Immagini in diretta della proteina GLUT4 tratta di neuroni ipotalamici primario del Mouse usando la microscopia di Deconvolution

L'obiettivo generale di questo esperimento è osservare il traffico proteico in tempo reale nelle cellule neuronali primarie come GLUT4 nei neuroni ipotalamici con un danno minimo. Questo metodo può spiegare questioni chiave relative alla regolazione neuronale della segnalazione e del metabolismo dell'insulina, come nel caso del diabete mellito di tipo 2. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i ricercatori possono isolare colture cellulari primarie e osservare l'effetto indotto dal farmaco in tempo reale.

L'implicazione di questa tecnica è quella di scegliere una terapia per il diabete di tipo 2 o l'insulino-resistenza cerebrale correlata perché ora sappiamo come questo segnale insulinico viene alterato dalla chemochina CCL5 nei neuroni ipotalamici. Per iniziare questa procedura, rivestire i piatti di coltura con poli-D lisina un giorno prima della coltura. Per un piatto a sei pozzetti, aggiungere 1,5 mL di poli-D lisina a 0,05 mg/mL a ciascun pozzetto.

Il giorno successivo, rimuovere la poli-D lisina e lavare i piatti due volte con 2 ml di ddH2O. Quindi riempire le piastre di Petri da 10 cm con 20 ml di terreno di lavaggio e tenerle in ghiaccio. Riempire le provette da 15 ml con il terreno di lavaggio e tenerle in ghiaccio.

Per l'isolamento del tessuto cerebrale, sterilizzare la piattaforma, il microscopio da dissezione e gli strumenti chirurgici con etanolo al 75% per evitare la contaminazione. Dopodiché, taglia intorno all'area del cordone ombelicale per isolare i cuccioli senza danneggiarli. Quindi, rimuovi la testa di ogni cucciolo e fissala in posizione usando la pinza dritta a punta fine.

Usa un'altra pinza curva a punta fine per rimuovere la pelle esterna e il cranio da entrambi i lati e staccarli dalla direzione anteriore a quella dorsale. Quindi, tieni i cervelli isolati in una capsula di Petri pulita con un mezzo di lavaggio ghiacciato. Capovolgi il cervello e mantieni il lato ventrale rivolto verso l'alto.

Successivamente, isolare il tessuto ipotalamico con una pinza curva a punta fine. Tenere il lobo olfattivo con la pinza affilata e staccare le meningi sottili che circondano l'intero cervello con la pinza curva. Capovolgi la parte inferiore della corteccia e separa l'ippocampo dalla corteccia tirandolo di lato.

Quando tutte le regioni del cervello sono state isolate, tritare questi tessuti nelle provette da 15 ml contenenti un mezzo di lavaggio ghiacciato. In questa procedura, sciacquare i tessuti capovolgendo il tubo contenente il tessuto due o tre volte. Quindi, tieni il tubo dritto per consentire ai tessuti di stabilizzarsi.

Rimuovere il mezzo superiore utilizzando la pipetta di vetro Pasteur collegata a un sistema a vuoto. Per lavare il fazzoletto, aggiungere 15 ml di terreno di coltura ghiacciato e capovolgere la provetta due o tre volte. Dopo il lavaggio finale, rimuovere il terreno di lavaggio con l'aiuto di una pipetta da 1 ml.

Incubare i tessuti con tampone di digestione papaina-tripsina in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per sette-14 minuti. Successivamente, neutralizzare l'attività degli enzimi aggiungendo un volume di siero fetale bovino. Tenere la provetta su una rastrelliera e attendere uno o due minuti per consentire ai fazzoletti di stabilizzarsi.

Successivamente, rimuovere con cura il surnatante con una pipetta da 1 ml. Aggiungere 6 mL di terreno di placcatura nella provetta e pipettare delicatamente il tessuto su e giù 50 volte con una pipetta da 5 mL. Tenere la provetta sulla rastrelliera e attendere uno o due minuti per consentire ai tessuti grossi e non dissociati di depositarsi.

Successivamente, trasferire la fase superiore contenente le cellule dissociate in una nuova provetta e diluirla con un mezzo di placcatura. Quindi, aggiungere 2 ml di terreno di coltura completo in ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti. Per preparare le cellule per l'imaging dal vivo, rimuovere con cura i vetrini coprioggetti con i neuroni usando una pinza e posizionarli sul vetrino con cautela.

Quindi, rimuovere il terreno in eccesso con salviette delicate piegandole due volte e posizionandole con cura sul vetrino coprioggetto senza spostarlo. È essenziale rimuovere la quantità eccessiva di fluido per evitare movimenti non necessari sul vetrino coprioggetto. Successivamente, trattare i campioni di cellule selezionate con CCL5 a 10 ng/mL o insulina a 10 unità/mL per un minuto.

Successivamente, aggiungere 1,5 mcL di insulina diluita sul bordo dei vetrini coprioggetti. Quindi, aggiungere olio da immersione su un obiettivo da 1,52 NA con ingrandimento 60x. Successivamente, posizionare i vetrini coprioggetti sul tavolino del microscopio a deconvoluzione con i vetrini rivolti verso il basso e fissati correttamente.

Utilizzare l'illuminazione a campo chiaro o a fluorescenza per identificare le cellule bersaglio. Successivamente, regolare la messa a fuoco fino a quando le cellule target non possono essere osservate chiaramente. Non spostare la lente dell'obiettivo al di fuori dell'area del vetrino coprioggetto per evitare inutili graffi

Quindi, identificare GFP-GLUT4 dal segnale GFP. Quindi identificare le cellule target desiderate per l'acquisizione dell'immagine. Successivamente, impostare i parametri sperimentali appropriati su ciascuna cella target, tra cui il numero di pixel, la lunghezza d'onda di eccitazione, la percentuale di trasmissione, il tempo di esposizione, lo spessore della pila, l'intervallo di tempo e il tempo totale di imaging.

Regolare il parametro di esposizione su circa 2000-3000 conteggi per ottenere la massima intensità di pixel. Per ridurre al minimo lo sbiancamento fotografico a fluorescenza, ridurre il più possibile la percentuale di trasmissione della luce di eccitazione mantenendo il tempo di esposizione inferiore a un secondo. Impostare il limite superiore e inferiore della pila Z su ciascuna cella bersaglio spostando il tavolino del microscopio fino a quando la parte superiore e inferiore della cella bersaglio non sono entrambe leggermente sfocate.

È molto importante ridurre al minimo lo sbiancamento delle foto fluorescenti nella morte dei neuroni dopo l'immagine luminosa. Questa figura mostra che i neuroni ipotalamici primari in coltura sono stati marcati con il marcatore neuronale MAP2. Il marcatore neuronale ipotalamico POMC e la loro co-espressione di CCR5.

L'immagine co-localizzata mostra che CCL5 è espresso nei neuroni ipotalamici POMC-positivi. Queste immagini mostrano l'espressione della proteina GFP-GLUT4 nei neuroni ipotalamici wild type e nei neuroni ipotalamici double-negative CCR5. I neuroni sono stati stimolati con insulina o CCL5.

Le frecce puntano al punto GFP-GLUT4 nella neurite prima o dopo la stimolazione con insulina o CCL5 e gli asterischi indicano la superficie GLUT4-GFP prima o dopo la stimolazione CCL5. Una volta padroneggiata, questa registrazione di laboratorio della tecnica della cellula primaria può essere eseguita da una a quattro ore, a seconda dei requisiti dell'esperimento e se è eseguita correttamente. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare la possibilità di caratterizzare l'effetto immediato indotto dal farmaco nella coltura cellulare primaria.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare un neurone ipotalamico primario, un neurone ippocampale e un neurone corticale. Oltre al laboratorio, puoi anche sapere come eseguire una registrazione dal vivo della molecola seriale dopo diverse stimolazioni. Non dimenticare di indossare il camice e i guanti da laboratorio e di usare frequentemente l'etanolo per evitare la contaminazione da batteri e funghi degli animali.

Inoltre, fai molta attenzione quando hai a che fare con vetrini coprioggetti e neuroni durante questa procedura.