Name: Immagini in diretta della proteina GLUT4 tratta di neuroni ipotalamici primario del Mouse usando la microscopia di Deconvolution (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Impara a osservare il traffico di GLUT4 in tempo reale in neuroni ipotalamici primari del mouse usando la microscopia a deconvoluzione. Questo metodo rivela il ruolo del CCR5 nella segnalazione insulinica e nelle malattie metaboliche.

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Tutti i protocolli e i metodi utilizzati negli oggetti animali sono stati approvati da istituzionale Animal Care e uso comitati (IACUC) di Taipei Medical University (numeri di protocollo: LAC-2013-0278; LAC-2015-0397)
1. primaria del neurone cultura
<ol><li>Preparazione prima di cultura
	<ol>
<li>Rivestire i piatti di cultura con poli-D-lisina (tabella 1) un giorno prima della cultura. Per un piatto 6-pozzetti, aggiungere 1,5 mL poli-D-lisina (0,05 mg/mL) in ciascun pozzetto. Per vivere-imaging, coltura le cellule su un vetrino coprioggetti 12 x 12 mm in una piastra standard di 6 pozzetti rivestito.</li>
		<li>Rimuovi/riciclare poli-D-lisina e lavare i piatti due volte con 2 mL ddH2O.</li>
		<li>Preparare gli strumenti chirurgici: un paio di forbici micro-dissezione, forcipe curvo-capovolta e standard con punta dritto forcipe. Sterilizzare gli strumenti chirurgici e tenerli in etanolo di 75% durante la chirurgia.</li>
		<li>Riempire di 10cm di Petri con 20 mL liquido di lavaggio (tabella 1) e tenere il ghiaccio.</li>
		<li>Riempire una provetta da 15 mL con 15 mL liquido di lavaggio e tenere il tubo sul ghiaccio.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento del tessuto cerebrale da differenti regioni del cervello
	<ol>
<li>Sacrificio di topi femmina incinta di 16-19 giorno vecchio con protocolli standard euthanization posizionando topi in gabbia non ventilata e poi inebriante con CO2. E15.5 ~ E16.5 embrioni sono raccomandati per la cultura di un neurone ipotalamico ed E16.5 ~ E17.5 sono più adatti per cultura neuronale ippocampo e corticale.</li>
		<li>Sterilizzare la piattaforma, microscopio da dissezione e strumenti di chirurgia con etanolo al 75% per evitare la contaminazione.</li>
		<li>Tagliare intorno alla zona del cordone ombelicale (area rossa scura, tratto di linea Figura 1A, 1B ) per isolare i cuccioli facilmente senza danneggiarli (Figura 1, 1D).</li>
		<li>Rimuovere la porzione di testa di ogni cucciolo con un paio di forbici (Figura 1E, F), quindi fissare la porzione di testa con il forcipe dritto punta fine per la regione dell'occhio (Figura 1). Uso che un altro punta sottile curvo pinza per rimuovere la pelle esterna e il cranio da due lati e li sbucci fuori dalla zona anteriore alla direzione dorsale (Figura 1 H, nero la freccia indica la direzione). Il cervello dovrebbe essere isolato senza alcun danno (Figura 1I). Nota: È essenziale per mantenere l'integrità del cervello per garantire precisione quando isolare diverse regioni del cervello.</li>
		<li>Mantenere il cervello isolato in una capsula Petri pulita con terreno ghiacciato lavare per le seguenti operazioni.</li>
		<li>Capovolgere il cervello e continuate sul lato ventrale. L'ipotalamo è una struttura circolare al centro del cervello (Figura 1J, freccia punti nella regione ipotalamica). Isolare il tessuto ipotalamico con pinzetta appuntita. Rimuovere le meningi (che hanno un colore giallastro-rosso) con attenzione. Attenzione: La rimozione completa dei meninges è un passaggio fondamentale per evitare la contaminazione del fibroblasto.</li>
		<li>Tenere il lobo olfattivo con le pinze taglienti e staccare le meningi sottili che circondano l'intero cervello con il forcipe curvo (Figura 1 K, L).</li>
		<li>L'ippocampo è una forma di banana che è incorporata nella parte inferiore della corteccia. Capovolgere la parte inferiore della corteccia e separare l'ippocampo dalla corteccia tirandolo verso il lato con il forcipe curvo (Figura 1 MN e O). Assicurarsi di rimuovere tutti i restanti meningi che circondano il tessuto cerebrale.</li>
		<li>Quando tutte le regioni del cervello sono state isolate, tritare questi tessuti nei tubi da 15 mL contenente ghiacciata lavaggio medio con l'aiuto delle pinze (punto 1.1.5). Nota: I tessuti cerebrali possono essere mantenuti nel mezzo ghiacciato lavare per 2-3 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultura, la placcatura e la digestione del tessuto
	<ol>
<li>Sciacquare i tessuti capovolgendo la provetta di 15ml di tessuto contenenti 2 - 3 volte e poi tenere il tubo dritto per consentire i tessuti di stabilirsi (1-3 min).</li>
		<li>Rimuovere il prodotto superiore utilizzando il vetro pipetta Pasteur collegato ad un sistema di vuoto. Per lavare il tessuto, aggiungere 15 mL liquido di lavaggio a freddo di ghiaccio e capovolgere la provetta 2 - 3 volte. Ripetere i passaggi da lavare 3 volte prima del passaggio successivo. Attenzione: Essere prudenti dei tessuti sul fondo quando si rimuove il prodotto superiore utilizzando un sistema di vuoto.</li>
		<li>Dopo il lavaggio finale, togliere la soluzione di lavaggio con l'aiuto di una pipetta da 1 mL.</li>
		<li>Incubare tessuti con buffer di digestione di papaina-tripsina (tabella 1) in bagnomaria a 37 ° C per 7-14 min. agitare le provette ogni due minuti affinché tutti i tessuti sono esposti correttamente nel buffer di digestione. Nota: Tempo di incubazione e il volume di tampone di digestione può essere regolate sulla base delle dimensioni del tessuto. Per il tessuto ipotalamico raccolto da 6-8 cuccioli, 300 µ l papaina-tripsina digestione buffer e 7 min tempo di incubazione è raccomandato. Più tessuto richiederà più buffer di digestione.</li>
		<li>Neutralizzare l'attività dell'enzima con l'aggiunta di 1 volume di siero bovino fetale. Agitare la provetta 3 - 5 volte a temperatura ambiente.</li>
		<li>Tenere il tubo su graticci e attendere 1-2 min consentire i tessuti di stabilirsi; rimuovere il surnatante con cura con una pipetta da 1 mL.</li>
		<li>Aggiungere 6 mL placcatura medio (tabella 1) nella provetta e dispensare il tessuto altalenante 50 volte con una pipetta 5ml delicatamente (per raccomanda una piastra a 6 pozzetti, 1,5 mL di terreno di placcatura per pozzetto). Maggior parte delle cellule dissocierà in singole celle dopo ripetuti pipettaggio. Nota: Cercate di evitare la formazione di bolle durante lo svolgimento di questo passaggio. Maggior parte dei laboratori utilizzare vetro fiammato pascolo pipette per dissociare il tessuto. Una pipetta da 5 mL con una punta stretta può essere una buona alternativa per questo passaggio.</li>
		<li>Tenere un tubo sul rack e attendere 1-2 min consentire i tessuti grosso, ONU-dissociati di stabilirsi. Prendere la fase superiore contenente dissociato cellule ad un nuovo tubo e diluire con placcatura media (5 x volume placcatura mediamente al volume di 1 x di cellule dissociate. Ad esempio, aggiungere 5 mL medium per le cellule dissociate mL 1 di placcatura).</li>
		<li>Calcolare la densità delle cellule usando un emocitometro e il numero di cellule di seme nella piastra di coltura rivestita con poli-D-lisina come descritto al punto 1.1.1. Si consiglia di 2-4 x 105 cellule per pozzetto per un piatto di mm 6 ben piatto/35 sono stati raccomandati per gli studi di imaging del neurone. Sarebbe necessaria una maggiore densità per proteina raccolta e l'analisi. Nota: Non aggiungere troppo medio di placcatura, 1-1.5 mL di terreno di placcatura in un 6-pozzetti piatto è sufficiente per il fissaggio. Una quantità eccessiva di medie prolungherà il tempo necessario per il collegamento corretto delle cellule.</li>
		<li>Attendere 2-3 h e controllare i neuroni seminati sotto il microscopio. I neuroni iniziano a crescere neurite quando attaccano correttamente.</li>
		<li>Togliere la soluzione di placcatura e aggiungere 2 mL riscaldato liquido di lavaggio (37 ° C) in un piatto da lavare via il mezzo di placcatura. Ripetere questo passaggio due volte.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di coltura completa (tabella 1) in ogni pozzetto nel piatto 6 pozzetti.</li>
		<li>Modificare la metà del mezzo ogni 3-4 giorni. Preparare il supporto completo fresco ogni volta. Neuroni coltivati dalle regioni del cervello del mouse differenti avranno diversa morfologia e caratteristiche (Figura 2).</li>
	</ol></li>
</ol>2. transfezione del DNA del plasmide in primaria del neurone con sistema liposoma
Attenzione: Per la transfezione del neurone, un kit di purificazione di DNA privo di endotossina plasmide (Tabella materiali) è consigliato per la preparazione di DNA. Precipitazione dell'etanolo ulteriori può rimuovere il solvente in eccesso e migliora la concentrazione del DNA.
<ol><li>
Liposoma-basato transfezione del DNA in neuroni primari. Nota: Il tempo di transfezione dipende lo stato di maturazione necessario negli esperimenti. I neuroni ipotalamici transfected a DIV 7-10 (giorni in vitroDIV).<ol>
<li>DNA: Preparazione della miscela liposoma: diluire GFP-GLUT4 plasmide DNA16 (2 µ g) in una microcentrifuga provetta contenente 300 µ l del siero basso cultura il mezzo. Preparare un altro tubo del microcentrifuge con 2 liposoma µ l a 300 µ l di siero basso coltura e incubare per 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Combinare il contenuto di entrambi i tubi e incubare per 20-30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere il terreno di coltura del neurone dalla piastra di coltura. Aggiungere la miscela di DNA-liposoma 600 µ l in ogni pozzetto e incubare a 37 ° C per 4-6 h.</li>
		<li>Dopo 4-6 h, rimuovere la miscela di DNA-liposoma e aggiungere 2 mL terreno di coltura.</li>
		<li>Segnali fluorescenti, quali GFP da solo e la proteina GLUT4 coniugato con etichetta GFP (Figura 3 e Figura 4), possono essere osservati dopo 18-72 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. registrazione di immagine live
<ol><li>
Le cellule che preparare per vivere Imaging
	<ol>
<li>Cultura di WT e CCR5- / - neurone ipotalamico cellule che esprimono la proteina di fluorescenza verde con l'etichetta del trasportatore del glucosio 4 (GFP-GLUT4) #1.5 (o 0,17 mm di spessore) vetrino coprioggetti, che sono stato pre-rivestiti con poli-D-lisina nel passaggio 1.1.1 nel 6-Pozzo piastra.</li>
		<li>Rimuovere i coprioggetti con neuroni usando il forcipe con cautela e posizionarlo sulle lastre di vetro con cautela.</li>
		<li>Rimuovere medio/liquido in eccesso con salviettine delicato compito. Piegare le salviette due volte e con attenzione li sopra il vetrino coprioggetti. Premere delicatamente le salviettine senza spostare il vetrino coprioggetti. Attenzione: Non premere con forza il coprioggetto contro il vetrino. Lo scopo di questo passaggio è quello di garantire che il vetrino coprioggetto non mossa/drift durante l'acquisizione di immagine causati dalla forza capace di galleggiare.</li>
		<li>Posizionare correttamente coprioggetti e diapositive sul tavolino del microscopio di deconvoluzione, con il vetrino coprioggetto rivolto verso il basso e protetto. Questo passaggio è quello di garantire che la posizione di scorrimento rimane costante, così gli utenti possono monitorare lo stesso insieme di cellule bersaglio più tardi.</li>
		<li>Osservare WT e CCR5- / - cellule del neurone ipotalamico con una x 60 / 1,42 NA obiettivo obiettivo ad immersione.</li>
		<li>Trattare i campioni di cella selezionata con CCL5 (10 ng/mL) o insulina (10 U/mL) per un minimo aggiungere 1,5 µ l di diluito insulina sul bordo del vetrino coprioggetti.</li>
		<li>Visualizzare e registrare immediatamente i campioni della cella selezionata. Programma per il software di registrazione video per registrare per 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Deconvoluzione microscopia e analisi Nota: Questa parte del protocollo richiede l'uso di un microscopio di deconvoluzione e software specializzato per l'analisi.<ol>
<li>Accendere l'alimentazione del sistema di imaging, consentire il tavolino del microscopio inizializzare correttamente e poi accendere la sorgente di luce LED.</li>
		<li>Aggiungere olio di immersione (indice di rifrazione 1.520 per campioni di vivere a 37 ° C) su un obiettivo di 60 x 1,42 NA. Porre il vetrino di campione sul microscopio con il coprioggetto rivolto verso l'obiettivo e assicurare la diapositiva in modo corretto.</li>
		<li>Utilizzare illuminazione a campo chiaro o fluorescenza per identificare cellule bersaglio. Regolare la messa a fuoco fino a quando le cellule bersaglio possono essere osservate chiaramente. Non spostare l'obiettivo fuori della zona di coprioggetto per evitare graffi inutili.</li>
		<li>Verde di identificare proteine fluorescenza coniugati glucosio Transporter 4 (GFP-GLUT4) il segnale GFP. Identificare le celle di destinazione desiderata per acquisizione di immagini. Posizione della cella di destinazione selezionati possa essere memorizzati per riferimento futuro (Figura 4).</li>
		<li>Programma di installazione corretto parametri sperimentali (tra cui il numero di pixel, lunghezza d'onda di eccitazione, percentuale di trasmissione, tempo di esposizione, lo spessore dello stack, intervallo di tempo e tempo totale di imaging) ogni cella di destinazione. Per questo esperimento, il numero di pixel di immagine è stato impostato a 512 x 512 (può essere impostata a 1.024 x 1.024 per una migliore risoluzione) per segnali di GFP. Il tempo di esposizione è stato impostato tra 0,025 a 0,05 s per ogni 5 min minore laterale x, y e z regolazioni può essere controllato dal software consigliati (materiali tavolo).</li>
		<li>Impostare il parametro di esposizione per circa 2.000 a 3.000 conteggi a ottenere pixel massima intensità. Per ridurre la fluorescenza photobleaching, ridurre la percentuale di trasmissione della luce di eccitazione per quanto possibile, mentre mantenendo l'esposizione tempo di meno di 1 s. Ripetere questi passaggi per ogni canale aggiuntivo di fluorescenza e ciascuna area di interesse.</li>
		<li>Impostare il limite superiore e inferiore dello Z-stack ogni cella di destinazione. Ciò può essere ottenuto spostando il tavolino del microscopio, fino a quando la parte superiore e inferiore della cella di destinazione sono entrambi leggermente fuori fuoco. Gli utenti possono regolare la risoluzione dell'asse z impostando il numero di immagini tra il limite superiore e inferiore (che può essere eseguita impostando la distanza tra ogni immagine).</li>
		<li>Pile di immagini sono state deconvoluti e successivamente analizzati con l'aiuto del rispettivo software – velocità da PerkinElmer in questo caso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La possibilità di monitorare le cellule vive, su stimolo CCL5 o insulina, è criticamente importante per studiare l'effetto rapido di CCL5 o insulina sul movimento di GLUT4. Infatti, esso ci permette di visualizzare la differenza significativa tra WT e CCR5- / - neuroni ipotalamici stimolazione dell'insulina. Abbiamo eseguito l'etichettatura superficie della proteina endogena di GLUT4 in WT e CCR5- / - neuroni ipotalamici in diversi momenti dopo stimolazione di insulina17. L'etichettatura delle proteine della superficie cellulare richiede alta specificità dell'anticorpo con fondo basso. Inoltre, superficie fluorescenza quantificazione anche può essere impegnativo e richiede tempo. Così, registrazione time-lapse consente di essere certi che l'effetto di CCL5 o l'insulina è un vero cambiamento fisiologico basato su condizioni sperimentali, piuttosto che una variazione statistica. Collaborazione con superficie etichettatura di GLUT4 endogeno, offriamo forti prove ed esperimenti per dimostrare come CCL5 e CCR5 partecipare GLUT4 traslocazione e segnalazione dell'insulina.
In studi di biologia molecolare e biologia cellulare moderno, molti esperimenti richiedono l'utilizzo di microscopia di fluorescenza. Questa tecnologia permette agli scienziati di visualizzare le relazioni spaziali tra proteine e/o organelli cellulari, oltre alla direzione del movimento e velocità, gli effetti stimolatori, i cambiamenti morfologici e traffico della proteina. Tuttavia, questa tecnologia ha ancora il suo limite: quando sono eccitati fluorofori, i segnali emessi dalla proteina bersaglio (o zona) possono essere sopraffatti dalla fluorescenza di fondo. Di conseguenza, immagini di fluorescenza possono apparire sfocate con attesi segnali seppelliti profondo in segnali di fondo. Questo fenomeno è particolarmente evidente per l'osservazione delle proteine di membrana-limitano.
Microscopia di fluorescenza nel riflessione totale interna (TIRFM) è stato sviluppato per superare questa difficoltà. Esso permette agli scienziati di visualizzare l'eccitazione di fluorofori associato a superficie selezionata senza intaccare i fluorofori di sfondo. Esso permette agli scienziati di caratterizzare selettivamente caratteristiche ed eventi su una regione di superficie molto sottile come una membrana plasmatica. Microscopia di deconvoluzione è un'immagine richiede un uso intensivo di elaborazione tecnica che è reso possibile con l'aiuto degli avanzamenti tecnologici negli ultimi anni. È stato spesso utilizzato per migliorare la risoluzione dell'immagine digitale di fluorescenza. Come accennato in precedenza, quando fluorofori sono essere eccitati da qualsiasi tipo di illuminazione (come il laser o LED), tutti i fluorophores emetterà segnali luminosi a prescindere se sono a fuoco o no, quindi l'immagine apparirà sempre sfocata. Questa sfocatura è causato da un fenomeno chiamato "Point Spread Function" (PSF), come luce proveniente da una piccola sorgente fluorescente (punto luminoso) sarà sparso ulteriormente e diventano fuori fuoco (sfocatura). In linea di principio, questo evento produrrà un segnale fluorescente a forma di clessidra-come, e un'immagine di fluorescenza può essere costituita da numerosi tali segnali luminosi. Il processo di deconvoluzione può riassegnare tutti i segnali di fluorescenza alla forma originale spot luminoso ed eliminare la maggior parte della luce, out-of-focus per migliorare il contrasto dell'immagine.
Negli ultimi anni, gli algoritmi di deconvoluzione hanno generato immagini con risoluzione paragonabile a quella di un microscopio confocale. Inoltre, in confronto con TIRFM, che impedisce la out-of-focus blur da essere rilevato da una regione limitata di eccitazione, la microscopia grandangolari permette tutta la luce segnala essere rilevato e li riassegna torna alla loro fonte attraverso il processo di deconvoluzione. Quindi, in pratica, deconvoluzione microscopia è diventata non solo un metodo di acquisizione di immagine più efficiente, ma anche un metodo più conveniente rispetto alla microscopia TIRF.

Diabete mellito di tipo 2 (T2DM) è una crisi sanitaria globale. T2DM è caratterizzata dalla segnalazione di danno e infiammazione cronica nei tessuti periferici dell'insulina. L'ipotalamo è il centro di controllo che regola l'omeostasi energetica del corpo, appetito e ritmi circadiani. La cosa più importante, l'ipotalamo media anche la risposta del segnale dell'insulina per regolare il metabolismo sistemico1,2,3,4,5. Interrompere la segnalazione via potrebbe indurre insulino resistenza6,7ipotalamico dell'insulina. L'ipotalamo coordina lo stato di energia cellulare e la secrezione di ormoni, come l'insulina e adipochine (ad es., leptina) dai tessuti periferici, per regolare il metabolismo del glucosio sistemico, risposta dell'insulina e l'assunzione di cibo. L'insulina si lega al recettore dell'insulina attiva proteine substrato (IRS) del ricevitore dell'insulina, che quindi attivare molecole dell'insulina di segnalazione a valle, ad esempio PI3K (fosfatidilinositolo 3-chinasi) e AKT (proteina chinasi B (PKB/AKT)), per indurre GLUT4 traslocazione di membrana. I neuroni non sono l'obiettivo principale per l'assorbimento del glucosio in risposta all'insulina; Tuttavia, sono stati identificati livelli significativi di GLUT4 espressione della regione di nucleo arcuato ipotalamico (ARC). Pertanto, il regolamento di GLUT4 in neuroni ipotalamici può svolgere un ruolo importante nella segnalazione nell'asse cervello-periferico dell'insulina.
Molti studi hanno suggerito che l'infiammazione cronica e chemochine infiammatorie nell'ipotalamo anche giocare un ruolo importante nello sviluppo del diabete e dell'obesità, e inibizione dell'infiammazione ipotalamica può invertire la resistenza all'insulina indotta da dieta 8 , 9 , 10. Peraltro, chemochine-CCL5 (ligando di motivo C-C 5, noto anche come RANTES, Regulated-on-Activation-Normal-T-cell-Expressed-and-Secreted) e i suoi livelli del recettore CCR5 anche correlare con lo sviluppo di T2DM11,12. I ruoli di CCL5 e CCR5 nel metabolismo del glucosio e funzione dell'insulina rimangono poco chiari. Uno studio ha riferito che la carenza di CCR5 topi protetti da infiammazione obesità-indotta, del reclutamento del macrofago e insulino resistenza11; al contrario, un altro studio ha riferito che CCR5 carenza altera la tolleranza al glucosio sistemica, come pure degli adipociti e muscolo segnalazione12dell'insulina. CCL5 è trovato per aumentare l'assorbimento del glucosio in cellule di T e per ridurre l'assunzione di cibo attraverso la sua azione l'ipotalamo13,14, tuttavia, sia il meccanismo d'azione e i recettori coinvolti devono ancora essere identificati.
È difficile studiare i meccanismi cellulari alla base dell'effetto di infiammazione del tessuto periferico sull'insulina funzionamento in neuroni ipotalamici. Si tratta di regolamento feedback di circuito del neurone e della eterogeneità cellulare. Per questo motivo, un modello della coltura cellulare in vitro fornisce un modello pulito per studiare gli effetti della chemochina il regolamento segnale ipotalamico dell'insulina. Sebbene esistano che molte affermate linee cellulari immortalizzate di un neurone ipotalamico per uso di ricerca, queste linee cellulari espressi diversi marcatori e rappresentano pertanto, diversi tipi di neuroni ipotalamici15. Anche se colture primarie ipotalamiche possono essere difficile da mantenere, essi possono fornire la risposta più realistica di neuroni ipotalamici stimolazione dell'insulina e può anche evitare il potenziale effetti sconosciuti che entrano in giocano quando il mantenimento delle cellule a lungo termine nel terreno di coltura con fattori di crescita artificiali.
Nel presente documento, utilizziamo neuroni ipotalamici primari da CCR5 knockout (CCR5- / -) mouse e C57BL/6 wildtype (WT) del mouse e transfect entrambi i tipi di cellule con costruzione GFP-GLUT4. Per studiare il contributo di CCR5 al traffico di membrana GLUT4 insulina mediata, GFP-GLUT4 trasfettati neuroni sono stati trattati con insulina o CCL5 ricombinante. Ci caratterizzano quindi il movimento di GFP-GLUT4 sulla membrana plasmatica in neuroni primari ipotalamici con microscopia di deconvoluzione.

<table><tbody><tr><td>Microscopio a deconvoluzione DeltaVision</td><td>Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science)&nbsp;</td><td></td><td>dotato di obiettivo a immersione in olio 60x/1.42 NA; utilizzato per scattare immagini di cellule vive</td></tr><tr><td>Software applicativo SoftWorX</td><td>Applied Precision Inc.</td><td></td><td>utilizzato per controllare il microscopio e la fotocamera</td></tr><tr><td>Software VoloCITY</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>utilizzato per analizzare le immagini</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Actrapid, Danimarca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liposoma</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Lipofectamine&reg; 2000, utilizzato per la trasfezione del DNA plasmidico</td></tr><tr><td>GFP controllo del DNA del DNA</td><td></td><td></td><td>fornito dal professor Samuel Cushman</td></tr><tr><td>DNA plasmidico GFP-GLUT4</td><td>fornito dal professor Samuel Cushman</td>Anti-topo Alex-488 Invitrogen#A-11001 Anitbody secondario Anti-coniglio IgG -Alex-568 Invitrogen#A-11036 Anitbody secondario CCL5/RANTES R&<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> D Systems</td><td>478-MR-025</td><td>10ng/ml</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>#FL42572A</td><td>0,17 mm spessore</td></tr><tr><td>12 mm Coprimicroscopio</td><td>Deckglaser</td><td>#41001112</td><td>utilizzato per lo studio dell'immunizzazione</td></tr> forbici <tr><td>per micro-dissezione</td><td>Klappenecker</td><td></td><td>Strumento chirurgico</td></tr><tr><td>pinza a punta curva</td><td>Ideal-tek</td><td></td><td>Strumento chirurgico</td></tr><tr><td>pinza standard a punta dritta</td><td>Ideal-tek</td><td></td><td>Strumento chirurgico</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td>Purify Plasma libero da endotossine DNA</td></tr><tr><td>Pipetta da 5 ml</td><td>Corning costar&nbsp;</td><td>4487</td><td>dissociare il tessuto cerebrale</td></tr></tbody></table>

immagini in diretta della proteina glut4 tratta di neuroni ipotalamici primario del mouse usando la microscopia di deconvolution

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Diabete mellito di tipo 2 (T2DM) è una crisi di salute globale che è caratterizzata dalla segnalazione di danno e infiammazione cronica nei tessuti periferici dell'insulina. L'ipotalamo nel sistema nervoso centrale (SNC) è il centro di controllo per regolazione segnale risposta dell'insulina e di energia. Infiammazione cronica in tessuti periferici e gli squilibri di alcune chemochine (ad esempio CCL5, TNFα e IL-6) contribuire al diabete e obesità. Tuttavia, i meccanismi funzionali collegamento chemochine e regolamento di segnale ipotalamico insulina ancora rimangono poco chiari.
Modelli di coltura in vitro primaria del neurone sono modelli convenienti e semplici che possono essere utilizzati per studiare il regolamento di segnale dell'insulina in neuroni ipotalamici. In questo studio, abbiamo introdotto esogene GLUT4 proteine coniugate con GFP (GFP-GLUT4) in neuroni ipotalamici primari per tenere traccia di traslocazione di membrana GLUT4 stimolazione dell'insulina. Time-lapse immagini di GFP-GLUT4 traffico della proteina sono state registrate da microscopia di deconvoluzione, che permetteva agli utenti di generare immagini ad alta risoluzione e ad alta velocità senza danneggiare i neuroni significativamente durante l'esperimento. Il contributo di CCR5 in insulina regolato GLUT4 traslocazione è stato osservato in neuroni ipotalamici carenti di CCR5, che è stati isolati e coltivati da topi knockout CCR5. I nostri risultati hanno dimostrato che l'efficienza di traslocazione di membrana GLUT4 è stata ridotta in neuroni ipotalamici carenti CCR5 dopo stimolazione dell'insulina.

I neuroni ipotalamici coltivati dai topi sono stati identificati ulteriori immunostaining con proteine associate ai microtubuli ipotalamico specifica proteina - anticorpo pro-opiomelanocortina (POMC) e marker neuronale - 2 (MAP2) (Figura 2A). Abbiamo confermato che il primarie colture di neuroni ipotalamiche espresso proteina ipotalamica POMC. L'espressione del recettore CCR5 e CCL5 in neuroni ipotalamici sono stati identificati con gli anticorpi specifici e co-etichettati con anticorpo POMC (Figura 2A, 2B).
Dopo 3 giorni di coltura, i neuroni sono stati trasfettati con GFP DNA (Figura 3) o GFP coniugato GLUT4 (Figura 4). Espressione di GFP può solitamente essere trovati dappertutto che la cella senza un modello specifico (Figura 3) ma il GLUT4-GFP esprimerà come una struttura punctate nel citosol (Figura 4). Il kit di transfezione utilizzato in questo studio non è il metodo più efficiente per la transfezione del neurone; Tuttavia, è un metodo meno rigoroso per la migliore sopravvivenza delle cellule dopo la trasfezione, che contribuisce a meglio vivere-cella imaging/registrazione più tardi. Le immagini dei neuroni esprimenti GFP-GLUT4 sono stata prelevate prima filmati time-lapse (Figura 4A-B, complementare dei video 1, 2) su stimolazione dell'insulina o stimolazione CCL5 (Figura 4, 3 video supplementari). I segnali di GFP e GFP-GLUT4 sono chiari e forti in neuroni.
Neuroni ipotalamici con transfezione di GLUT4-GFP sono stati ulteriormente trattati con insulina (40 U) per caratterizzare la GFP-GLUT4 traffico. Video rappresentante del movimento di GLUT4-GFP su stimolo dell'insulina in entrambi WT e CCR5- / - neuroni ipotalamici sono indicati come Video 1 e Video 2, rispettivamente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56409/56409fig1.jpg"> Figura 1: isolamento dei tessuti provenienti da diverse regioni del cervello del mouse allo stadio embrionale (giorno 16,5). (A-D) I passaggi coinvolti nella separazione dei cuccioli dalla placenta. (E, F) La dissezione di una testa di pup dal corpo. (G-io) I passaggi coinvolti nell'isolamento dell'intero cervello dal cranio. La punta di freccia nera in direzione per essere tirato durante la rimozione del cranio usando il forcipe. (J) l'isolamento dell'ipotalamo. I punti della freccia nera nella regione ipotalamica tra forcipe. (K-L) Isolamento della corteccia del cervello del topo. L'asterisco nero indica la regione corticale del cervello del mouse e la freccia bianca indica la separazione della corteccia dal cervello intero. (M-O) La separazione della parte hippocampal dalla corteccia. La freccia bianca superiore segna il tessuto ippocampale e la freccia bianca inferiore segna il tessuto corticale. Scala bar = 1 cm (A-F), 200 µm (G-O). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/56409fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56409/56409fig2.jpg"> Figura 2: caratterizzazione del marcatore di un neurone ipotalamico - POMC e la co-espressione di CCL5 e CCR5. Primaria (A) colture di neuroni ipotalamiche sono state etichettate con il segno di un neurone ipotalamico - POMC (rosso), la co-espressione di CCR5 (verde) e il neurone segnapunti MAP2 (grigio). (B) il CCL5 (verde) espressione in neuroni ipotalamici positivi di POMC (rosso) (adattato dai dati supplementari di riferimento17). Qui, DAPI etichettato il nucleo con il colore blu. Scala bar = 50 µm in (A) e (B). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/56409fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56409/56409fig3.jpg"> Figura 3: espressione della proteina GFP in neuroni primari mouse. GFP il DNA del plasmide transfected nelle colture primarie di neuroni dopo 4 giorni cultura (DIV4) con liposomi ed espresso per altri 3 giorni (DIV7). (A-B) GFP è espressa in sia neurite e soma. (C-D) Neuroni con finto transfezione; DAPI etichettato il nucleo in (B, D). Scala bar = 100 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/56409fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56409/56409fig4.jpg"> Figura 4: le istantanee di GFP-GLUT4 in neuroni ipotalamici. (A, C) GFP-GLUT4 proteina espressa nei neuroni ipotalamici Wildtype (WT) e (B) CCR5- / - neuroni ipotalamici. I neuroni sono stati stimolati con insulina (A, B) o CCL5 (C). Le frecce indicano la GFP-GLUT4 punctate nella neurite prima (-) e dopo (+) insulina o CCL5 stimolazione e gli asterischi indicano la superficie GLUT4-GFP prima (-) e dopo (+) CCL5 stimolazione in (C). (Figura adattata da riferimento17). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/56409fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>5 x Borade Buffer</td>
			<td>Azienda</td>
			<td>Numero di catalogo</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acido borico</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td>1,55 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Borace</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71997</td>
			<td>2,375 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Filtrata, conservare a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 x Stock in poli-D-lisina</td>
			<td>Azienda</td>
			<td>Numero di catalogo</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>Poli-D-lisina</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Filtrata, conservare a-20 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 x poli-D-lisina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 x poli-D-lisina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 x Borade Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Conservare a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lavaggio medio</td>
			<td>Azienda</td>
			<td>Numero di catalogo</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM-alto glucosio</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12800-017</td>
			<td>495 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antibiotico-antimicotica</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Conservare a 4° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Buffer di digestione di papaina-tripsina:</td>
			<td>Azienda</td>
			<td>Numero di catalogo</td>
			<td>Concentrazione di volume/finale</td>
		</tr>
<tr>
<td>Papaina (10 mg/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4762</td>
			<td>200 µ l (2 mg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td>200 Μ L (0.05%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lavaggio medio</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>600 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.000 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Conservare a-20 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tecnica di placcatura:</td>
			<td>Azienda</td>
			<td>Numero di catalogo</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>Neurobasal medio</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>176 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Siero bovino fetale</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutammato (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antibiotico-antimicotica</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>200 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Conservare a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Terreno di coltura completa</td>
			<td>Azienda</td>
			<td>Numero di catalogo</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>Neurobasal medio</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>95 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Supplemento N2 (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Supplemento B27 (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-04</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutammato (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antibiotico-antimicotica</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparati al momento</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Digestione buffer e media composizione utilizzata in questo studio.
Video supplementari 1: Insulina stimolata movimento GFP-GLUT4 in neuroni ipotalamici WT. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/JoVE-Video-1.mov">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare dei Video 2: Insulina stimolata movimento GFP-GLUT4 in CCR5- / - neuroni ipotalamici. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/JoVE-Video-2.mov">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare dei Video 3: CCL5 stimolato movimento GFP-GLUT4 in neuroni ipotalamici WT (Video tratto dal riferimento17). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/JoVE-Video-3.mov">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

Questo protocollo descrive una tecnica per osservazione di in tempo reale verde fluorescenza Protein (GFP) contrassegnati 4 di trasportatore del glucosio (GLUT4) proteina traffico su stimolazione dell'insulina e la caratterizzazione del ruolo biologico di CCR5 in insulina – GLUT4 via con microscopia di Deconvolution di segnalazione.

Immagini in diretta della proteina GLUT4 tratta di neuroni ipotalamici primario del Mouse usando la microscopia di Deconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è osservare il traffico proteico in tempo reale nelle cellule neuronali primarie come GLUT4 nei neuroni ipotalamici con un danno minimo. Questo metodo può spiegare questioni chiave relative alla regolazione neuronale della segnalazione e del metabolismo dell'insulina, come nel caso del diabete mellito di tipo 2. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i ricercatori possono isolare colture cellulari primarie e osservare l'effetto indotto dal farmaco in tempo reale.L'implicazione di questa tecnica è quella di scegliere una terapia per il diabete di tipo 2 o l'insulino-resistenza cerebrale correlata perché ora sappiamo come questo segnale insulinico viene alterato dalla chemochina CCL5 nei neuroni ipotalamici. Per iniziare questa procedura, rivestire i piatti di coltura con poli-D lisina un giorno prima della coltura. Per un piatto a sei pozzetti, aggiungere 1,5 mL di poli-D lisina a 0,05 mg/mL a ciascun pozzetto.Il giorno successivo, rimuovere la poli-D lisina e lavare i piatti due volte con 2 ml di ddH2O. Quindi riempire le piastre di Petri da 10 cm con 20 ml di terreno di lavaggio e tenerle in ghiaccio. Riempire le provette da 15 ml con il terreno di lavaggio e tenerle in ghiaccio.Per l'isolamento del tessuto cerebrale, sterilizzare la piattaforma, il microscopio da dissezione e gli strumenti chirurgici con etanolo al 75% per evitare la contaminazione. Dopodiché, taglia intorno all'area del cordone ombelicale per isolare i cuccioli senza danneggiarli. Quindi, rimuovi la testa di ogni cucciolo e fissala in posizione usando la pinza dritta a punta fine.Usa un'altra pinza curva a punta fine per rimuovere la pelle esterna e il cranio da entrambi i lati e staccarli dalla direzione anteriore a quella dorsale. Quindi, tieni i cervelli isolati in una capsula di Petri pulita con un mezzo di lavaggio ghiacciato. Capovolgi il cervello e mantieni il lato ventrale rivolto verso l'alto.Successivamente, isolare il tessuto ipotalamico con una pinza curva a punta fine. Tenere il lobo olfattivo con la pinza affilata e staccare le meningi sottili che circondano l'intero cervello con la pinza curva. Capovolgi la parte inferiore della corteccia e separa l'ippocampo dalla corteccia tirandolo di lato.Quando tutte le regioni del cervello sono state isolate, tritare questi tessuti nelle provette da 15 ml contenenti un mezzo di lavaggio ghiacciato. In questa procedura, sciacquare i tessuti capovolgendo il tubo contenente il tessuto due o tre volte. Quindi, tieni il tubo dritto per consentire ai tessuti di stabilizzarsi.Rimuovere il mezzo superiore utilizzando la pipetta di vetro Pasteur collegata a un sistema a vuoto. Per lavare il fazzoletto, aggiungere 15 ml di terreno di coltura ghiacciato e capovolgere la provetta due o tre volte. Dopo il lavaggio finale, rimuovere il terreno di lavaggio con l'aiuto di una pipetta da 1 ml.Incubare i tessuti con tampone di digestione papaina-tripsina in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per sette-14 minuti. Successivamente, neutralizzare l'attività degli enzimi aggiungendo un volume di siero fetale bovino. Tenere la provetta su una rastrelliera e attendere uno o due minuti per consentire ai fazzoletti di stabilizzarsi.Successivamente, rimuovere con cura il surnatante con una pipetta da 1 ml. Aggiungere 6 mL di terreno di placcatura nella provetta e pipettare delicatamente il tessuto su e giù 50 volte con una pipetta da 5 mL. Tenere la provetta sulla rastrelliera e attendere uno o due minuti per consentire ai tessuti grossi e non dissociati di depositarsi.Successivamente, trasferire la fase superiore contenente le cellule dissociate in una nuova provetta e diluirla con un mezzo di placcatura. Quindi, aggiungere 2 ml di terreno di coltura completo in ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti. Per preparare le cellule per l'imaging dal vivo, rimuovere con cura i vetrini coprioggetti con i neuroni usando una pinza e posizionarli sul vetrino con cautela.Quindi, rimuovere il terreno in eccesso con salviette delicate piegandole due volte e posizionandole con cura sul vetrino coprioggetto senza spostarlo. È essenziale rimuovere la quantità eccessiva di fluido per evitare movimenti non necessari sul vetrino coprioggetto. Successivamente, trattare i campioni di cellule selezionate con CCL5 a 10 ng/mL o insulina a 10 unità/mL per un minuto.Successivamente, aggiungere 1,5 mcL di insulina diluita sul bordo dei vetrini coprioggetti. Quindi, aggiungere olio da immersione su un obiettivo da 1,52 NA con ingrandimento 60x. Successivamente, posizionare i vetrini coprioggetti sul tavolino del microscopio a deconvoluzione con i vetrini rivolti verso il basso e fissati correttamente.Utilizzare l'illuminazione a campo chiaro o a fluorescenza per identificare le cellule bersaglio. Successivamente, regolare la messa a fuoco fino a quando le cellule target non possono essere osservate chiaramente. Non spostare la lente dell'obiettivo al di fuori dell'area del vetrino coprioggetto per evitare inutili graffi.Quindi, identificare GFP-GLUT4 dal segnale GFP. Quindi identificare le cellule target desiderate per l'acquisizione dell'immagine. Successivamente, impostare i parametri sperimentali appropriati su ciascuna cella target, tra cui il numero di pixel, la lunghezza d'onda di eccitazione, la percentuale di trasmissione, il tempo di esposizione, lo spessore della pila, l'intervallo di tempo e il tempo totale di imaging.Regolare il parametro di esposizione su circa 2000-3000 conteggi per ottenere la massima intensità di pixel. Per ridurre al minimo lo sbiancamento fotografico a fluorescenza, ridurre il più possibile la percentuale di trasmissione della luce di eccitazione mantenendo il tempo di esposizione inferiore a un secondo. Impostare il limite superiore e inferiore della pila Z su ciascuna cella bersaglio spostando il tavolino del microscopio fino a quando la parte superiore e inferiore della cella bersaglio non sono entrambe leggermente sfocate.È molto importante ridurre al minimo lo sbiancamento delle foto fluorescenti nella morte dei neuroni dopo l'immagine luminosa. Questa figura mostra che i neuroni ipotalamici primari in coltura sono stati marcati con il marcatore neuronale MAP2. Il marcatore neuronale ipotalamico POMC e la loro co-espressione di CCR5.L'immagine co-localizzata mostra che CCL5 è espresso nei neuroni ipotalamici POMC-positivi. Queste immagini mostrano l'espressione della proteina GFP-GLUT4 nei neuroni ipotalamici wild type e nei neuroni ipotalamici double-negative CCR5. I neuroni sono stati stimolati con insulina o CCL5.Le frecce puntano al punto GFP-GLUT4 nella neurite prima o dopo la stimolazione con insulina o CCL5 e gli asterischi indicano la superficie GLUT4-GFP prima o dopo la stimolazione CCL5. Una volta padroneggiata, questa registrazione di laboratorio della tecnica della cellula primaria può essere eseguita da una a quattro ore, a seconda dei requisiti dell'esperimento e se è eseguita correttamente. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare la possibilità di caratterizzare l'effetto immediato indotto dal farmaco nella coltura cellulare primaria.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare un neurone ipotalamico primario, un neurone ippocampale e un neurone corticale. Oltre al laboratorio, puoi anche sapere come eseguire una registrazione dal vivo della molecola seriale dopo diverse stimolazioni. Non dimenticare di indossare il camice e i guanti da laboratorio e di usare frequentemente l'etanolo per evitare la contaminazione da batteri e funghi degli animali.Inoltre, fai molta attenzione quando hai a che fare con vetrini coprioggetti e neuroni durante questa procedura.

live-images-glut4-protein-trafficking-mouse-primary-hypothalamic

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JoVE Journal

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Neuroscienze

L'imaging cellulare Live è di particolare utilità quando si studiano le dinamiche del traffico di organelli. Qui si descrive un protocollo per l'imaging dal vivo di denso-core vescicole in neuroni coltivati ​​con grande campo microscopia a fluorescenza. Questo protocollo è flessibile e può essere adattato a organelli altra immagine come i mitocondri, endosomi e perossisomi.

Immagini dal vivo di Dense-core Vescicole nella Primaria neuroni coltivati ​​ippocampale

Questa relazione dimostra una tecnica per isolamento meccanico di singoli neuroni vitali mantenendo attaccato boutons presinaptica. Vibrodissociated neuroni hanno il vantaggio di una produzione rapida, eccellente controllo farmacologico e migliorato lo spazio-clamp senza influenza dalle cellule vicine. Questo metodo può essere utilizzato per l'imaging di elementi sinaptica e di patch-clamp registrazione.

Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici

Etichettando i domini extracellulari dei recettori di membrana con pHluorin superecliptic, e da imaging questi recettori di fusione in neuroni di topo in coltura, si può visualizzare direttamente i singoli eventi di inserzione vescicolari dei recettori della membrana plasmatica. Questa tecnica sarà determinante per chiarire i meccanismi molecolari che regolano l'inserimento recettore alla membrana plasmatica.

Imaging pHluorin-tagged inserimento recettore alla membrana plasmatica nella Primaria neuroni mouse coltivate

Questo video dimostra un approccio di alimentazione anticorpale per studiare il traffico dei recettori del glutammato nelle colture neuronali primarie dell'ippocampo. Questo approccio consente l'osservazione delle popolazioni di recettori sia nel plasma che nelle membrane interne. La discriminazione tra questi sottogruppi si ottiene marcando i recettori prima e dopo la permeabilizzazione della membrana, utilizzando lo stesso anticorpo primario ma anticorpi secondari coniugati a diversi...

Una tecnica in vitro per studiare il traffico del recettore del glutammato nei neuroni dell'ippocampo

Questo video mostra la valutazione del rilascio e della clearance del glutammato nelle singole sinapsi corticostriatali in una fetta di cervello di topo. La stimolazione elettrica facilita il rilascio di glutammato nella sinapsi. Il glutammato rilasciato altera la fluorescenza della proteina del sensore, che decade nel tempo, indicando l'efficienza del rilascio e della clearance.

Analisi del rilascio e della clearance del glutammato in una singola sinapsi neuronale in una fetta di cervello di topo

Fonte: Changou, C. A., et. al. Immagini dal vivo del traffico della proteina GLUT4 nei neuroni ipotalamici primari di topo utilizzando la microscopia a deconvoluzione. J. Vis. Exp. (2017). Questo video mostra l'imaging della traslocazione GLUT4 indotta dall'insulina nei neuroni ipotalamici, utilizzando la microscopia a deconvoluzione per catturare e analizzare le dinamiche di traffico di GFP-GLUT4 ad alta risoluzione.

Imaging del traffico proteico GLUT4 nei neuroni ipotalamici primari di topo mediante microscopia a deconvoluzione

L'attività di singoli neuroni di topi-adulti di età può essere studiato dissociandosi neuroni da regioni specifiche del cervello e l'utilizzo di membrana fluorescenti potenziale di imaging colorante. Da sperimentazioni risposte alle modifiche del glucosio, questa tecnica può essere utilizzata per studiare la sensibilità glucosio di adulti neuroni ipotalamici ventromedial.

Potenziale di membrana Dye Imaging di ventromediale dell&#39;ipotalamo neuroni da topi adulti per studiare glucosio Sensing

Presentiamo un protocollo per valutare l'equilibrio tra il rilascio del glutammato e l'autorizzazione alle singole sinapsi glutamatergiche corticosterogiche in fette acute di topi adulti. Questo protocollo utilizza il sensore fluorescente iGluu per il rilevamento del glutammato, una telecamera sCMOS per l'acquisizione del segnale e un dispositivo per l'illuminazione laser focale.

Indicatori di sinapsi singola di Soldamento Release e Uptake in Acute Brain Slices da Topi Normali e Huntington

Qui presentiamo un protocollo per misurare i flussi in vitro di Ca2 nei neuroni midbrain e i loro effetti a valle sulla caspase-3 utilizzando colture midbrain topo primario. Questo modello può essere utilizzato per studiare i cambiamenti patofsiologici legati all'attività anormale di Ca2 nei neuroni midbrain e per lo screening di nuove terapie per le proprietà anti-apoptotiche.

Quantificare i flussispontanei di Ca 2 e i loro effetti a valle nei neuroni Midbrain del topo primario

L'imaging in vivo è un potente strumento per lo studio della biologia in salute e malattia. Questo protocollo descrive l'imaging transpupillare della retina del topo con un microscopio standard a due fotoni. Dimostra anche diversi metodi di imaging in vivoimaging per marcare in modo fluorescente più coorti cellulari della retina.

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

Qui, dimostriamo come combinare la trasfezione di neuroni primari di roditori ippocampali con l'imaging confocale su cellule vive per analizzare gli effetti patologici indotti dalle proteine sul trasporto assonale e identificare percorsi meccanicistici che mediano questi effetti.

Utilizzo dell'imaging su cellule vive per misurare gli effetti delle proteine patologiche sul trasporto assonale nei neuroni primari dell'ippocampo

Impara a osservare il traffico di GLUT4 in tempo reale in neuroni ipotalamici primari del mouse usando la microscopia a deconvoluzione. Questo metodo rivela il ruolo del CCR5 nella segnalazione insulinica e nelle malattie metaboliche.

Immagini in diretta della proteina GLUT4 tratta di neuroni ipotalamici primario del Mouse usando la microscopia di Deconvolution (Video) | JoVE Journal

Immagini in diretta della proteina GLUT4 tratta di neuroni ipotalamici primario del Mouse usando la microscopia di Deconvolution

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