Name: Valutazione della risposta di Dictyostelium discoideum alla stimolazione meccanica acuta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Scopri come valutare la risposta cellulare alla stimolazione meccanica acuta in Dictyostelium discoideum. Questo metodo microscopico isola la risposta iniziale senza interferenze di motilità, analizzando la localizzazione di biosensori fluorescenti.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è stato sostenuto dagli istituti nazionali di sovvenzione di salute R35 GM118177 a PND.

<ol><li>Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+chemotaxis%3A+a+network+of+signaling+pathways+controls+motility%2C+directional+sensing%2C+and+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity.</a> Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).</li>
<li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K%2C+cell+polarity%2C+and+directional+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).</li>
<li>Jeon, T. J., Lee, D. -J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1+controls+cell+adhesion+and+cell+motility+through+the+regulation+of+myosin+II%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II.</a> J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).</li>
<li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+Protein+Signaling+Events+Are+Activated+at+the+Leading+Edge+of+Chemotactic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells.</a> Cell. 95 (1), 81-91 (1998).</li>
<li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Regulation+of+3-Phosphoinositides+by+PI+3-Kinase+and+PTEN+Mediates+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis.</a> Cell. 109 (5), 611-623 (2002).</li>
<li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Suppressor+PTEN+Mediates+Sensing+of+Chemoattractant+Gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients.</a> Cell. 109 (5), 599-610 (2002).</li>
<li>Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RasC+is+required+for+optimal+activation+of+adenylyl+cyclase+and+Akt%2FPKB+during+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation.</a> EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).</li>
<li>Kamimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP3-Independent+Activation+of+TorC2+and+PKB+at+the+Cell%27s+Leading+Edge+Mediates+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis.</a> Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).</li>
<li>Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C+Regulation+of+Phosphatidylinositol+3%2C4%2C5-trisphosphate-mediated+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).</li>
<li>Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+excitable+signal+integrator+couples+to+an+idling+cytoskeletal+oscillator+to+drive+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration.</a> Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).</li>
<li>Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitable+Signal+Transduction+Induces+Both+Spontaneous+and+Directional+Cell+Asymmetries+in+the+Phosphatidylinositol+Lipid+Signaling+System+for+Eukaryotic+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis.</a> Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).</li>
<li>Gerisch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobile+Actin+Clusters+and+Traveling+Waves+in+Cells+Recovering+from+Actin+Depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization.</a> Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).</li>
<li>Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+modes+of+state+transitions+determine+pattern+in+the+Phosphatidylinositide-Actin+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system.</a> BMC Cell Biol. 12 (1), 42(2011).</li>
<li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Three-Dimensional+Dynamics+of+Actin+Waves%2C+a+Model+of+Cytoskeletal+Self-Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization.</a> Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).</li>
<li>Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Actin-Based+Wave+Generator+Organizes+Cell+Motility%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility.</a> PLOS Biol. 5 (9), e221(2007).</li>
<li>Devreotes, P., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+Networks+that+Regulate+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling Networks that Regulate Cell Migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).</li>
<li>Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+towards+a+paradigm%3A+common+mechanisms+of+chemotactic+signaling+in+Dictyostelium+and+mammalian+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).</li>
<li>Dalous, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+cell+polarity+and+actin-myosin+cytoskeleton+reorganization+under+mechanical+and+chemical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation.</a> Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).</li>
<li>Sato, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+direction+in+electric-signal-induced+cell+migration+by+cyclic+guanosine+monophosphate+and+phosphatidylinositol+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).</li>
<li>Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipids%2C+EGF+receptors%2C+and+intracellular+signals+colocalize+and+are+polarized+in+epithelial+cells+moving+directionally+in+a+physiological+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+j%22%5BJournal%5D)">Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field.</a> Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).</li>
<li>Decave, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+flow-induced+motility+of+Dictyostelium+discoideum+cells+on+solid+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate.</a> J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).</li>
<li>Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+mechanical+stimuli+act+on+common+signal+transduction+and+cytoskeletal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).</li>
<li>Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+development+and+chemotaxis+in+Dictyostelium+discoideum+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants.</a> Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).</li>
<li>Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Dictyostelium+discoideum+with+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).</li>
<li>Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24535823">PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis.</a> J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).</li>
<li>Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3381519/">Analysis of chemotaxis in Dictyostelium.</a> Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Brenner, M., Thoms, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+blocks+activation+of+cyclic+AMP+synthesis+in+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum.</a> Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).</li>
<li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Actin+Patterns+and+Arp2%2F3+Assembly+at+the+Substrate-Attached+Surface+of+Motile+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells.</a> Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).</li>
<li>Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+protein+Callipygian+defines+the+back+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).</li>
<li>Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Akt%2FPKB-related+kinase+is+essential+for+morphogenesis+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium.</a> Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).</li>
<li>Westendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton+of+chemotactic+amoebae+operates+close+to+the+onset+of+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I metodi descritti qui offrono un modo pratico per valutare la popolazione e comportamento delle singole celle in risposta a di taglio di flusso. D'importanza, mentre gli studi precedenti analizzati localizzazione dei principali e in ritardo di marcatori di bordo durante la migrazione, l'attuale approccio permette di indagine degli effetti immediati applicando il flusso di shear acutamente. Usando questo metodo abbiamo dimostrato che, in realtà, la risposta iniziale delle cellule per la tosatura del flusso non richiede m...

Migrazione delle cellule eucariotiche è prevenuto da diversi stimoli chimici e fisici nell'ambiente, compresi gradienti di chemioattrattanti solubile o associata a substrato, rigidità variabile del flusso di shear, campi elettrici o substrati. Anche se ci sono stati molti progressi nella nostra comprensione dei meccanismi molecolari guida chemiotassi, meno si sa sugli altri tipi di migrazione diretto e come questi segnali diversi sono integrati a livello cellulare per produrre un unificato migratori risposta.
Regia di migrazione verso una crescente concentrazione di un chemoattractant coinvolge tre componenti comportamentali: motilità, rilevamento direzionale e polarità1. Motilità si riferisce al movimento casuale delle cellule raggiunto dalla sporgenza pseudopodo. Rilevamento è la capacità di una cellula per individuare la fonte di un chemoattractant direzionale, che può verificarsi anche in immobilizzato cellule. Polarità si riferisce alla distribuzione asimmetrica più stabile di componenti intracellulari tra il leader e il bordo in ritardo di una cella, che conduce a una maggiore persistenza in movimento.
Risposta cellulare ad un chemoattractant dipende dall'attività delle quattro reti di regolazione concettualmente definiti: recettore / proteina G, trasduzione del segnale, citoscheletro di actina e polarità1. Associazione di fattore chemiotattico per i recettori accoppiati a proteine G trasmette il segnale tramite α proteine G eterotrimeriche e βγ per la rete di trasduzione del segnale a valle, che amplifica il segnale direzionale. Le vie multiple all'interno della rete di trasduzione del segnale agiscono in parallelo e alimentano la rete del citoscheletro di actina per polimerizzazione dell'actina bias e conseguente pseudopodio protrusione, in direzione della sfumatura. Tra importanti regolatori della chemiotassi sono Ras GTPase, TorC2, fosfoinositide 3-chinasi (PI3K), omologo della fosfatasi e tensin (PTEN) e la ciclasi di guanylyl. Meccanismi di feedback all'interno della rete di trasduzione del segnale e tra la trasduzione del segnale e reti di citoscheletro di actina ulteriormente amplificano la risposta. Infine, la rete di polarità mal definiti riceve input dal citoscheletro di actina e ulteriormente biases rete di trasduzione del segnale per promuovere la migrazione persistente nella direzione della sfumatura.
Gran parte della nostra comprensione meccanicistica della chemiotassi è stato reso possibile a causa dello sviluppo di biosensori fluorescente contrassegnati per i vari componenti delle reti di regolamentazione. Molti regolatori di chemiotassi hanno una distribuzione asimmetrica la molecola regolamentazione stessa o la sua attività. Ad esempio, biosensori che riconoscono attivato versioni di piccolo GTPases Ras e Rap1 – Ras-associazione domini di Raf1 (denominato RBD qui) e RalGDS, rispettivamente – localizzare a bordo di una cella di chemotassi2,3. Allo stesso modo, PI3K e suo prodotto fosfatidilinositolo (3, 4,5)-trifosfato (PIP3), riconosciuto da un dominio di omologia (PH) di pleckstrin, mostrano anche la localizzazione nella parte anteriore di una cella4,5. Al contrario, un 3-fosfatasi PTEN, che converte il PIP3 torna a fosfatidilinositolo (4,5)-bisphosphate, si localizza al bordo della cella6in ritardo. D'importanza, questi biosensori cambiano loro localizzazione in risposta alla stimolazione globale con un fattore chemiotattico. Marcatori di avanguardia, che sono citosolici o sulle punte delle sporgenze in una cella di riposo, rilocalizzare alla corteccia, considerando che in ritardo di marcatori di bordo, che hanno localizzazione corticale e sono assenti dalle punte delle sporgenze in una cella di riposo, diventano citosolico dopo stimolazione. Analisi della distribuzione di biosensore in risposta alla stimolazione globale con un chemoattractant riduce al minimo il contributo della motilità e della polarità, che spesso confondono le osservazioni. Stimolazione globale o uniforme di una sospensione di cellule con un chemoattractant è utilizzata anche come strumento per valutare i cambiamenti di tutta la popolazione nell'attivazione di proteine, spesso rilevato da proteina fosforilazione7,8,9 . Questa analisi biochimica viene utilizzata principalmente per ottenere informazioni temporali, mentre microscopia viene utilizzata per raccogliere informazioni spaziali e temporali sul comportamento dei vari componenti delle reti di regolamentazione.
Rete di trasduzione del segnale incorpora le caratteristiche di un sistema eccitabile10,11. Le risposte agli stimoli chemiotattici supra-soglia sono "definitiva" e visualizzare i periodi refrattari. Le risposte vengono anche attivate casualmente e possono mostrare comportamento oscillatorio. Eventi di trasduzione del segnale sono localizzati nelle regioni della corteccia che si propagano come onde12,13,14,15. Anteriore, indietro, marcatori sono reclutati per o dissociano da, zone attive delle onde moltiplicazione. A causa della regione refrattaria finali della zona attiva, le onde in modo opposto dirette annichilano come si incontrano. La moltiplicazione delle onde di trasduzione di segnale sottendono le sporgenze cellulari che mediano la cella migrazione10.
Molte delle suddette informazioni su chemiotassi è venuto dagli studi sull'ameba sociale Dictyostelium discoideum, anche se simili meccanismi regolatori sono applicabili anche ai neutrofili e altri tipi di cellule di mammifero16 . Dictyostelium è un organismo modello ben consolidata che ha una robusta risposta chemiotattica durante l'inedia, quando migliaia di singole cellule di migrazione verso un centro di aggregazione, alla fine formano un corpo fruttifero multicellulare contenente spore. La chemiotassi è essenziale anche durante la fase di crescita di singola cellula di questo organismo per l'individuazione di fonti di cibo batterica. D'importanza, la migrazione di singole cellule di Dictyostelium è notevolmente simile alla migrazione di mammiferi neutrofili o cellule tumorali metastatiche, i quali subiscono molto rapida migrazione ameboide-tipo. Infatti, entrambi la topologia globale delle reti regolamentari, così come molte delle vie di trasduzione del segnale individuali coinvolte nella chemiotassi sono conservate tra Dictyostelium e leucociti mammiferi17. Inoltre, altre cellule, come i fibroblasti, utilizzano recettori tirosin chinasici (RTK) invece di GPCR; Tuttavia, RTK può alimentano reti simili.
A differenza di chemiotassi, conoscenza approfondita dei meccanismi di segnalazione che guidano varie altre modalità di migrazione diretto è carente. Analogamente alle cellule la migrazione in una sfumatura di chemoattractant parecchi studi hanno riferito l'attivazione e/o localizzazione di marcatori tipici all'avanguardia, tra cui polimerizzazione dell'actina, PIP3 e/o chinasi segnale-regolata extracellulare (ERK) 1/2, presso il parte anteriore delle cellule che subiscono diretto migrazione in risposta a taglio di flusso o modifiche in campi elettrici18,19,20,21. Tuttavia, in questi studi l'esposizione allo stimolo ha provocato anche nella migrazione cellulare, lasciando aperta la questione se, ad esempio, i marcatori di avanguardia localizzare specificamente in risposta ad uno stimolo, o se semplicemente si localizza all'avanguardia a causa di aumento del numero di pseudopodi nella parte anteriore di una migrazione delle cellule.
Abbiamo sviluppato le analisi che ci permettono di osservare la risposta delle cellule a perturbazione meccanica acuta inviati come flusso di shear sia a livello di popolazione e come singole celle22. Simile alla stimolazione globale con un chemoattractant, stimoli acutizione con flusso di shear permette lo studio di una risposta cellulare ad uno stimolo meccanico senza il contributo di confondimento da motilità o polarità. Combinando questi saggi biochimici e microscopici con perturbazioni genetiche o farmacologiche permette di imparare a stimoli meccanici come sono percepiti e trasmessi. Inoltre, questo approccio fornisce anche un metodo novello per attingere il sistema a valle del recettore chemoattractant in assenza di un fattore chemiotattico, isolando quindi le reti di citoscheletro l'actina e la trasduzione del segnale dal recettore/G rete di proteina.
Utilizzando le tecniche descritte qui di seguito abbiamo recentemente dimostrato che acuta lo shear stress conduce all'attivazione di più componenti del segnale chemiotattico trasduzione e l'actina citoscheletrica reti22. Applicando lo stimolo meccanico acuto a intervalli variabili, abbiamo dimostrato che, analogamente ai segnalanti, risposta agli stimoli meccanici anche esibisce caratteristiche di un sistema eccitabile, incluso il comportamento definitivo della risposta sotto saturando le condizioni e la presenza di un periodo refrattario. Infine, mediante la combinazione di stimolazione meccanica e chimica abbiamo mostrato che i due stimoli condividano segnale trasduzione e actina citoscheletrica reti, che probabilmente consentono l'integrazione di molteplici stimoli per migrazione delle cellule di sbieco.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagenti</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Destrosio</td><td>Fisher</td><td>D16-1</td><td>Utilizzare per preparare terreni HL-5 e piastre SM (passaggi 1.1, 1.2)</td></tr><tr><td>Proteoso peptone</td><td>Fisher</td><td>DF0120-17-6</td><td>Utilizzare per preparare terreni HL-5 (passaggio 1.1)</td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Fisher</td><td>50-550-445</td><td>Utilizzare per preparare terreni HL-5 e piastre SM (passaggi 1.1, 1.2)</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 7H2O</td><td>Fisher</td><td>S373-500</td><td>Utilizzare per preparare terreni HL-5 e tampone fosfato 10X (passaggi 1.1, 1.3)</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>P386-500</td><td>Utilizzare per preparare terreni HL-5, piastre SM e tampone fosfato 10X (passaggi 1.1-1.3)</td></tr><tr><td>Streptomicina (diidrostreptomicina solfato)</td><td>Fisher</td><td>ICN10040525</td><td>Utilizzare per preparare terreni HL-5 (passaggio 1.1)</td></tr><tr><td>Peptone (Bacto)</td><td>Fisher</td><td>DF0118-17-0</td><td>Utilizzare per preparare piastre SM (passaggio 1.2)</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher</td><td>P288-100</td><td>Utilizzare per preparare piastre SM (passaggio 1.2)</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td>Utilizzare per preparare piastre SM (passaggio 1.2)</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher</td><td>M65-500</td><td>Utilizzare per preparare DB Buffer (passaggio 1.4)</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Utilizzare per preparare DB Buffer (passaggio 1.4)</td></tr><tr><td>Caffeina</td><td>Fisher</td><td>O1728-500</td><td>Utilizzare per preparare caffeina (passaggio 1.5)</td></tr><tr><td>cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosina 3 ft.,5 ft.-monofosfato ciclico, sale di sodio)</td><td>Fisher</td><td>11-680-1100MG</td><td>Utilizzare per preparare cAMP (passaggio 1.6)</td></tr><tr><td>Acido folico</td><td>Sigma</td><td>F7876</td><td>Utilizzare per preparare il folico acido (fase 1.7)</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td>Utilizzare per preparare un tampone campione 3X (fase 1.8)</td></tr><tr><td>Dodecil solfato di sodio (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166-500</td><td>Utilizzare per preparare un tampone campione 3X (passaggio 1.8)</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Fisher</td><td>G33-500</td><td>Utilizzare per preparare un tampone campione 3X (passaggio 1.8)</td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610610</td><td>Utilizzare per preparare un tampone campione 3X (passaggio 1.8)</td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Bio-Rad</td><td>1610404</td><td>Utilizzare per preparare un tampone campione 3X (fase 1.8)</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fisher</td><td>S299-100</td><td>Utilizzare per preparare una tampone per campioni con inibitori della proteasi e della fosfatasi (fase 1.8)</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Fisher</td><td>50-994-911</td><td>Utilizzare per preparare una tampone per campioni con inibitori della proteasi e della fosfatasi (fase 1.8)</td></tr><tr><td>Pirofosfato di sodio decaidrato</td><td>Fisher</td><td>S390-500</td><td>Utilizzare per preparare il tampone del campione con inibitori della proteasi e della fosfatasi (passaggio 1.8)</td></tr><tr><td>Cocktail completo di inibitori della proteasi senza EDTA (Roche)</td><td>Sigma</td><td>11873580001</td><td>Utilizzare per preparare il tampone del campione con inibitori della proteasi e della fosfatasi (passaggio 1.8)</td></tr><tr><td>Latrunculina A</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T119-0100</td><td>Utilizzare per preparare la latruncolina A (passaggio 1.9)</td></tr><tr><td>4-15% Tris-HCl poliacrilammide</td> gel <td>Bio-Rad</td><td>3450029</td><td>Utilizzare per l'immunoblotting (fase 3.3)</td></tr><tr><td>Membrana in fluoruro di polivinilidene</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td>Utilizzare per l'immunoblotting (fase 3.3)</td></tr><tr><td>Fosfo-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Anticorpo di coniglio</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>2060</td><td>Anticorpo primario per l'uso nell'immunoblotting (fase 3.3)</td></tr><tr><td>Fosfo-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) ( D13.14.4E) Anticorpo XP</td><td>Cell Signaling</td><td>4370</td><td>Anticorpo primario per l'uso nell'immunoblotting (passaggio 3.3)</td></tr><tr><td>Coniglio IgG HRP Linked Whole Ab (da Donkey)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-100UL</td><td>Anticorpo secondario per l'uso nell'immunoblotting (passaggio 3.3)</td></tr><tr><td>Substrato di chemiluminescenza potenziato (Clarity Western ECL Substrate)</td><td>Bio-Rad</td> 1705060 <td>Utilizzare per l'immunoblotting (passaggio 3.3)</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di strippaggio (Restore Plus Western blot stripping buffer)</td><td>Pierce</td><td>PI46430</td><td>Utilizzare per l'immunoblotting (passaggio 3.3)</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue</td><td>Fisher</td><td>PI20278</td><td>Utilizzare per l'immunoblotting (passaggio 3.3)</td></tr><tr><td>Ceppo K. aerogenes (non patogeno)</td><td>Dicty Stock Center (dictybase.org)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Materiali e attrezzature</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale (modello G-33 o un'alternativa comparabile)</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Utilizzare per coltivare K. aerogenes (passaggio 2.1.1) e per basare e stimolare le cellule D. discoideum (passaggio 3). Il raggio di rotazione di questo agitatore è di 9,5 mm.</td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 10 cm</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>Utilizzare per preparare piastre SM (passaggio 1.2)</td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Fisher</td><td>02-671-51B</td><td>Utilizzare per contare le cellule D. discoideum (passaggio 2.1.2)Piastra</td></tr> <tr>da <td>35 mm (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish)</td><td>Fisher</td><td>08-772A</td><td>Utilizzare per piastrareD. discoideumcell per la stimolazione meccanica seguita da lisi cellulare (passaggio 3.1.1)</td></tr><tr><td>Coppetta in polistirene (5 mL)</td><td>VWR</td><td>13915-985</td><td>Utilizzare per stimolare la sospensione cellulare D. discoideum con un chemioattrattivo (passaggio 3.2.2)</td></tr><tr><td>Unità fluidica con pompa (ibidi Pump System)</td><td>Ibidi</td><td>10902</td><td>Utilizzare per erogare la stimolazione meccanica alle cellule D. discoideum in un canale (passaggi 4.1, 4.2 e 5)</td></tr><tr><td>Vetrino con un canale (&mu;-Slide III 3in1 ibiTreat: vetrino coprioggetti in polimero #1.5, coltura tissutale trattata, sterilizzato)</td><td>Ibidi</td><td>80316</td><td>Utilizzare per piastre D. discoideum cellule per la stimolazione meccanica erogata da un dispositivo fluidico (passaggi 4.1, 4.2 e 5)</td></tr><tr><td>Serbatoi da 50 mL (supporto del serbatoio Ibidi per unità fluidica)</td><td>Ibidi</td><td>10978</td><td>Utilizzare per configurare il dispositivo fluidico per erogare la stimolazione meccanica alle cellule D. discoideum in un canale (passaggi 4.1, 4.2 e 5)</td></tr><tr><td>Linee per l'unità fluidica (Set di perfusione GIALLO e VERDE)</td><td>Ibidi</td><td>10964</td><td>Utilizzare per configurare il dispositivo fluidico per erogare la stimolazione meccanica alle cellule D. discoideum in un canale (passaggi 4.1, 4.2 e 5). Nota: le due linee possono essere tagliate anche dal tubo da 1,6 mm (numero di catalogo 10842).</td></tr><tr><td>Linea per lo scarico (tubo con diametro interno di 1,6 mm)</td><td>Ibidi</td><td>10842</td><td>Utilizzare per configurare il dispositivo fluidico per l'erogazione della stimolazione meccanica alle cellule D. discoideum in un canale (passaggi 4.1, 4.2 e 5).</td></tr><tr><td>Microscopio invertito Zeiss Observer.Z1 dotato di un obiettivo ad olio 40X/1.3 e di un obiettivo ad aria 20X/0.3 (o un'alternativa comparabile)</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Utilizzato per l'imaging di cellule D. discoideum con illuminazione a contrasto di fase o a fluorescenza (passaggi 4 e 5)</td></tr><tr><td>Microscopio confocale a disco rotante UltraView dotato di un sensore a 40&/1.25... Obiettivo dell'olio 0,75 (o un'alternativa comparabile)</td><td>Perkin-Elmer</td><td>DM 16000</td><td>Un'alternativa utilizzata per l'imaging di cellule D. discoideum (passaggio 4.1.4)</td></tr><tr><td>Microiniettore FemtoJet (Eppendorf; modello 5247 o un'alternativa comparabile) con Eppendorf InjectMan</td><td>Eppendorf</td><td>5252000021D e 5192000027</td><td>Utilizzare per erogare la stimolazione meccanica alle cellule D. discoideum mediante una micropipetta (passaggio 4.3). Nota: i numeri di catalogo si riferiscono alla versione più recente dell'apparecchiatura (4i).</td></tr><tr><td>Micropipetta (Femtotip; 1 &mu; m diametro esterno, 0,5 &mu; m diametro interno )</td><td>Eppendorf</td><td>930000035</td><td>Utilizzare per erogare la stimolazione meccanica alle cellule D. discoideum mediante una micropipetta (passaggio 4.3)</td></tr><tr><td>Puntali per microloader (Eppendorf Femtotips Microloader Tips per microiniettore Femtojet)</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>Utilizzare per riempire la micropipetta (femtopunta) con tampone (passaggio 4.3.1)</td></tr><tr><td>Camera a 1 pozzetto (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)</td><td>Fisher</td><td>12-565-472</td><td>Utilizzare per la piastra di cellule D. discoideum per la stimolazione meccanica erogata da una micropipetta (passaggio 4.3.2)</td></tr><tr><td>Camera a 8 pozzetti (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass)</td><td>Fisher</td><td>12-565-338</td><td>Utilizzare per la piastra di cellule D. discoideum per stimolazione meccanica erogata mediante aggiunta di tampone di massa (passaggio 4.4.1)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi delle immagini (Fiji)</td><td>NIH</td><td>https://fiji.sc/</td> <td>Utilizzare per quantificare la risposta alla stimolazione meccanica (passaggio 4.5)</td></tr><tr><td>Software di analisi della migrazione (Tracking Tool PRO)</td><td>Gradientech</td><td>http://gradientech.se/tracking-tool-pro/</td> <td>Utilizzare per quantificare la velocità e la persistenza delle celle (passaggio 5.4)</td></tr></tbody></table>

valutazione della risposta di dictyostelium discoideum alla stimolazione meccanica acuta

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemiotassi, o la migrazione a una sfumatura di un fattore chemiotattico, è la modalità migliore capita di migrazione diretto. Gli studi utilizzando ameba sociale Dictyostelium discoideum hanno rivelato che una rete di trasduzione del segnale complesso di vie parallele amplifica la risposta di chemioattrattanti e conduce alla polimerizzazione dell'actina prevenuto e sporgenza di un pseudopodo nella direzione di una sfumatura. Al contrario, i meccanismi molecolari guida altri tipi di migrazione diretto, ad esempio, a causa di esposizione a taglio di flusso o campi elettrici, non sono noti. Molti regolatori di chemiotassi esibiscono localizzazione presso il bordo iniziale o in ritardo di una migrazione delle cellule, come pure mostrano cambiamenti transitori in localizzazione o attivazione dopo stimolazione globale con un fattore chemiotattico. Per comprendere i meccanismi molecolari di altri tipi di migrazione diretto abbiamo sviluppato un metodo che consente l'esame della risposta cellulare alla stimolazione meccanica acuta basata sull'esposizione breve (2-5 s) per la tosatura del flusso. Questa stimolazione può essere trasportata in un canale mentre le cellule che esprimono con etichetta fluorescente biosensori per esaminare il comportamento delle singole celle di imaging. Inoltre, la popolazione delle cellule può essere stimolata in un piatto, lisate e immunoblotted usando gli anticorpi che riconoscono le versioni attive di proteine di interesse. Combinando entrambi i test, si può esaminare una vasta gamma di molecole attivate dai cambiamenti nella localizzazione subcellulare e/o fosforilazione. Utilizzando questo metodo abbiamo determinato che acuta stimolazione meccanica innesca l'attivazione delle reti di citoscheletro l'actina e la trasduzione del segnale chemiotattico. La capacità di esaminare le risposte cellulari agli stimoli meccanici acuta è importante per comprendere l'origine eventi necessari per motilità indotta da flusso di shear. Questo approccio fornisce anche uno strumento per lo studio della rete di trasduzione del segnale chemiotattico senza l'influenza di confusione del recettore chemoattractant.

Risposta temporale dei regolatori di chemiotassi alla stimolazione meccanica acuta
Per valutare la risposta delle cellule di d. discoideum a stimolo meccanico, le cellule aderenti di aggregazione-competenti sono stati esposti a un breve impulso di flusso di shear. Aggregazione-competenti D. discoideum cellule secernono cAMP, che può essere percepita dai cellule vicine. Per superare il contributo di segnalazione de...

Qui descriviamo i metodi per la valutazione della risposta cellulare alla stimolazione meccanica acuta. Nell'analisi della base di microscopia, esaminiamo la localizzazione di biosensori fluorescente etichettati dopo breve stimolazione con flusso di shear. Ci prova anche l'attivazione di varie proteine di interesse in risposta alla stimolazione meccanica acuta biochimicamente.

Valutazione della risposta di Dictyostelium discoideum alla stimolazione meccanica acuta

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di esaminare l'attività di vari componenti della rete di trasduzione del segnale intracellulare a seguito di brevi perturbazioni meccaniche. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della migrazione cellulare, come ad esempio il modo in cui le cellule percepiscono e migrano direzionalmente verso diversi segnali ambientali, inclusi gli stimoli meccanici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'esame della risposta iniziale allo stimolo meccanico senza il contributo confondente della motilità o della polarità alla risposta.Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo testato la risposta delle cellule aderenti al chemioattrattivo che è stato somministrato con una leggera agitazione e abbiamo notato una robusta risposta delle cellule stimolate con il controllo del veicolo. Per iniziare, preparare Klebsiella aerogenes inoculando un piccolo numero di cellule da stock congelati in terreno HL5 senza antibiotici e incubare la coltura durante la notte. La crescita di Dictyostelium in presenza di batteri Klebsiella aerogenes ridurrà il numero di macropinosomi che migliorera

assessment-dictyostelium-discoideum-response-to-acute-mechanical

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Applicazione di elettrofisiologia di sinapsi accessibile fornisce una misura quantificabile di attività sinaptica, utile per analizzare mutanti sinaptica. Questo articolo descrive un metodo di dissezione utilizzati per esporre le giunzioni neuromuscolari (NMJ)...

Dissezione e registrazione dal bivio C. Elegans neuromuscolare

Questo lavoro si propone di istruire il lettore al funzionamento di un sistema integrato di forza atomica-microscopio ottico di imaging per la stimolazione meccanica delle cellule vive nella cultura. Un passo-passo il protocollo viene presentato. Un insieme rappresentativo di dati che mostra dal vivo risposta alla stimolazione meccanica delle cellule è presentato.

Risposta cellulare allo stimolo meccanico vivere Studiato da Integrated ottica e microscopia a forza atomica

L'infezione della prostata può essere un fattore che contribuisce a mediare dolore pelvico in prostatite cronica. Descriviamo la procedura per la preparazione di standard inoculo batterico, l'instillazione di batteri nell'uretra di topi maschi e la metodologia per la misurazione allodinia tattile nei topi nel corso del tempo.

Misurazione della tattile Allodinia in un modello murino di prostatite batterica

Un protocollo è descritto che utilizza anossia / fame in C. elegans per modellare ischemia / riperfusione. Risultati funzionali comprendono un aumento della mortalità, anomalie visibili in processi neuronali GFP-etichettata, e le risposte deteriorate comportamentali che richiedono la funzione neuronale.

Un modello di anossia-fame per ischemia / riperfusione in<em&gt; C. elegans</em

Questo video dimostra un protocollo per condurre registrazioni elettrofisiologiche a fibra singola su un preparato di nervo colorettato di topo in vitro.

In vitro Caratterizzazione funzionale del topo colorettale Afferent Endings

L'uso di un "chip olfattivo" adattato per l'imaging del calcio efficiente dei maschi di c. elegans è descritto qui. Sono indicati anche gli studi di esposizione maschio a glicerolo e ad un feromone.

Tramite un Chip olfattiva di microfluidica adattato per l'Imaging dell'attività neuronale in risposta ai feromoni in neuroni di testa maschio C. Elegans

Anormale funzione sensoriale è alla base di dolore viscerale e altri sintomi delle malattie intestinali infiammatorie e funzionali. Un protocollo per la registrazione elettrofisiologica dei nervi afferenti colici in una preparazione di colorectum del ratto ex vivo è presentato qui.

In Vitro Caratterizzazione delle proprietà elettrofisiologiche di fibre afferenti coliche in ratti

Nuovi strumenti per la ricerca di mechanobiology sono necessari per capire lo stress come meccanico attiva vie biochimiche e suscita risposte biologiche. Qui, presenteremo un nuovo metodo per stimolazione meccanica selettiva degli animali immobilizzati con una trappola di microfluidica permettendo di imaging ad alta risoluzione delle risposte cellulari.

Utilizzando un dispositivo di microfluidica per stimolazione meccanica e alta risoluzione Imaging di c. elegans

Abbiamo sviluppato un test multi-pozzetto formato poliacrilammide per sondare l'effetto di rigidità di matrice extracellulare sull'infezione batterica delle cellule aderenti. Questo test è compatibile con citometria a flusso, immunostaining e microscopia di forza di trazione, permettendo per la misurazione quantitativa delle interazioni biomeccaniche tra cellule, loro matrice extracellulare e batteri patogeni.

Un'analisi di poliacrilammide-basata di formato multi-pozzetto per studiare l'effetto della matrice extracellulare rigidità sull'infezione batterica delle cellule aderenti

Le forze meccaniche sono importanti per controllare la migrazione cellulare. Questo protocollo dimostra l'uso di idrogel elastici che possono essere deformati utilizzando una micropipetta di vetro e un micromanipolatore per stimolare le cellule con un gradiente di rigidità locale per suscitare cambiamenti nella struttura cellulare e nella migrazione.

Analisi A singola cella Durotaxis per valutare il controllo meccanico del movimento cellulare e gli eventi di segnalazione correlati

L'obiettivo di questo protocollo è mostrare come eseguire un saggio migliorato per la nocicezione meccanica nelle larve di Drosophila. Usiamo il saggio qui per dimostrare che l'ipersensibilità meccanica (allodinia e iperalgesia) esiste nelle larve di Drosophila.

Un saggio e strumenti migliorati per misurare la nocicezione meccanica nelle larve di Drosophila

Scopri come valutare la risposta cellulare alla stimolazione meccanica acuta in Dictyostelium discoideum. Questo metodo microscopico isola la risposta iniziale senza interferenze di motilità, analizzando la localizzazione di biosensori fluorescenti.

Valutazione della risposta di Dictyostelium discoideum alla stimolazione meccanica acuta

Esplora altri video