Studiando il segnale ipotalamico insulina ad intolleranza al glucosio periferico con un sistema di infusione del farmaco continuo nel cervello del Mouse

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di studiare il ruolo della segnalazione ipotalamica C-C-L-5 nella funzione dell'insulina nel sistema periferico e nel metabolismo del glucosio manipolando la segnalazione C-C-L-5 somministrando l'antagonista Met-C-C-L-5 attraverso un sistema di rilascio ventricolare intercerebrale, la pompa micro-osmotica. Questo farmaco può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo della fisiologia biochimica, come la chemochina C-C-L-5 nel controllo del metabolismo del glucosio corporeo e la risposta all'insulina nel cervello. Il vantaggio principale di questa misura è che lo sperimentatore può facilmente manipolare alcuni segnali nel cervello per un periodo di tempo, come il C-C-L-5 qui, senza effetto compensatorio o sviluppare disordine, cosa che di solito accade quando facciamo la manipolazione genetica nei roditori.

La dimostrazione visiva di questa procedura è importante in quanto l'inserimento della pompa microosmotica e la misurazione accurata del livello di insulina e glucosio nel sangue richiedono abilità e precisione. Un giorno prima dell'intervento, preparare le pompe microosmotiche cerebrali utilizzando una siringa da un millilitro e un ago a testa smussata per riempire le pompe con liquido cerebrospinale artificiale, o A-C-S-F. Quindi, immergere la pompa in A-C-S-F e posizionarla su uno shaker per agitare delicatamente durante la notte.

Il giorno seguente, rimuovere l'A-C-S-F dalla pompa e riempirla completamente con la soluzione farmacologica precedentemente preparata diluita in A-C-S-F fino a quando l'eccesso non fuoriesce. Quindi, utilizzare le forbici chirurgiche per tagliare i tubi del catetere alla lunghezza desiderata. Utilizzando un ago per infusione cerebrale smussato, collegare i tubi al kit per infusione cerebrale.

Quindi, riempire i tubi del kit per infusione con la soluzione farmacologica. Dopo aver assemblato il kit, collegarlo alla pompa microosmotica. Infine, per evitare che la pompa si secchi, immergere l'impostazione dell'infusione cerebrale della pompa osmotica in A-C-S-F all'interno di un tubo sterilizzato da 50 millilitri.

Per iniziare l'intervento, montare e fissare la testa di un topo anestetizzato su un apparecchio stereotassico. Usando un paio di forbici chirurgiche e tenaglie, taglia la pelle esterna che copre il cranio. Quindi, usa lo iodio per pulire il cranio periferico.

Quindi, utilizzare un paio di forbici a testa smussata vicino alla regione del collo per separare lo strato più esterno della pelle dalla pelle sottocutanea per l'impianto del set di fusione cerebrale con pompa osmotica. Utilizzare l'apparato stereotassico per marcare il punto di infusione con riferimento alla mappa cerebrale. Usa un trapano per unghie per praticare un foro attorno all'area segnata sul cranio, facendo attenzione a non rompere le meningi e i vasi sanguigni del topo.

Quindi, posizionare il set di fusione cerebrale della pompa microosmotica contenente il farmaco di interesse, o A-C-S-F come controllo, sotto la pelle dietro la regione del collo. Per infondere il farmaco nel cervello, inserire l'ago per infusione cerebrale nel foro praticato. Usa il gel desensibilizzante per superfici per fissare l'ago in posizione sul cranio e attendi che la colla si asciughi.

Tagliare la parte sporgente sopra l'ago. Prima di iniziare il test di tolleranza al glucosio, preparare la soluzione di glucosio sciogliendo 3,75 grammi di glucosio e 15 millilitri di acqua distillata. Imposta un calendario con intervalli adeguati tra ogni esame del sangue per registrare le letture durante l'esperimento.

Quindi, pesare ogni topo dopo il digiuno per calcolare la quantità appropriata di glucosio per l'iniezione. Quindi, al banco di lavoro, preparare un timer, un chip di glucosio, un glucometro, una siringa da insulina e lamette da barba. Per misurare il livello di glucosio nel sangue, inserire prima un nuovo chip di glucosio nel glucometro e premere il pulsante di avvio per impostare lo zero.

Quindi, prendi il topo nella parte posteriore del collo e accarezza la sua coda per garantire un flusso sanguigno sufficiente. Usa una nuova lama di rasoio per tagliare un piccolo pezzo di coda e poi spremere una goccia di sangue nel chip di glucosio. Utilizzando la tecnica della lavanda intragastrica, somministrare al topo il glucosio e avviare immediatamente il timer.

Misurare il glucosio in diversi punti temporali. Per iniziare il test di tolleranza all'insulina, preparare 0,25 unità di soluzione di insulina umana. Quindi, pesare ogni topo dopo il digiuno per calcolare la quantità appropriata di insulina per l'iniezione.

Successivamente, imposta un calendario per registrare le letture durante l'esperimento. Infine, dopo l'iniezione di insulina, misurare il livello di glucosio nel sangue come fatto in precedenza. Il metabolismo del glucosio è stato misurato mediante il test di tolleranza al glucosio orale dopo l'intervento chirurgico, dopo la somministrazione orale di glucosio nei topi.

Le variazioni del livello di glucosio nel sangue nei topi infusi con A-C-S-F, o infusi con antagonista C-C-L-5, sono registrate e mostrate qui. È stato anche eseguito il test di sensibilità all'insulina e il livello di glucosio nel sangue nei topi infusi con antagonista C-C-L-5 è stato solo leggermente ridotto rispetto ai topi di controllo, suggerendo compromissioni della funzione insulinica sul metabolismo periferico del glucosio nei topi trattati con C-C-L-5. Per analizzare l'attivazione del segnale dell'insulina, nell'ipotalamo è stata valutata la proteina del substrato del recettore dell'insulina, o fosforilazione I-R-S-1.

Nei topi trattati con antagonisti C-C-L-5 quando alimentati normalmente, la fosforilazione di I-R-S-1 era sovraregolata rispetto al gruppo di controllo. Per analizzare ulteriormente l'attivazione del segnale dell'insulina, sono stati valutati anche i livelli di serina fosforilata 4-7-3 Akt, molecola di segnalazione a valle dell'insulina. Successivamente, il segnale AKT di sfida insulinica è stato aumentato nei topi di controllo trattati con A-C-S-F, ma non nei topi trattati con antagonista C-C-L-5.

Una volta padroneggiato l'inserimento della pompa micro-osmotica, richiederà solo mezz'ora se fatto correttamente. Durante il tentativo di questa procedura è importante assicurarsi che la testa del mouse sia leggermente sollevata e che la colonna vertebrale sia dritta sull'apparato stereotassico. Questa tecnica fornisce al ricercatore un modo in endocrinologia per esplorare l'effetto di un farmaco, una chemochina o una funzione proteica nel cervello del roditore.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire ulteriori misure come la manipolazione dell'espressione genica con una somministrazione intracerebrale di un virus, o crisper 9 per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio in che modo il C-C-L-5 e il recettore C-C-L-5 partecipano ai circuiti di digestione e metabolismo del cibo?