Name: Valutazione della risposta di Dictyostelium discoideum alla stimolazione meccanica acuta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Scopri come valutare la risposta cellulare alla stimolazione meccanica acuta in Dictyostelium discoideum. Questo metodo microscopico isola la risposta iniziale senza interferenze di motilità, analizzando la localizzazione di biosensori fluorescenti.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I metodi descritti qui offrono un modo pratico per valutare la popolazione e comportamento delle singole celle in risposta a di taglio di flusso. D'importanza, mentre gli studi precedenti analizzati localizzazione dei principali e in ritardo di marcatori di bordo durante la migrazione, l'attuale approccio permette di indagine degli effetti immediati applicando il flusso di shear acutamente. Usando questo metodo abbiamo dimostrato che, in realtà, la risposta iniziale delle cellule per la tosatura del flusso non richiede m...

Migrazione delle cellule eucariotiche è prevenuto da diversi stimoli chimici e fisici nell'ambiente, compresi gradienti di chemioattrattanti solubile o associata a substrato, rigidità variabile del flusso di shear, campi elettrici o substrati. Anche se ci sono stati molti progressi nella nostra comprensione dei meccanismi molecolari guida chemiotassi, meno si sa sugli altri tipi di migrazione diretto e come questi segnali diversi sono integrati a livello cellulare per produrre un unificato migratori risposta.
Regia di migrazione verso una crescente concentrazione di un chemoattractant coinvolge tre componenti comportamentali: motilità, rilevamento direzionale e polarità1. Motilità si riferisce al movimento casuale delle cellule raggiunto dalla sporgenza pseudopodo. Rilevamento è la capacità di una cellula per individuare la fonte di un chemoattractant direzionale, che può verificarsi anche in immobilizzato cellule. Polarità si riferisce alla distribuzione asimmetrica più stabile di componenti intracellulari tra il leader e il bordo in ritardo di una cella, che conduce a una maggiore persistenza in movimento.
Risposta cellulare ad un chemoattractant dipende dall'attività delle quattro reti di regolazione concettualmente definiti: recettore / proteina G, trasduzione del segnale, citoscheletro di actina e polarità1. Associazione di fattore chemiotattico per i recettori accoppiati a proteine G trasmette il segnale tramite α proteine G eterotrimeriche e βγ per la rete di trasduzione del segnale a valle, che amplifica il segnale direzionale. Le vie multiple all'interno della rete di trasduzione del segnale agiscono in parallelo e alimentano la rete del citoscheletro di actina per polimerizzazione dell'actina bias e conseguente pseudopodio protrusione, in direzione della sfumatura. Tra importanti regolatori della chemiotassi sono Ras GTPase, TorC2, fosfoinositide 3-chinasi (PI3K), omologo della fosfatasi e tensin (PTEN) e la ciclasi di guanylyl. Meccanismi di feedback all'interno della rete di trasduzione del segnale e tra la trasduzione del segnale e reti di citoscheletro di actina ulteriormente amplificano la risposta. Infine, la rete di polarità mal definiti riceve input dal citoscheletro di actina e ulteriormente biases rete di trasduzione del segnale per promuovere la migrazione persistente nella direzione della sfumatura.
Gran parte della nostra comprensione meccanicistica della chemiotassi è stato reso possibile a causa dello sviluppo di biosensori fluorescente contrassegnati per i vari componenti delle reti di regolamentazione. Molti regolatori di chemiotassi hanno una distribuzione asimmetrica la molecola regolamentazione stessa o la sua attività. Ad esempio, biosensori che riconoscono attivato versioni di piccolo GTPases Ras e Rap1 – Ras-associazione domini di Raf1 (denominato RBD qui) e RalGDS, rispettivamente – localizzare a bordo di una cella di chemotassi2,3. Allo stesso modo, PI3K e suo prodotto fosfatidilinositolo (3, 4,5)-trifosfato (PIP3), riconosciuto da un dominio di omologia (PH) di pleckstrin, mostrano anche la localizzazione nella parte anteriore di una cella4,5. Al contrario, un 3-fosfatasi PTEN, che converte il PIP3 torna a fosfatidilinositolo (4,5)-bisphosphate, si localizza al bordo della cella6in ritardo. D'importanza, questi biosensori cambiano loro localizzazione in risposta alla stimolazione globale con un fattore chemiotattico. Marcatori di avanguardia, che sono citosolici o sulle punte delle sporgenze in una cella di riposo, rilocalizzare alla corteccia, considerando che in ritardo di marcatori di bordo, che hanno localizzazione corticale e sono assenti dalle punte delle sporgenze in una cella di riposo, diventano citosolico dopo stimolazione. Analisi della distribuzione di biosensore in risposta alla stimolazione globale con un chemoattractant riduce al minimo il contributo della motilità e della polarità, che spesso confondono le osservazioni. Stimolazione globale o uniforme di una sospensione di cellule con un chemoattractant è utilizzata anche come strumento per valutare i cambiamenti di tutta la popolazione nell'attivazione di proteine, spesso rilevato da proteina fosforilazione7,8,9 . Questa analisi biochimica viene utilizzata principalmente per ottenere informazioni temporali, mentre microscopia viene utilizzata per raccogliere informazioni spaziali e temporali sul comportamento dei vari componenti delle reti di regolamentazione.
Rete di trasduzione del segnale incorpora le caratteristiche di un sistema eccitabile10,11. Le risposte agli stimoli chemiotattici supra-soglia sono "definitiva" e visualizzare i periodi refrattari. Le risposte vengono anche attivate casualmente e possono mostrare comportamento oscillatorio. Eventi di trasduzione del segnale sono localizzati nelle regioni della corteccia che si propagano come onde12,13,14,15. Anteriore, indietro, marcatori sono reclutati per o dissociano da, zone attive delle onde moltiplicazione. A causa della regione refrattaria finali della zona attiva, le onde in modo opposto dirette annichilano come si incontrano. La moltiplicazione delle onde di trasduzione di segnale sottendono le sporgenze cellulari che mediano la cella migrazione10.
Molte delle suddette informazioni su chemiotassi è venuto dagli studi sull'ameba sociale Dictyostelium discoideum, anche se simili meccanismi regolatori sono applicabili anche ai neutrofili e altri tipi di cellule di mammifero16 . Dictyostelium è un organismo modello ben consolidata che ha una robusta risposta chemiotattica durante l'inedia, quando migliaia di singole cellule di migrazione verso un centro di aggregazione, alla fine formano un corpo fruttifero multicellulare contenente spore. La chemiotassi è essenziale anche durante la fase di crescita di singola cellula di questo organismo per l'individuazione di fonti di cibo batterica. D'importanza, la migrazione di singole cellule di Dictyostelium è notevolmente simile alla migrazione di mammiferi neutrofili o cellule tumorali metastatiche, i quali subiscono molto rapida migrazione ameboide-tipo. Infatti, entrambi la topologia globale delle reti regolamentari, così come molte delle vie di trasduzione del segnale individuali coinvolte nella chemiotassi sono conservate tra Dictyostelium e leucociti mammiferi17. Inoltre, altre cellule, come i fibroblasti, utilizzano recettori tirosin chinasici (RTK) invece di GPCR; Tuttavia, RTK può alimentano reti simili.
A differenza di chemiotassi, conoscenza approfondita dei meccanismi di segnalazione che guidano varie altre modalità di migrazione diretto è carente. Analogamente alle cellule la migrazione in una sfumatura di chemoattractant parecchi studi hanno riferito l'attivazione e/o localizzazione di marcatori tipici all'avanguardia, tra cui polimerizzazione dell'actina, PIP3 e/o chinasi segnale-regolata extracellulare (ERK) 1/2, presso il parte anteriore delle cellule che subiscono diretto migrazione in risposta a taglio di flusso o modifiche in campi elettrici18,19,20,21. Tuttavia, in questi studi l'esposizione allo stimolo ha provocato anche nella migrazione cellulare, lasciando aperta la questione se, ad esempio, i marcatori di avanguardia localizzare specificamente in risposta ad uno stimolo, o se semplicemente si localizza all'avanguardia a causa di aumento del numero di pseudopodi nella parte anteriore di una migrazione delle cellule.
Abbiamo sviluppato le analisi che ci permettono di osservare la risposta delle cellule a perturbazione meccanica acuta inviati come flusso di shear sia a livello di popolazione e come singole celle22. Simile alla stimolazione globale con un chemoattractant, stimoli acutizione con flusso di shear permette lo studio di una risposta cellulare ad uno stimolo meccanico senza il contributo di confondimento da motilità o polarità. Combinando questi saggi biochimici e microscopici con perturbazioni genetiche o farmacologiche permette di imparare a stimoli meccanici come sono percepiti e trasmessi. Inoltre, questo approccio fornisce anche un metodo novello per attingere il sistema a valle del recettore chemoattractant in assenza di un fattore chemiotattico, isolando quindi le reti di citoscheletro l'actina e la trasduzione del segnale dal recettore/G rete di proteina.
Utilizzando le tecniche descritte qui di seguito abbiamo recentemente dimostrato che acuta lo shear stress conduce all'attivazione di più componenti del segnale chemiotattico trasduzione e l'actina citoscheletrica reti22. Applicando lo stimolo meccanico acuto a intervalli variabili, abbiamo dimostrato che, analogamente ai segnalanti, risposta agli stimoli meccanici anche esibisce caratteristiche di un sistema eccitabile, incluso il comportamento definitivo della risposta sotto saturando le condizioni e la presenza di un periodo refrattario. Infine, mediante la combinazione di stimolazione meccanica e chimica abbiamo mostrato che i due stimoli condividano segnale trasduzione e actina citoscheletrica reti, che probabilmente consentono l'integrazione di molteplici stimoli per migrazione delle cellule di sbieco.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagenti</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Destrosio</td><td>Fisher</td><td>D16-1</td><td>Utilizzare per preparare terreni HL-5 e piastre SM (passaggi 1.1, 1.2)</td></tr><tr><td>Proteoso peptone</td><td>Fisher</td><td>DF0120-17-6</td><td>Utilizzare per preparare terreni HL-5 (passaggio 1.1)</td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Fisher</td><td>50-550-445</td><td>Utilizzare per preparare terreni HL-5 e piastre SM (passaggi 1.1, 1.2)</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 7H2O</td><td>Fisher</td><td>S373-500</td><td>Utilizzare per preparare terreni HL-5 e tampone fosfato 10X (passaggi 1.1, 1.3)</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>P386-500</td><td>Utilizzare per preparare terreni HL-5, piastre SM e tampone fosfato 10X (passaggi 1.1-1.3)</td></tr><tr><td>Streptomicina (diidrostreptomicina solfato)</td><td>Fisher</td><td>ICN10040525</td><td>Utilizzare per preparare terreni HL-5 (passaggio 1.1)</td></tr><tr><td>Peptone (Bacto)</td><td>Fisher</td><td>DF0118-17-0</td><td>Utilizzare per preparare piastre SM (passaggio 1.2)</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher</td><td>P288-100</td><td>Utilizzare per preparare piastre SM (passaggio 1.2)</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td>Utilizzare per preparare piastre SM (passaggio 1.2)</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher</td><td>M65-500</td><td>Utilizzare per preparare DB Buffer (passaggio 1.4)</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Utilizzare per preparare DB Buffer (passaggio 1.4)</td></tr><tr><td>Caffeina</td><td>Fisher</td><td>O1728-500</td><td>Utilizzare per preparare caffeina (passaggio 1.5)</td></tr><tr><td>cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosina 3 ft.,5 ft.-monofosfato ciclico, sale di sodio)</td><td>Fisher</td><td>11-680-1100MG</td><td>Utilizzare per preparare cAMP (passaggio 1.6)</td></tr><tr><td>Acido folico</td><td>Sigma</td><td>F7876</td><td>Utilizzare per preparare il folico acido (fase 1.7)</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td>Utilizzare per preparare un tampone campione 3X (fase 1.8)</td></tr><tr><td>Dodecil solfato di sodio (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166-500</td><td>Utilizzare per preparare un tampone campione 3X (passaggio 1.8)</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Fisher</td><td>G33-500</td><td>Utilizzare per preparare un tampone campione 3X (passaggio 1.8)</td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610610</td><td>Utilizzare per preparare un tampone campione 3X (passaggio 1.8)</td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Bio-Rad</td><td>1610404</td><td>Utilizzare per preparare un tampone campione 3X (fase 1.8)</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fisher</td><td>S299-100</td><td>Utilizzare per preparare una tampone per campioni con inibitori della proteasi e della fosfatasi (fase 1.8)</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Fisher</td><td>50-994-911</td><td>Utilizzare per preparare una tampone per campioni con inibitori della proteasi e della fosfatasi (fase 1.8)</td></tr><tr><td>Pirofosfato di sodio decaidrato</td><td>Fisher</td><td>S390-500</td><td>Utilizzare per preparare il tampone del campione con inibitori della proteasi e della fosfatasi (passaggio 1.8)</td></tr><tr><td>Cocktail completo di inibitori della proteasi senza EDTA (Roche)</td><td>Sigma</td><td>11873580001</td><td>Utilizzare per preparare il tampone del campione con inibitori della proteasi e della fosfatasi (passaggio 1.8)</td></tr><tr><td>Latrunculina A</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T119-0100</td><td>Utilizzare per preparare la latruncolina A (passaggio 1.9)</td></tr><tr><td>4-15% Tris-HCl poliacrilammide</td> gel <td>Bio-Rad</td><td>3450029</td><td>Utilizzare per l'immunoblotting (fase 3.3)</td></tr><tr><td>Membrana in fluoruro di polivinilidene</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td>Utilizzare per l'immunoblotting (fase 3.3)</td></tr><tr><td>Fosfo-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Anticorpo di coniglio</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>2060</td><td>Anticorpo primario per l'uso nell'immunoblotting (fase 3.3)</td></tr><tr><td>Fosfo-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) ( D13.14.4E) Anticorpo XP</td><td>Cell Signaling</td><td>4370</td><td>Anticorpo primario per l'uso nell'immunoblotting (passaggio 3.3)</td></tr><tr><td>Coniglio IgG HRP Linked Whole Ab (da Donkey)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-100UL</td><td>Anticorpo secondario per l'uso nell'immunoblotting (passaggio 3.3)</td></tr><tr><td>Substrato di chemiluminescenza potenziato (Clarity Western ECL Substrate)</td><td>Bio-Rad</td> 1705060 <td>Utilizzare per l'immunoblotting (passaggio 3.3)</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di strippaggio (Restore Plus Western blot stripping buffer)</td><td>Pierce</td><td>PI46430</td><td>Utilizzare per l'immunoblotting (passaggio 3.3)</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue</td><td>Fisher</td><td>PI20278</td><td>Utilizzare per l'immunoblotting (passaggio 3.3)</td></tr><tr><td>Ceppo K. aerogenes (non patogeno)</td><td>Dicty Stock Center (dictybase.org)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Materiali e attrezzature</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale (modello G-33 o un'alternativa comparabile)</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Utilizzare per coltivare K. aerogenes (passaggio 2.1.1) e per basare e stimolare le cellule D. discoideum (passaggio 3). Il raggio di rotazione di questo agitatore è di 9,5 mm.</td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 10 cm</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>Utilizzare per preparare piastre SM (passaggio 1.2)</td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Fisher</td><td>02-671-51B</td><td>Utilizzare per contare le cellule D. discoideum (passaggio 2.1.2)Piastra</td></tr> <tr>da <td>35 mm (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish)</td><td>Fisher</td><td>08-772A</td><td>Utilizzare per piastrareD. discoideumcell per la stimolazione meccanica seguita da lisi cellulare (passaggio 3.1.1)</td></tr><tr><td>Coppetta in polistirene (5 mL)</td><td>VWR</td><td>13915-985</td><td>Utilizzare per stimolare la sospensione cellulare D. discoideum con un chemioattrattivo (passaggio 3.2.2)</td></tr><tr><td>Unità fluidica con pompa (ibidi Pump System)</td><td>Ibidi</td><td>10902</td><td>Utilizzare per erogare la stimolazione meccanica alle cellule D. discoideum in un canale (passaggi 4.1, 4.2 e 5)</td></tr><tr><td>Vetrino con un canale (&mu;-Slide III 3in1 ibiTreat: vetrino coprioggetti in polimero #1.5, coltura tissutale trattata, sterilizzato)</td><td>Ibidi</td><td>80316</td><td>Utilizzare per piastre D. discoideum cellule per la stimolazione meccanica erogata da un dispositivo fluidico (passaggi 4.1, 4.2 e 5)</td></tr><tr><td>Serbatoi da 50 mL (supporto del serbatoio Ibidi per unità fluidica)</td><td>Ibidi</td><td>10978</td><td>Utilizzare per configurare il dispositivo fluidico per erogare la stimolazione meccanica alle cellule D. discoideum in un canale (passaggi 4.1, 4.2 e 5)</td></tr><tr><td>Linee per l'unità fluidica (Set di perfusione GIALLO e VERDE)</td><td>Ibidi</td><td>10964</td><td>Utilizzare per configurare il dispositivo fluidico per erogare la stimolazione meccanica alle cellule D. discoideum in un canale (passaggi 4.1, 4.2 e 5). Nota: le due linee possono essere tagliate anche dal tubo da 1,6 mm (numero di catalogo 10842).</td></tr><tr><td>Linea per lo scarico (tubo con diametro interno di 1,6 mm)</td><td>Ibidi</td><td>10842</td><td>Utilizzare per configurare il dispositivo fluidico per l'erogazione della stimolazione meccanica alle cellule D. discoideum in un canale (passaggi 4.1, 4.2 e 5).</td></tr><tr><td>Microscopio invertito Zeiss Observer.Z1 dotato di un obiettivo ad olio 40X/1.3 e di un obiettivo ad aria 20X/0.3 (o un'alternativa comparabile)</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Utilizzato per l'imaging di cellule D. discoideum con illuminazione a contrasto di fase o a fluorescenza (passaggi 4 e 5)</td></tr><tr><td>Microscopio confocale a disco rotante UltraView dotato di un sensore a 40&/1.25... Obiettivo dell'olio 0,75 (o un'alternativa comparabile)</td><td>Perkin-Elmer</td><td>DM 16000</td><td>Un'alternativa utilizzata per l'imaging di cellule D. discoideum (passaggio 4.1.4)</td></tr><tr><td>Microiniettore FemtoJet (Eppendorf; modello 5247 o un'alternativa comparabile) con Eppendorf InjectMan</td><td>Eppendorf</td><td>5252000021D e 5192000027</td><td>Utilizzare per erogare la stimolazione meccanica alle cellule D. discoideum mediante una micropipetta (passaggio 4.3). Nota: i numeri di catalogo si riferiscono alla versione più recente dell'apparecchiatura (4i).</td></tr><tr><td>Micropipetta (Femtotip; 1 &mu; m diametro esterno, 0,5 &mu; m diametro interno )</td><td>Eppendorf</td><td>930000035</td><td>Utilizzare per erogare la stimolazione meccanica alle cellule D. discoideum mediante una micropipetta (passaggio 4.3)</td></tr><tr><td>Puntali per microloader (Eppendorf Femtotips Microloader Tips per microiniettore Femtojet)</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>Utilizzare per riempire la micropipetta (femtopunta) con tampone (passaggio 4.3.1)</td></tr><tr><td>Camera a 1 pozzetto (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)</td><td>Fisher</td><td>12-565-472</td><td>Utilizzare per la piastra di cellule D. discoideum per la stimolazione meccanica erogata da una micropipetta (passaggio 4.3.2)</td></tr><tr><td>Camera a 8 pozzetti (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass)</td><td>Fisher</td><td>12-565-338</td><td>Utilizzare per la piastra di cellule D. discoideum per stimolazione meccanica erogata mediante aggiunta di tampone di massa (passaggio 4.4.1)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi delle immagini (Fiji)</td><td>NIH</td><td>https://fiji.sc/</td> <td>Utilizzare per quantificare la risposta alla stimolazione meccanica (passaggio 4.5)</td></tr><tr><td>Software di analisi della migrazione (Tracking Tool PRO)</td><td>Gradientech</td><td>http://gradientech.se/tracking-tool-pro/</td> <td>Utilizzare per quantificare la velocità e la persistenza delle celle (passaggio 5.4)</td></tr></tbody></table>

valutazione della risposta di dictyostelium discoideum alla stimolazione meccanica acuta

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemiotassi, o la migrazione a una sfumatura di un fattore chemiotattico, è la modalità migliore capita di migrazione diretto. Gli studi utilizzando ameba sociale Dictyostelium discoideum hanno rivelato che una rete di trasduzione del segnale complesso di vie parallele amplifica la risposta di chemioattrattanti e conduce alla polimerizzazione dell'actina prevenuto e sporgenza di un pseudopodo nella direzione di una sfumatura. Al contrario, i meccanismi molecolari guida altri tipi di migrazione diretto, ad esempio, a causa di esposizione a taglio di flusso o campi elettrici, non sono noti. Molti regolatori di chemiotassi esibiscono localizzazione presso il bordo iniziale o in ritardo di una migrazione delle cellule, come pure mostrano cambiamenti transitori in localizzazione o attivazione dopo stimolazione globale con un fattore chemiotattico. Per comprendere i meccanismi molecolari di altri tipi di migrazione diretto abbiamo sviluppato un metodo che consente l'esame della risposta cellulare alla stimolazione meccanica acuta basata sull'esposizione breve (2-5 s) per la tosatura del flusso. Questa stimolazione può essere trasportata in un canale mentre le cellule che esprimono con etichetta fluorescente biosensori per esaminare il comportamento delle singole celle di imaging. Inoltre, la popolazione delle cellule può essere stimolata in un piatto, lisate e immunoblotted usando gli anticorpi che riconoscono le versioni attive di proteine di interesse. Combinando entrambi i test, si può esaminare una vasta gamma di molecole attivate dai cambiamenti nella localizzazione subcellulare e/o fosforilazione. Utilizzando questo metodo abbiamo determinato che acuta stimolazione meccanica innesca l'attivazione delle reti di citoscheletro l'actina e la trasduzione del segnale chemiotattico. La capacità di esaminare le risposte cellulari agli stimoli meccanici acuta è importante per comprendere l'origine eventi necessari per motilità indotta da flusso di shear. Questo approccio fornisce anche uno strumento per lo studio della rete di trasduzione del segnale chemiotattico senza l'influenza di confusione del recettore chemoattractant.

Risposta temporale dei regolatori di chemiotassi alla stimolazione meccanica acuta
Per valutare la risposta delle cellule di d. discoideum a stimolo meccanico, le cellule aderenti di aggregazione-competenti sono stati esposti a un breve impulso di flusso di shear. Aggregazione-competenti D. discoideum cellule secernono cAMP, che può essere percepita dai cellule vicine. Per superare il contributo di segnalazione de...

Qui descriviamo i metodi per la valutazione della risposta cellulare alla stimolazione meccanica acuta. Nell'analisi della base di microscopia, esaminiamo la localizzazione di biosensori fluorescente etichettati dopo breve stimolazione con flusso di shear. Ci prova anche l'attivazione di varie proteine di interesse in risposta alla stimolazione meccanica acuta biochimicamente.

Valutazione della risposta di Dictyostelium discoideum alla stimolazione meccanica acuta

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di esaminare l'attività di vari componenti della rete di trasduzione del segnale intracellulare a seguito di brevi perturbazioni meccaniche. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della migrazione cellulare, come ad esempio il modo in cui le cellule percepiscono e migrano direzionalmente verso diversi segnali ambientali, inclusi gli stimoli meccanici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'esame della risposta iniziale allo stimolo meccanico senza il contributo confondente della motilità o della polarità alla risposta.Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo testato la risposta delle cellule aderenti al chemioattrattivo che è stato somministrato con una leggera agitazione e abbiamo notato una robusta risposta delle cellule stimolate con il controllo del veicolo. Per iniziare, preparare Klebsiella aerogenes inoculando un piccolo numero di cellule da stock congelati in terreno HL5 senza antibiotici e incubare la coltura durante la notte. La crescita di Dictyostelium in presenza di batteri Klebsiella aerogenes ridurrà il numero di macropinosomi che miglioreranno la risposta delle cellule agli stimoli esterni.Cronometrare l'esperimento in modo che quando i batteri sono pronti, ci siano Dictyostelium che crescono in modo esponenziale. Raccogli queste cellule di Dictyostelium e contale usando un emocitometro. Quindi, stendere 260 microlitri di sospensione batterica contenente 100.000 cellule di Dictyostelium su una piastra SM.Sempre per l'assicurazione, preparare piastre con il doppio e la metà delle celle di Dictyostelium. Dopo un giorno di crescita a temperatura ambiente, capovolgere la piastra e continuare a coltivare la piastra fino a quando le cellule di Dictyostelium iniziano a ripulire il prato batterico ma non hanno ancora iniziato ad aggregarsi. Quindi, aggiungere cinque millilitri di tampone DB alla piastra e raschiare via il Dictyostelium usando un divaricatore di vetro.Trasferire le cellule e la soluzione in una provetta di polipropilene da 50 millilitri, quindi sciacquare la piastra con altri cinque millilitri di DB e aggiungere anche questo alla provetta da 50 millilitri. Ripetere se necessario. Per lavare il Dictyostelium, riempire il tubo fino a 50 millilitri con DB, pellettare le cellule, quindi aspirare e scartare il surnatante.Lavare ripetutamente le cellule fino a quando il surnatante non è limpido. Infine, risospendere il Dictyostelium in tampone DB a circa cinque milioni di cellule per millilitro. Per iniziare, impiatta due milioni di Dictyostelium competenti per l'aggregazione su piastre da 35 millimetri con due millilitri di DB. Preparare una piastra per ogni punto temporale e un controllo non stimolato.A temperatura ambiente, lasciare che le celle si attacchino alla piastra per 10 minuti. Quindi, lavare le celle non attaccate dalla piastra utilizzando due risciacqui con un millilitro di DB. Una volta che le piastre sono state ripulite dal Dictyostelium non attaccato, incubare le cellule attaccate in un tampone di basolazione per 30 minuti senza disturbare le piastre. È molto importante evitare qualsiasi movimento delle piastre durante la mezz'ora di incubazione per evitare una stimolazione prematura delle cellule.Ora, per applicare una quantità controllata di stimolazione meccanica, trasferire individualmente una piastra su un agitatore orbitale e far funzionare l'agitatore a 150 giri/min per cinque secondi. Quindi, trascorso il tempo desiderato, aspirare il tampone e mettere prontamente la piastra sul ghiaccio. Aggiungere immediatamente 100 microlitri di tampone campione con inibitori della proteasi e della fosfatasi e raschiare via le cellule.Raccogli il lisato in tubi da 1,5 millilitri e scaldali prontamente a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Procedi con l'analisi del lisato o trasferiscili a meno 20 gradi Celsius per la conservazione. Dopo aver effettuato sospensioni di cellule vegetative o competenti per l'aggregazione, caricare circa 600 microlitri nel vetrino della camera microfluidica.Gli ingressi devono essere completamente riempiti, quindi rabboccarli con un tampone se necessario. Lasciare che le celle si attacchino per 10 minuti. Collegare una linea di ingresso per il dispositivo a una pompa elettronica con un serbatoio da 15 millilitri.Utilizzando il controllo software della pompa, chiudere la valvola e quindi riempire il serbatoio con DB. A questo punto, impostate la pressione a 50 millibar e accendete la pompa. Riempire e risciacquare la linea con DB facendo clic sulla valvola per aprirla. Dopo aver risciacquato per circa 30 secondi, riportare la pressione a zero e quindi chiudere la valvola.Quindi, collegare la linea a uno dei tre ingressi su un lato della diapositiva. Non intrappolare bolle d'aria e, una volta effettuato il collegamento, coprire gli altri due ingressi su quel lato dello scivolo. Ora, completa la configurazione collegando la linea dallo scarico alla singola uscita sul lato opposto della guida.Quindi, in campo chiaro o in fase di illuminazione su un microscopio a fluorescenza, osservare il canale con un obiettivo ad aria 20X e risciacquare il canale. Successivamente, impostare la pressione a circa 50 millibar e aprire la valvola. Una volta che il liquido esce dallo scarico, ridurre a zero la pressione esterna, attendere circa 30 secondi e chiudere la valvola.Quindi, passa all'obiettivo a olio 40X, concentrati sulla parte più ampia del canale e prepara il software per raccogliere immagini ogni tre secondi con illuminazione RFP o GFP. Con la valvola chiusa, impostare la pressione sul valore desiderato. Quindi, acquisisci cinque immagini pre-stimolazione a intervalli di tre secondi.Quindi, aprire brevemente la valvola per erogare lo stimolo. A questo punto, raccogli almeno altri 15 fotogrammi di dati in 45 secondi. Quantificare la risposta come descritto nel protocollo di testo.Per prima cosa, caricare un vetrino microfluidico con Dictyostelium come descritto nella sezione precedente. Per questo esperimento, preparare due righe di input. Per chiudere le linee, utilizzare una pinza fisica sulla linea che trasporta la soluzione di trattamento e la valvola controllata da software per chiudere la linea che trasporta la soluzione DB con il veicolo.Ora, riempire le due linee con la soluzione appropriata, tampone più veicolo da solo o tampone con il trattamento come un inibitore. Dopo che le linee sono state risciacquate, collegarle a due ingressi sul lato della slitta con il canale e tappare l'ingresso non utilizzato. Quindi, collegare la linea di scarico alla presa sul lato opposto.A questo punto, lavare lo scivolo utilizzando il tampone più il veicolo come descritto in precedenza. Quindi, riempire il canale con il trattamento. Innanzitutto, riduci il flusso a zero millibar.Quindi, cambia le valvole, fai scorrere il trattamento per circa 15 secondi e inizia a cronometrare l'incubazione. Ogni 10 minuti circa, far scorrere una soluzione di trattamento fresca sulle cellule per circa 15 secondi per reintegrare i livelli di ossigeno nella camera. Le cellule aderenti competenti per l'aggregazione sono state esposte a cinque secondi di flusso di taglio utilizzando un agitatore orbitale.I Dictyostelium sono stati pre-trattati con caffeina per ridurre la loro attività basale. Di conseguenza, c'era un'attività basale molto bassa di PKBR1 e ERK2 e un robusto aumento della fosforilazione dei residui chiave di queste chinasi con la stimolazione. In cellule competenti per l'aggregazione che esprimono vari biosensori marcati in fluorescenza, due marcatori di bordo d'attacco, PHcrac e LimE, che vengono reclutati da PIP3 o actina di nuova polimerizzazione, hanno entrambi mostrato una localizzazione prevalentemente citosolica nelle cellule a riposo.Dopo cinque secondi di flusso di taglio, questi biosensori si sono rapidamente rilocalizzati nella corteccia e sono tornati nel citosol. Gli effetti del farmaco depolimerizzante dell'actina Latrunculina A sono stati testati utilizzando un esperimento simile sulla forza di taglio. In questo caso, le cellule vegetative sono state prima esposte a condizioni di controllo e poi sono passate al tampone che conteneva l'agente di prova desiderato.Il trattamento con latrunculina A ha bloccato la rilocalizzazione dei marcatori del bordo anteriore nella corteccia. Curiosamente, se il flusso non veniva interrotto dopo due secondi ma rimaneva acceso per tutta la durata dell'esperimento, si osservava comunque una risposta globale transitoria. A seguito della risposta globale, le cellule vegetative sono migrate contro il flusso.La corretta preparazione delle cellule è estremamente importante per il successo di questi saggi. Le cellule vegetative devono essere coltivate in associazione con i batteri per garantire la loro reattività alla stimolazione meccanica. Per le cellule competenti per l'aggregazione, le cellule che sono sottosviluppate o sovrasviluppate, tendono a rispondere male.Gli approcci biochimici e microscopici si completano a vicenda e questo ci ha permesso di valutare un gran numero di intermedi di trasduzione del segnale per la loro risposta alla stimolazione meccanica. Aggiungendo perturbazioni farmacologiche e genetiche, possiamo imparare come gli stimoli meccanici vengono percepiti e trasmessi. Questo è importante per comprendere la migrazione cellulare diretta che è guidata da stimoli fisici come il flusso di taglio.Poiché la stimolazione meccanica innesca l'attivazione della stessa rete di trasduzione del segnale dei chemioattrattivi, possiamo ora esaminare l'integrazione di vari stimoli sulle cellule. In definitiva, questi studi ci aiuteranno a capire come le cellule migranti, come le nostre cellule immunitarie e le cellule tumorali metastatiche, navigano attraverso il corpo.

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