stati macchiati con anticorpi che riconoscono diverse componenti di NVU compreso della membrana dello scantinato, astrociti, periciti e cellule endoteliali (Vedi Tabella materiali per anticorpi specifici utilizzati) (Figura 1A, D ed E). A questa risoluzione è possibile distinguere i singoli processi astrocitari e fine-piedi che sono a diretto contatto con i vasi capillari.
Per evidenziare l'idoneità di questo protocollo per la rilevazione di strutture intracellulari, sezioni di cervello da animali iniettati perifericamente con l' anticorpo umano anti-Tau mAb8616 sono state macchiate con un anticorpo anti-umano fluorescente etichettato ( Figura 1B). mAb86 è noto in particolare i neuroni bersaglio che esprimono una forma patologica di Tau16. Mediante il protocollo descritto nel presente documento, mAb86 è stato rilevato con diffrazione limitata risoluzione all'interno di singole strutture vescicolari all'interno dei neuroni (Figura 1B-C). Inoltre, IgG di topo endogeno è stato rilevato in strutture intracellulari all'interno delle cellule endoteliali ma non nei periciti (D-E diFigura 1e Figura 2).
L'acquisizione di z-stack confocale ad alta risoluzione del vasculature cerebrale permette per la segmentazione tridimensionale dei vasi capillari e vescicole intracellulari a BBB. La figura 2 Mostra un esempio del processo di rendering e segmentare un capillare etichettato con CollagenIV e mouse IgG positivi intracellulare vescicole. Quantificando un set di dati completo di immagini segmentate, ad esempio misurando il numero di vescicole per capillare di volume, è possibile studiare i cambiamenti nei processi di trasporto intracellulare in condizioni diverse. Figura 3 B-C Mostra le differenze d'intensità di fluorescenza e numero vescicola di mIgG corrispondente mIgG al parenchima del cervello, rispettivamente, su Pericita svuotamento nel modello del topo di pdgf-bret/ret come precedentemente segnalato 17. lo stesso approccio è stato anche recentemente utilizzato per analizzare i cambiamenti nel trasporto intracellulare al BBB tra differenti del cervello regioni18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig1.jpg"> 
Figura 1: Etichettatura di più tipi di cellule e strutture subcellulari del neurovascolare Unit Immagini rappresentative dell'unità neurovascolare (A e D) e vescicole intracellulari contenute all'interno dei neuroni (B) o cellule endoteliali (E) ottenute con questo protocollo. L'immagine di proiezione massima intensità in A (in alto) Mostra la distribuzione degli astrociti GFAP-positivo (rossi) che circondano capillari etichettati da CollagenIV (verdi). Frecce puntano ai singoli processi astrocytic. Barra della scala = 20 µm. A questa risoluzione, i singoli Astrocita processi e puntali sono chiaramente visibili, come mostrato nell'immagine ingrandita della regione "in box" (in basso). Punte di freccia indicano puntali astrocytic. Barra della scala = 10 µm. L'immagine in B Mostra l'accumulo di un anticorpo iniettato perifericamente, mAb86 (verde), all'interno di un neurone hippocampal. Le punte delle frecce scegliere singole mAb86-positivi vescicole. Barra della scala = 10 µm. Il grafico c Mostra l'intensità del profilo di linea di una singola vescicola. La dimensione della vescicola è stata stimata da tutta la larghezza a metà altezza di una misura gaussiana (linea nera continua) della curva di intensità (linea verde e cerchi). Le immagini d mostrano una ricostruzione tridimensionale di una cellula endoteliale (verde) circondata da un Pericita (rosso) all'interno della lamina basale (CollagenIV, grigio). I pannelli inferiori mostrano i canali individuali di fluorescenza. Barra della scala = 10 µm. Le immagini in E mostrano la localizzazione di mIgG (rosso) in vescicole intracellulari all'interno delle cellule endoteliali (pannello, CD31 in verde a sinistra) ma non in periciti (pannello di destra, CD13 in verde). In tutte le immagini, DAPI macchiato i nuclei sono mostrati in blu. Barra della scala = 5 µm. pannelli D ed E sono stati modificati dal riferimento17. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig2.jpg"> 
Figura 2 : Rendering tridimensionale dei vasi capillari e vescicole intracellulari presso la barriera sangue - cervello. Con il protocollo descritto, immagini ad alta risoluzione confocal di capillari CollagenIV-positivo (verdi) e mouse IgG vescicole intracellulari (rosso) sono state acquisiti (A). Il pannello di sinistra mostra una singola sezione ottica con sezioni trasversali. Le frecce puntano ai singole mIgG-positivi vescicole all'interno delle cellule endoteliali del cervello. Il pannello sulla destra mostra il 3D ricostruzione del z-stack completo utilizzando software elaborazione immagini (Vedi Tabella materiali). Il volume capillare (B) e vescicole individuali (C) sono stati resi in tre dimensioni e quantificati tramite software di elaborazione immagine (Vedi Tabella materiali). In tutte le immagini, DAPI macchiato i nuclei sono mostrati in blu. Scala bar = 5 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig3.jpg"> 
Figura 3 : Quantificazione di mIgG localizzazione intracellulare al BBB. Immagini rappresentative, mostrando (A) ricostruzioni tridimensionali dei capillari (etichettati con collagenIV, verde) e la distribuzione di mIgG (rosso) in topi C57BL/6 e pdgf-bret/ret Pericita impoverito topi precedentemente descritto in19. Barre di scala = 10 µm. Le immagini in B mostrano la segmentazione delle vescicole intracellulari all'interno della maschera di CollagenIV. THe grafico in B , la quantificazione e il confronto del numero delle vescicole mIgG per volume di capillare. Ogni punto rappresenta misure da singoli segmenti capillari. La linea continua indica la media e le barre di errore rappresentano la deviazione standard dei dati. Le immagini in C Visualizza la segnale di fluorescenza mIgG fuori la maschera di CollagenIV. Allo stesso modo, il grafico c Mostra la quantificazione e il confronto di intensità di fluorescenza mIgG nel parenchima del cervello fra i topi C57BL/6 e pdgf-bret/ret Pericita impoverito topi. Unità di intensità di fluorescenza sono stati normalizzati dall'intensità del parenchima mIgG medio misurato in tutti i topi C57BL/6. Questa figura è stata modificata dal riferimento17. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui presentiamo un protocollo basato su microscopia per imaging ad alta risoluzione e una ricostruzione tridimensionale del mouse unità neurovascolare e barriera emato - encefalica utilizzando sezioni digalleggiante del cervello. Questo metodo consente la visualizzazione, analisi e quantificazione degli organelli intracellulari a BBB.

Imaging ad alta risoluzione confocale della barriera sangue - cervello: Imaging, ricostruzione 3D e quantificazione di transcitosi

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire un protocollo basato sulla microscopia per l'imaging ad alta risoluzione e la ricostruzione tridimensionale della barriera emato-encefalica del topo. Combina l'immunofluorescenza di sezioni libere con la microscopia confocale per analizzare gli organelli subcellulari all'interno delle cellule endoteliali cerebrali. Questo metodo aggiunge la preparazione di sezioni libere del cervello, la colorazione in immunofluorescenza, l'acquisizione di immagini e i parametri di analisi per la microscopia ad alta risoluzione della barriera emato-encefalica. Il vantaggio principale della tecnica è che consente la quantificazione degli organelli subcellulari all'interno delle cellule dell'unità neurovascolare. A dimostrare la procedura sarà Roberto Villase

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Imaging ad alta risoluzione confocale della barriera sangue - cervello: Imaging, ricostruzione 3D e quantificazione di transcitosi

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